环境胁迫效应启动子的制作方法

专利名称：环境胁迫效应启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种环境胁迫反应启动子。
EST(已表达序列标记)方案也对发现表达基因有很大贡献(Hofte，H.等，(1993)植物杂志4，1051-1061；Newman，T.等，(1994)植物生理106，1241-1255；Cooke，R.等(1996)植物杂志9，101-124，Asamizu，E.等，(2000)DNA研究7，175-180)。例如，dbEST(国家生物技术情报中心(NCBI)的EST数据库)包括了部分cDNA序列，其中描述了超过一半(大约28,000个基因)的所有基因补体(这是从完整测序的拟南芥染色体2所含基因估计的(Lin，X.等，(1999)自然402，761-768))。
近年来，微阵列(DNA芯片)技术已经成为一种分析基因组规模的基因表达的有用工具(Schena，M.等，(1995)科学270，467-470；Eisen，M.B.和Brown，P.O.(1999)酶学方法303，179-205)。在这种基于DNA芯片的技术中，将cDNA序列以大于1,000个基因/cm2的密度排列在一个载玻片上。为了直接和大规模地比较分析基因表达，同时将如此排列的cDNA序列与双色荧光标记的不同细胞或组织型的RNA样品的DNA探针对杂交。首先通过分析根和芽中的不同表达的48个拟南芥属基因，证明此技术(Schena，M.等，(1995)科学270，467-470)。另外，微阵列用于研究随机选自于人cDNA文库的1,000个克隆，此文库用于鉴定胁迫于热休克和蛋白激酶C活化的新基因(Schena，M.等，(1996)美国国家科学院院刊93，10614-10619)。
在另一项研究中，在各种诱导条件下通过此基于DNA芯片的方法，对与炎症疾病相关的基因的表达分布进行分析(Heller，R.A.等，(1997)美国国家科学院院刊94，2150-2155)。而且，通过使用微阵列也已经分析了大于6,000个编码序列的酵母基因组的动态表达(DeRisi，J.L.等，(1997)科学278，680-686；Wodicka，L.等，(1997)自然生物技术15，1359-1367)。
但是，在植物科学中，关于微阵列的分析仅有少量报告出版(Schena，M.等，(1995)科学270，467-470；Ruan，Y.等(1998)植物杂志15，821-833；Aharoni.A.等，(2000)植物细胞12，647-661；Reymond，P.等(2000)植物细胞12，707-719)。
环境胁迫例如干旱、高盐和低温对植物生长的影响很大。在这些胁迫中，干旱或水缺乏是对植物生长和农作物生产最严重的限制因素。干旱胁迫诱导植物中多种生物化学和生理反应。为了在胁追条件下生存，植物必需对这些胁迫作出反应和适应。近来，在转录水平描述了对干旱作出反应的大量基因(Bohnert，H.J.等，(1995)植物细胞7，1099-1111.；Ingram，J.，和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403.；Bray，E.A.(1997)植物科学趋势2，48-54.；Sbinozaki.K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)植物生理115，327-334.；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999).“对干旱胁迫的分子反应”、“高等植物对冷、干旱、热和盐胁迫的分子反应”由Shinozaki.，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.R.G.Landes公司；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shiozaki，K.编辑(2000)植物生理现代观点3，217-223)。
通过基因转移，胁迫可诱导的基因已经用于提高植物的胁迫耐受性(Holmberg，N.，和Bulow，L.(1998)植物科学趋势3，61-66.；Bajaj.S.等(1999)分子育种5，493-503)。分析胁迫可诱导基因不仅对于理解高等植物胁迫耐受性和反应的分子机理是重要的，而且对于通过基因处理提高农作物的胁迫耐受性也是重要的。
DRE/CRT(脱水反应元件/C-重复序列)已经被确定作为一种以不依赖ABA的方式在干旱、高盐和冷胁迫反应基因表达中的重要顺式作用元件(ABA是指脱落酸，它是一种植物激素并且充当一种种子休眠和环境胁迫的信号传递因子)(Yamaguchi-Shinozaki，K.，和Shiozaki，K.(1994)植物细胞6，251-264.；Thomashow，M.F.等，(1999)植物分子生物，50，571-599.；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)植物生理的现代观点3，217-223)。涉及DRE/CRT-反应基因表达的转录因子(DREB/CBF)已经被克隆(Stockinger.E.J.等，(1997)美国国家科学院院刊94，1035-1040.；Liu，Q，等，(1998)植物细胞10，1391-1406.；Shiwari，Z.K.等，(1998)生物化学与生物物理研究通讯250，161-170.；Gilmour，S.J.等，(1998)植物杂志16，433-443)。DREB1/CBFs被认为在冷反应基因表达中起作用，而DREB2s涉及干旱反应基因表达。在转基因的拟南芥属植物中观察到对严寒胁迫的强耐受性，此植物在一种花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S启动子控制下，超量表达CBF1(DREB1B)cDNA(Jaglo-Ottosen，K.R.等，(1998)科学280，104-106)。
本发明人曾报道在转基因植物中，在一种CaMV35S启动子或一种胁迫诱导的rd29A启动子的控制下，DREB1A(CBF3)cDNA分子的超量表达，提高了胁迫诱导的DREB1A靶基因的强组成型表达并且提高了对严寒、干旱和盐胁迫的耐受性(Liu，Q.等，(1998)植物细胞10，1391-1406.；Kasuga，M.等，(1999)自然生物技术，17，287-291)。而且，本发明人也已经鉴定了六种DREB1A靶基因例如rd29A/lti78/cor78，kin1，kin 2/cor6.6，cor15a，rd17/cor47和erd10(Kasuga，M.等，(1999)自然生物技术17，287-291)。但是，它没有充分阐明DREB1A cDNA分子在转基因植物中的超量表达如何提高了对严寒、干旱和盐的胁迫耐受性。为了研究干旱和严寒耐受性的分子机理，尽可能多地鉴定和分析由DREB1A控制的基因是重要的。
通过直接对上述对象的广泛研究，本发明人已经成功地鉴定了一种新的DREB1A靶基因并且通过使用cDNA微阵列分析成功地分离出它的一个启动子区域，因此完成了本发明。
也就是说，本发明是一种环境胁迫反应启动子，它含有下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由选自序列号1至18的任意核苷酸序列组成的DNA；(b)由含有相对于选自序列号1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成的并具有充当环境胁迫反应启动子功能的DNA；以及(c)在严格条件下与由选自序列号1至18的任意核苷酸序列组成的DNA杂交，并且具有充当环境胁迫反应启动子功能的DNA。
环境胁迫至少选自冷胁迫、干旱胁迫、盐胁迫和高光胁迫。
而且，本发明是一种包含上述启动子的表达载体，或是一种还包含一种所需基因的表达载体。
再者，本发明是一种含有上述表达载体的转化体。
更进一步，本发明是一种含有上述表达载体的转基因植物(例如一种植物体、植物器官、植物组织或植物培养细胞)。
再者，本发明是一种生成一种抗胁迫植物的方法，它包括培养或栽培上述转基因植物。
附图2是一种显示干旱-或冷-可诱导的基因和DREB1A靶基因鉴定策略的图。
附图3是显示新DREB1A靶基因和一种DREB1A基因在cDNA微阵列和RNA印迹分析方面比较的照片。
附图4是一种显示根据RNA凝胶印迹和微阵列分析将已鉴定的干旱-或冷-可诱导的基因分为四组的结果的图。
附图5显示了冷处理时间和FL3-5A3表达率之间的关系。
附图6显示了脱水处理时间和FL3-5A3表达率之间的关系。
附图7显示了高盐处理时间和FL3-5A3表达率之间的关系。
附图8显示了冷处理时间和FL5-2H15表达率之间的关系。
附图9显示了脱水处理时间和FL5-2H15表达率之间的关系。
附


图10显示了高盐处理时间和FL5-2H15表达率之间的关系。
附
图11显示了脱水处理时间和FL5-3M24表达率之间的关系。
附
图12显示了高盐处理时间和FL5-3M24表达率之间的关系。
附
图13显示了冷处理时间和FL5-90表达率之间的关系。
附
图14显示了冷处理时间和FL5-2122表达率之间的关系。
附
图15显示了脱水处理时间和FL5-2122表达率之间的关系。
附
图16显示了高盐处理时间和FL5-2122表达率之间的关系。
附
图17显示了脱水处理时间和FL6-55表达率之间的关系。
附
图18显示了高盐处理时间和FL6-55表达率之间的关系。
附
图19显示了脱水处理时间和FL1-159表达率之间的关系。
附图20显示了脱水处理时间和FL5-2D23表达率之间的关系。
附图21显示了高盐处理时间和FL5-2D23表达率之间的关系。
附图22显示了脱水处理时间和FL05-08-P24表达率之间的关系。
附图23显示了脱水处理时间和FL05-09-G08表达率之间的关系。
附图24显示了脱水处理时间和FL05-09-P10表达率之间的关系。
附图25显示了ABA处理时间和FL05-09-P10表达率之间的关系。
附图26显示了高盐处理时间和FL05-10-N02表达率之间的关系。
附图27显示了脱水处理时间和FL05-18-I12F表达率之间的关系。
附图28显示了高盐处理时间和FL05-18-I12表达率之间的关系。
附图29显示了ABA处理时间和FL05-18-I12表达率之间的关系。
附图30显示了脱水处理时间和FL05-21-F13表达率之间的关系。
附图31显示了冷处理时间和FL05-21-F13表达率之间的关系。
附图32显示了脱水处理时间和FL06-10-C16表达率之间的关系。
附图33显示了高盐处理时间和FL06-10-C16表达率之间的关系。
附图34显示了ABA处理时间和FL06-10-C16表达率之间的关系。
附图35显示了脱水处理时间和FL06-15-P15表达率之间的关系。
附图36显示了高盐处理时间和FL06-15-P15表达率之间的关系。
附图37显示了ABA处理时间和FL06-15-P15表达率之间的关系。
附图38显示了脱水处理时间和FL08-10-F21表达率之间的关系。
附图39显示了高盐处理时间和FL09-11-P10表达率之间的关系。
使用生物素酰化的CAP捕获器(trapper)方法(Carninci.P.等(1996)Genomics，37，327-336)本发明人构建了在不同条件下拟南芥属植物例如经干旱处理和冷处理的植物等的全长cDNA文库(Seki.M.等，(1998)植物杂志15，707-720)。使用含有胁迫诱导基因的大约1,300全长cDNA分子和含有胁迫诱导基因的大约7,000全长cDNA分子，本发明人对每种情况制备了一种拟南芥属全长cDNA微阵列。除这些干旱-和冷-可诱导的全长cDNA分子外，本发明人还使用一种DREB1A靶基因，一种用于控制胁迫反应基因表达的转录调节基因，制备了另一种cDNA微阵列。此后，监测在干旱和冷胁迫下基因的表达方式，以详尽地分析胁迫反应的基因。作为结果，从含有大约1,300个全长cDNA分子的全长cDNA微阵列中分离出新的环境胁迫反应基因，即44个干旱诱导基因和19个冷诱导基因。44个干旱诱导基因中的30个基因和19个冷诱导基因中的10个基因，是新的胁迫诱导基因。而且，发现12个胁迫诱导的基因是DREB1A靶基因，这些12个中的6个是新基因。再者，作为此分析结果，从含有大约7,000全长cDNA分子的cDNA微阵列中，分离出301个干旱诱导基因、54个冷诱导基因和211个高盐诱导基因。
此后，从这些环境胁迫反应基因中成功地分离出启动子区域。
如上所述，一种全长cDNA微阵列是分析拟南芥干旱和冷胁迫诱导基因的表达方式和分析与胁迫相关的转录调节基因的靶基因的有用工具。1.分离启动子本发明的启动子是一种存在于基因上游的顺式元件，该基因编码一种由环境胁迫例如冷、干旱和高盐胁迫表达的胁迫反应蛋白质，而且此顺式元件具有结合一种转录因子以激活存在于下游基因转录的功能。这样的顺式元件的实例包括一种干旱胁迫反应元件(DRE；脱水反应元件)、一种脱落酸反应元件(ABRE)，和一种冷胁迫反应元件等。编码结合这些元件的蛋白质的基因实例包括DRE结合蛋白1A基因(也称作DREB1A基因)、DRE结合蛋白1C基因(也称作DREB1C基因)、DRE结合蛋白2A基因(也称作DREB2A基因)和DRE结合蛋白2B基因(也称作DREB2B基因)等。
为了分离本发明的启动子，首先，使用一种微阵列分离出胁迫反应基因。为制备一种微阵列，总共可以使用大约1,300cDNA分子，是从拟南芥属全长cDNA文库中分离出的基因、RD(对脱水发生反应的)基因、ERD(对脱水发生早期反应的)基因、kin1基因、kin2基因，cor15a基因、作为内部标准的α-微管蛋白基因，以及作为阴性对照的小鼠乙酰胆碱烟碱受体的ε亚单位(nAChRE)基因和小鼠糖皮质激素受体的同源基因。
作为一种用于分离本发明启动子的微阵列，可以使用总共大约7,000cDNA分子，是从拟南芥属全长cDNA文库中分离出的基因、RD(对脱水发生反应的)基因、ERD(对脱水发生早期反应的)基因和从λ控制模板DNA片段(TX803，TakaraShuzo)中获得的作为内部标准的PCR扩增片段，以及作为阴性对照的小鼠乙酰胆碱烟碱受体的ε亚单位(nAChRE)基因和小鼠糖皮质激素受体的同源基因。
用一种DNA测序仪(ABI PRISM 3700，PE Applied Biosystems.CA，USA)通过序列分析对一种用质粒制备装置(Kurabo)提取的质粒DNA进行测序。根据GenBank/EMBL数据库，用BLAST程序对所获得序列进行同源检测。
聚腺苷酸选择后，进行逆转录以合成双链的DNA分子，并将一个cDNA分子插入一个载体中。
插入一种用于制备cDNA文库的载体中的cDNA分子，使用在cDNA分子的两边与载体的序列互补的引物，通过PCR扩增。这样的载体的实例包括λZAPII和λPS等。
按照通常的方法，并且此方法没有特殊的限制，可以制备一种微阵列，例如，使用一种基因吸头微阵列压印机器，GTMASS SYSTEM(日本激光和电子实验室)，从一个微量滴定板上加载上述所得的PCR产物，并以规定的间隔，点滴在一个微载玻片上。然后，为了防止非特异信号的表达，将此玻片浸入一种封闭溶液。
植物原料的实例包括通过破坏特异性基因所获得的植株和野生型植物，并且可以使用一种其中导入DREB1A的cDNA转基因植物。植物品种的实例包括拟南芥、烟草和水稻等，而且优选拟南芥。
可以按照一种已知方法(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)植物细胞6，251-264)，进行干旱-和冷-胁迫处理。
完成胁迫处理后，将植物体(野生型植物和DREB1A过量表达转化体)作为样品，并用液氮将其进行深低温保藏。野生型植物和DREB1A过量表达的转化体用于一个实验以鉴定DREB1A靶基因。按照一种已知方法或使用一种试剂盒，将mRNA从植物体中分离出并进行纯化。
在用于标记的Cy3dUTP或Cy5dUTP(Amersham Phar macia)存在下，对每一种mRNA样品进行逆转录，然后用于杂交。
杂交后，用一种扫描激光显微镜对此微阵列进行扫描。作为一种分析微阵列数据的程序，可以使用Imagene Ver 2.0(BioDiscovery)和QuantArray(GSI Lumonies)等。
扫描后，通过制备一种含有此基因的质粒，将有关基因分离出。
通过分析上述分离出的基因的核苷酸序列，然后使用一种基于基因组情报数据库(GenBank/EMBL，ABRC)的基因分析程序，进行启动子区域的检测。将分离出的基因分为对干旱和冷胁迫均具有诱导率的一种，对干旱胁迫特异性诱导率的一种，和对冷胁迫特异性诱导率的一种(附图4)。按照一种基因分析程序，从上述基因中鉴定出18种基因(FL3-5A3，FL5-2H15，FL5-3M24，FL5-90，FL5-2I22，FL6-55，FL1-159，FL5-2D23，FL05-08P-24，FL05-09-G08，FL05-09-P10，FL05-10-N02，FL05-18-I12，FL05-21-F13，FL06-10-C16，FL06-15-P15，FL08-10-E21和FL09-11-P10)。这些基因的启动子区域分别显示于序列号1至18中。
只要本发明的启动子充当一种环境胁迫反应启动子，它可以是一种具有如此核苷酸序列的启动子，此核苷酸序列包括相对于选自序列号1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一个或多个核苷酸，优选一个或几个核苷酸(例如1至10个核苷酸，优选1至5个核苷酸)的核苷酸序列。而且，本发明的启动子还包括在严格条件下与含有任意选自序列号1至18的核苷酸序列的DNA杂交并进一步充当一种环境胁迫反应启动子的DNA。
一旦确定了本发明的启动子的核苷酸序列，就可以通过化学合成、使用一种克隆的探针作为模板的PCR、或杂交，用作探针，具有核苷酸序列的DNA片段，获得启动子本身。而且，具有与未突变的启动子具有相等功能的本发明启动子的突变体，也可以通过定点诱变等合成。
为了将突变导入启动子序列，可以使用已知方法例如Kunkel方法和Gapped双链体方法，或一种等效方法。例如使用一种用于导入突变的试剂盒(例如Mutant-K(Takara)和Mutant-G(Takara))，通过定点诱变完成突变的导入，或使用LA PCR体外诱变系列试剂盒(Takara)完成突变的导入。
此处使用的“作为一种环境胁迫反应启动子功能”一词，其含义是当启动子暴露于特殊环境胁迫条件下时，结合RNA聚合酶至一种启动子使之引发转录的功能。
“环境胁迫”一词通常用于指一种非生物的胁迫例如干旱胁迫、冷胁迫、高盐胁迫和高光胁迫等。此处所用的术语“干旱”是指一种水缺乏的状态，此处所用的“冷”一词是指被暴露于低于每种生物品种最适宜的生存温度下的状态，(例如拟南芥，连续暴露于-20至+21℃下1小时至几周)。此处所用的“高盐”一词是指在用浓度为50mM至600mM的NaCl连续处理0.5小时至几周后的状态。此处所用的“高光胁迫”一词是指将大于其光合能力的强光用于一种植物的状态，例如使用了大于5,000至10,000 lx的强光。关于这些环境胁迫，可以接受一种胁迫或几种胁迫。
本发明的植物启动子包括一种启动子，它在序列号1至18的任意核苷酸序列的3′-末端增加了一个提高其翻译效力的核苷酸序列，或一种在其5′-末端缺失的同时保留了启动子活性的启动子。
而且，本发明的启动子包括在严格条件下与由任何选自序列号1至18的核苷酸序列组成的DNA杂交并具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA。此处所用的“严格条件”一词是指钠的浓度为25至500mM，优选25至300mM，并且温度为42℃至68℃，优选42℃至65℃。特别优选的条件是5×SSC(83mMNaCl，83mM柠檬酸钠)，并且温度为42℃。2.表达载体的构建本发明的表达载体可以通过将本发明的启动子连接(插入)至一种适宜的载体获得。只要本发明的启动子插入其中的载体能够在宿主中复制，不需要特别的限制，载体的实例包括一种质粒、一种穿梭载体和一种辅助质粒等。
质粒DNA的实例包括来源于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19和pBluescript等)的质粒，以及来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)(例如pUB110和pTP5等)的质粒，以及来源于酵母(例如YEp13和YCp50等)的质粒，而且噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(例如Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBLA、λgt10、λgt11和λZAP等)。再者，动物病毒载体例如逆转录病毒和痘苗病毒，以及昆虫病毒载体例如杆状病毒也可以使用。
为了将本发明的启动子插入一种载体中，使用一种方法，其中首先，用适宜的限制酶将纯化的DNA裂解，然后，将所获得的DNA片段插入适宜载体DNA的限制酶位点或一个多克隆位点以连接于载体上。
在本发明中，为了表达一种所需基因，可以将所需基因进一步插入上述表达载体中。涉及插入所需基因的技术与涉及将启动子插入载体的方法相同。对所需基因没有特别限制，基因的实例包括显示于表2中的基因和不同于那些的已知基因等。
在本发明的启动子与一种连接于其3′-末端的报道基因(例如广泛用于植物科学的GUS基因)一同使用的情况下，通过检测GUS的活性可以容易地确定此启动子的强度。作为一种报道基因，不仅可以使用一种GUS基因，而且还可以使用荧光素酶和一种绿色荧光蛋白质。
因此，在本发明中可以使用各种类型的载体。而且，可以通过将一种有关的所需基因以有义或反义的方向连接于本发明的启动子来制备一种产物，并然后将这样的产物插入一个被称作二分载体的载体，例如pBI1O1(Clonetech)中。3.转化体的制备通过将本发明的表达载体导入一个宿主中而获得本发明的转化体。此处的宿主没有特殊的限制，只要它可以表达有关的启动子或基因，优选一种植物。在宿主是一种植物的情况下，一种转化体植物(一种转基因植物)可以如下制备。
在本发明中转化的植物是指任何整株植物、植物器官(例如叶子、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、脉管素等)以及植物细胞。用于转化的植物的实例包括属于芸苔科、禾本科、茄科和豆科等(参照下面)的植物，但不限制于此。芸苔科拟南芥(Arabidopsis thaliana)茄科烟草(Nicotiana tabacum)禾本科玉蜀黍(Zea mays)、稻(Oryza sativa)豆科大豆(Glycine max)可以用常用转化方法例如电穿孔、土壤杆菌属方法、颗粒枪方法、PEG等，将上述重组载体导入一种植物中。
例如，在使用电穿孔的情况下，使用一种装有一种脉冲控制器的电穿孔装置，在500至1,600V电压，25至1,000μF和20至30毫秒的条件下，处理一种载体，并将一种基因导入一种宿主中。
在使用颗粒枪的情况下，在制备一切片后，可以使用一种植物体、植物器官或植物组织，或者制备一种原生质体。可以用一种基因导入装置(例如PDS-1OOO/He，Bio-Rad.等)，处理如此制备的样品。处理的条件随植物或样品变化，但是一般所用的处理条件是压力为大约1,000至1,800psi，距离为5至6cm。
通过使用一种植物病毒作为载体，可以将有关基因导入一种植物中。可得到的植物病毒的实例包括花椰菜花叶病病毒。那就是，首先，将病毒基因组插入来源于大肠埃希氏杆菌的载体中以制备一种重组体。然后，将此有关基因插入病毒基因组中。用限制酶将如此修饰的病毒基因组从重组体中切下，并接种至一种植物宿主中，以便将有关基因导入其中。
当属于土壤杆菌属的细菌转染入一种植物中时，细菌将其质粒DNA的一部分导入植物基因组中。在涉及使用土壤杆菌属的Ti质粒的方法中，利用如此的特征，将一种有关基因导入一种植物宿主中。在属于土壤杆菌属、根癌土壤杆菌(Agrolacterium tumefacieas)的细菌中，转染至一种植物，并在那里形成一种被称作冠瘿的肿瘤，而发根病土壤杆菌(Agrobactorium rhizogenes)转染至一种植物以形成毛根。这些现象源自一种原因，由此，将一存在于每种细菌中的定位于一种被称作Ti质粒或Ri质粒的质粒上的称作T-DNA区域的区域(一种转移DNA区域)，转移至一种植物中，并在转染的时候插入至植物基因组中。
当土壤杆菌被转染入一种植物宿主时，通过将欲结合入一种植物基因组的DNA插入Ti或Ri质粒的T-DNA区域，能把有关DNA结合入一种植物基因组中。
作为转化结果所获得的肿瘤组织、芽和毛根可以直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，并且按照以前的已知植物组织培养方法，可以通过给予一种适宜浓度的植物激素(例如茁长素、细胞激动素、赤霉素、脱落酸、乙烯、brassinoride等)，使一种植物体发生再生。
本发明的载体不仅能被导入上述植物宿主中，而且能被导入属于埃希氏杆菌属例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和假单孢菌属例如恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)的细菌；酵母例如啤酒糖酵母(Saccharomgces cerevisiae)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；动物细胞例如COS细胞和CHO细胞；以及昆虫细胞例如Sf9细胞中，以便获得一种转化体。在一种细菌例如大肠埃希氏杆菌或酵母用作宿主的情况下，优选本发明的重组载体在细菌中能够自我复制，并且在同时，还由本发明的启动子、一种核糖体结合序列、一种有关基因和转录终止序列组成。而且，它还可以含有用于控制一种启动子的基因。
用于将一种重组载体导入细菌中的方法，只要是一种将DNA导入细菌的方法，没有特殊的限制。例如，可以使用一种涉及使用钙离子的方法和电穿孔方法。
在酵母用作宿主的情况下，可以使用啤酒糖酵母和粟酒裂殖糖酵母等。将一种重组载体导入酵母的方法没有特殊限制，只要是一种将DNA导入酵母的方法，这样方法的实例包括电穿孔、原生质球方法、磷酸锂方法等。
在动物细胞用作宿主的情况下，可以使用猴COS-7细胞、非州绿猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞等。将重组载体导入一种动物细胞的方法的实例包括电穿孔、磷酸钙方法、脂转染方法等。
在昆虫细胞用作宿主的情况下，可以使用Sf9细胞及其类似细胞。将重组载体导入一种昆虫细胞的方法的实例包括磷酸钙方法、脂转染方法、电穿孔等。
关于确认一个基因是否被插入宿主中，可以通过例如PCR、Southern杂交、Northern杂交等方法完成。例如，从一种转化体中制备DNA，并设计与PCR一同使用的DNA特异性引物。在用于制备上述质粒的相同条件下进行PCR。然后，将所获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳或毛细管电泳，以便用溴化锂或一种SYBR Green溶液等将产物染色。通过检测作为信号带的产品，证实扩增产物被转化。或者，扩增的产物也可以通过PCR、使用被荧光染料染色的引物、或者诸如上述的方法检测。而且，还可以采用下列方法，其中扩增的产物与一种例如微量培养板的固相结合，并且通过荧光或酶反应等证实。4.植物的生成在本发明中，一种转化的植物体可以从上述转化的植物细胞等再生。一种适合的再生方法是如下方法其中转化的细胞被转移至培养基中，并在具有不同类型激素和浓度的培养基中培养以促进珠心生胚，并由此获得一整株植物体。适用的培养基的例子包括LS培养基和MS培养基等。
本发明“生产一种植物体的方法”包括如下方法将一种插有上述植物启动子的植物表达载体导入一种宿主细胞中，以获得一种转化的植物细胞；从转化的植物细胞再生转化的植物体；从所得的转化植物体获得植物种子；并从植物种子产生植物体。
例如，从一种生根的培养基中收集一种转化的植物体，并将其转移至一个有含水的土壤的盆中，以从一种转化的植物体中获得一种植物种子。然后，转化的植物体在恒温下生长形成花朵，由此最终获得种子。例如，在一种转化的植物体中所形成的种子成熟后，分离出种子并植入含有水的土壤中，然后在照明恒温下生长，以从种子生产植物体。如此育种的植物成为一种与导入启动子的胁迫反应性相对应的抗环境胁迫植物。
本发明进一步描述于下列实施例中。这些实施例并非用于限制本发明。
而且，为了制备一种微阵列，总共使用大约7,000cDNA分子，它们是从拟南芥属全长cDNA文库中分离出的基因、RD(对脱水发生反应的)基因、ERD(对脱水发生早期反应的)基因和从λ控制模板DNA片段(TX803，Takara Shuzo)中获得的作为内部标准的PCR扩增片段(下文称之为PCR片段)，以及作为阴性对照的小鼠乙酰胆碱烟碱受体的epsilon亚单位(nAChRE)基因和小鼠糖皮质激素受体的同源基因。阳性对照干旱诱导基因(对脱水的反应性基因rd，和对脱水的早期反应性基因erd)内部标准PCR片段阴性对照为了分析非特异性杂交，使用乙酰胆碱烟碱受体ε亚单位(nAChRE)基因和小鼠糖皮质激素受体的同源基因，它们基本上与拟南芥属数据库中所给出的任意序列不具有同源性。(2)拟南芥属全长cDNA微阵列根据生物素酰化的CAP捕获器(trapper)方法，本发明人已经从在不同条件下(例如在从发芽至成熟的种子的不同生长阶段，脱水处理、冷处理和未处理)的拟南芥属植物体中构建了全长cDNA文库。本发明人从全长cDNA文库中独立地分离出各大约1,300和大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子。根据已知方法(Eisen和Brown，1999)，在载玻片上排列通过PCR扩增的cDNA片段。本发明人已经制备出一种含有大约1,300个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列，和另一种含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列，它们包含下述基因。(3)使用cDNA微阵列分离干旱-、冷-和高盐-诱导基因在此实施例中，使用一种含有大约1,300个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列，分离出干旱-、冷-诱导基因。再者，使用一种含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列，分离出干旱-、冷-和高盐-诱导基因。
混合经干旱处理、冷处理和未处理的植物的Cy3和Cy5荧光标记的探针，并将所得的混合物与含有大约1,300个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列杂交。附
图1显示了cDNA微阵列的图象。通过一对cDNA探针的双标记，其中一个mRNA样品用Cy3-dUTP标记而另一个mRNA样品用Cy5-dUTP标记，使同时与在一种微阵列上的多个DNA元件杂交成为可能，并使得在两种不同条件(即胁迫和未胁迫)下直接测定基因表达水平变得容易。使用两种不同的激光隧道，对在杂交的微阵列上的每种DNA元件Cy3和Cy5的发射进行扫描。此后，测定每种DNA元件的两种荧光信号的强度率，作为一种相对值，然后，确定基因不同表达的转换，这显示为微阵列上的cDNA斑点。在此实施例中，使用作为一种内部对照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表达水平在两种不同的试验条件下基本上保持恒定。
在含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列的情况下，混合每种经脱水处理的植物、经冷处理的植物、高盐诱导基因和未经处理的植物的Cy3和Cy5荧光标记的探针，并将所获得的混合物杂交。在此cDNA微阵列中，一种PCR片段被用作内部对照基因。
附图2显示在含有大约1,300个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列中的干旱-或冷-诱导基因的鉴定方法。而且，在含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列的情况下，也可以按照附图2所示的相同方法对干旱-、冷-或高盐-诱导基因进行鉴定。1)来源于脱水或冷处理的植物中的mRNA分子和来源于未胁迫的野生型植物的mRNA分子，均用于制备Cy3和Cy5标记的cDNA探针。混合这些cDNA探针，然后与cDNA微阵列杂交。在此实施例中，使用作为一种内部对照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表达水平在两种不同的试验条件下基本上保持恒定。表达水平高于(干旱/未胁迫或冷/未胁迫的)α-微管蛋白基因的表达水平的两倍的基因，被确定作为一种干旱-或冷-诱导基因(附图2)。2)来源于一种35SDREB1A转基因植物的mRNA分子和来源于一种未胁迫的野生型植物的mRNA分子，均用于制备Cy3和Cy5标记的cDNA探针。混合这些cDNA探针，然后与cDNA微阵列杂交。在此实施例中，使用作为一种内部以照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表达水平在两种不同的试验条件下基本上保持恒定。其在35SDREB1A转基因植物中表达水平高于未胁迫野生型植物表达水平两倍的基因，被确定作为DREB1A靶基因(附图2)。
来源于一种脱水-或冷-处理的植物的mRNA分子和来源于一种未胁迫的野生型植物的mRNA分子，均用于制备Cy3和Cy5标记的cDNA探针。混合这些cDNA探针，然后与cDNA微阵列杂交。为了评价微阵列分析的再现性，相同的试验重复5次。当相同的mRNA样品与各种类型的微阵列杂交时，观察到了良好的相关性。表达水平高于(干旱/未胁迫或冷/未胁迫的)α-微管蛋白基因表达水平的两倍的基因，被确定作为一种干旱-或冷-诱导基因(附图2)。(4)序列分析为进基因序列的同源性检测，用一种质粒制备装置(NA100，Kurabo)提取一种质粒DNA，用这种质粒DNA进行序列分析。用一种DNA测序仪(ABIPRISM3700，PE Applied Biosystems，CA，USA)，通过染料终止子循环测序法测定DNA序列。基于GenBank/EMBL数据库，用BLAST程序完成序列的同源性检测。(5)cDNA的扩增将λZAPII(Caminci等，1996)用作制备cDNA文库的一种载体。应用与位于cDNA.两侧的载体序列互补的引物，通过PCR方法，扩增这种插入文库载体的cDNA。
引物的序列如下FL正向12245′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(序列号19)FL反向12335′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA(序列号20)
将一种质粒(1至2ng)加入100μl的PCR混合物(0.25mM dNTP，0.2μM PCR引物，1XExTaq缓冲液，1.25UExTaq聚合酶(Takara Shuzo))中，充当模板。在下面的条件下进行PCR在94℃进行起始反应3分钟，在95℃进行1分钟、60℃进行30秒和72℃进行3分钟的反应进行35次循环，以及在72℃进行终止反应3分钟。用乙醇将PCR产物沉淀后，将这种沉淀物溶解至25μl的3×SSC中。进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，以确认所得DNA的性质和PCR的扩增率。(6)cDNA微阵列的生产应用一种基因顶部微阵列标记仪，GTMASS SYSTEM(Nippon Laser &Electronics Lab.)，从384-孔微量滴定板加样0.5μl的PCR产物(100至500ng/ml)，并且将每5nl的产物点滴在6个以280μm厚度包被了聚L-赖氨酸的微载玻片上(S7444，Matsunami)。为了使点滴的DNA量相等，打上印记后，在装有热蒸馏水的烧杯中弄湿载玻片，然后在100℃干燥3秒。然后将这些载玻片放在载玻片架上，并将此架放进玻璃箱中。然后将一种封闭溶液(含有15ml 1M硼酸钠(pH8.0)、5.5g琥珀酸酐化合物(Wako))和335ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(Wako))倒入此玻璃箱中。将装有载玻片架的玻璃箱上下反转5遍后，再将它轻轻摇晃15分钟。然后，将载玻片架移至装有沸水的玻璃箱中，并将其摇晃5遍，然后将其静置2分钟。然后将载玻片架移至含95％乙醇的玻璃箱中，并摇晃5遍，接着将其离心(800rpm)30分钟。(7)植物原料和RNA的分离有两种植物体用作植物原料，一种植物体是野生型拟南芥植物体，它被种在一种琼脂培养基(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)上生长3周，另一种是拟南芥(哥伦比亚种)植物体，其中导入了与花椰菜花叶病病毒的35S启动子连接的DREB1A cDNA(Kasuga等，1999)。按照Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki的方法(1994)进行干旱处理和冷处理。即从琼脂培养基中拔出植物体，将其放在一种滤纸上，然后在22℃和60％相对湿度的条件下完成脱水处理。通过将这种生长在22℃下的植物移至4℃的条件下进行冷处理。通过在一种含有250mM NaCl的溶液中进行水培而完成高盐处理。
野生型植物体接受胁迫处理2或10小时后，对它们进行抽样，然后用液氮将它们深低温保存。野生型和DREB1A超量表达型转化体均可用于鉴别DREB1A靶基因的试验，所述DREB1A超量表达型转化体是在一种不含卡那霉素的琼脂培养基中培养的。对DREB1A超量表达型转化体不进行胁迫处理。应用ISOGEN(日本基因，东京，日本)从植物体中分离整个RNA，然后用Oligotex-dT30 mRNA提纯试剂盒(Takara，东京，日本)对mRNA进行分离和纯化。(8)探针的荧光际记在Cy3dUTP或Cy5dUTP(Amersham Pharmacia)的存在下，每个mRNA样本都进行逆转录。逆转录缓冲液(30μl)的成分如下含6μg寡(dT)18-链节的聚(A)+RNA 1μg10mM DTT500μM dATP、dCTP和dGTP200μM dTTP100μM Cy3dUTP或Cy5dUTP400单位SuperScriptII逆转录酶(Life Technologies)1X Superscript第一链缓冲液(Life Technologies)共30μl在42℃反应1小时后，混合两样本(一个样本用Cy3标记，另一个样本用Cy5标记)，加入15μl0.1M NaOH和1.5μl 20mM EDTA，并在70℃将此混合物处理10分钟。然后再向基保加入15μl 0.1MHCl，然后将此样本移至一种Micro con30微量浓缩器(Amicon)中。加入400μl TE缓冲液，接着离心，使缓冲液的量变成10至20μl，然后丢弃流出液。在向其中加入400μl TE缓冲液和20μl 1mg/ml人Cot-1 DNA(Gibco BRL)后，再次离心此混合物。通过离心收集标记的样本，并加入几μl的蒸馏水。将2μl的10μg/μl酵母菌tRNA、2μl的1μg/μlpd(A)12-18(Amersham Pharmacia)、3.4ml 20×SSC和0.6μl的10％SDS加入所得到的探针。然后，在100℃下，将此样本变性1分钟，在室温下放置30分钟，然后用于杂交。(9)微阵列杂交和扫描应用台式微量离心机，将探针高速离心1分钟。为避免产生泡沫，将此探针放在阵列的中心，在其上放一盖玻片。在一个载玻片上滴4滴5μl 3×SSC，将箱保持在适宜的湿度下，以避免杂交中探针脱水。将载玻片放进一种杂交盒中(THC-1，BM machine)，并密封，然后在65℃处理12至16小时。从此杂交盒中取出载玻片，放在一种盒架上，并在此溶液1(2×SSC，0.1％SDS)中小心除去盖玻片。然后摇动此架进行冲洗，并将它移至溶液2中(1×SSC)，冲洗2分钟。然后，再将此架移至溶液3中(0.2×SSC)，留置2分钟，然后进行离心(800rpm，1分钟)，以进行干燥。
应用一种扫描激光显微镜(ScanArray4000；GSI Lumonics，Watertown，MA)，以每像素10μm的分辨率扫描微阵列。分析这种微阵列数据的程序使用的是Imagene版本2.0(BioDiscovery)和Quant Array(GSI Lumonics)。(10)Northern分析应用全RNA进行Northern分析(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)。将通过PCR方法从拟南芥全长cDNA文库中分离的DNA片段用作进行Northern杂交的探针。(11)启动子区的测定根据数据库中拟南芥的基因组信息(GenBank/EMBL，ABRC)，用进行基因分析的BLAST程序分析启动子区。2、结果(1)胁迫诱导基因通过Cy5-dUTR存在下的逆转录，由从非胁迫拟南芥植物分离的mRNA制备荧光标记cDNA。由冷处理植物(2小时)制备用Cy3-dUTP标记的第二探针。这两种探针同时与包含大约1300个拟南芥cDNA克隆的cDNA微量阵杂交，然后产生一种假色象(附
图1)。
红色信号和绿色信号分别代表冷胁迫诱导的基因和抑制的基因。黄色信号代表两种处理水平几乎相等时所表达的基因。每个斑点的长度与每个基因表达水平的绝对值相一致。可以看到红色信号代表一种冷诱导基因(rd29A)，而黄色信号代表一种α-微管蛋白基因(一种内部对照基因)通过cDNA微阵列分析的方法，鉴定了全部44个干旱诱导基因(表1和2)。表1

表2通过cDNA微阵列分析鉴定的干旱和冷-诱导基因和DREB1A靶基因

在表2中，为干旱诱导和寒冷诱导的基因，以及DREB1A靶基因(35SDRER1A)的基因是rd29、cor15A、kin2、erd10、kin1、rd17、erd4、FL3-5A3、FL5-77、FL5-94、FL3-27和FL5-2I22。为干旱诱导和寒冷诱导的基因，但不是DREB1A靶基因的基因是FL5-2024、FL5-1A9、FL5-3M24和FL5-3A15。特异干旱诱导基因是rd20、FL6-55、FL5-3J4、FL2-56和FL5-2D23。特异寒冷诱导基因是DREB1A和FL5-90。这些基因分类的结果见图4。
另外表2的＂编码的蛋白/其它特征＂列显示一个基因产物的推定功能，它是通过序列同源性推测的。
“干旱”列的“比率”是通过下面的等式获得的(FI荧光强度)比率＝[(干旱条件下的每个cDNA的FI)/(无胁迫条件下的每个cDNA的FI)]÷[(干旱条件下的α-微管蛋白的FI)/(无胁迫条件下的α-微管蛋白的FI)]“寒冷”列的“比率”是通过下面的等式获得的(FI荧光强度)比率＝[(寒冷条件下的每个cDNA的FI)/(无胁迫条件下的每个cDNA的FI)]÷[(寒冷条件下的α-微管蛋白的FI)/(无胁迫条件下的α-微管蛋白的FI)]“35SDREB1A”列的“比率”是通过下面的等式获得的(FI荧光强度)比率＝[(35SDREB1A植物的每个cDNA的FI)/(野生型植物的每个cDNA的FI)]÷[(35SDREB1A植物的α-微管蛋白的FI)/(野生型植物的α-微管蛋白的FI)]“干旱”列中的名词“新或已报道”是指，当一个基因还未报道是一种干旱诱导基因时，即显示为“新”；当一个基因已报道是一种干旱诱导基因时，即显示为“已报道”。“寒冷”列中的寒冷诱导基因和“35SDREB1A”列中的DREB1A靶基因也是如此。
表2所述的基因中，14个基因(cor15A、kin1、kin2、rd17、rd19A、rd20、rd22、rd29A、erd3、erd4、erd7、erd10、erd14、AtP5CS)先前已报道是干旱诱导基因(Bohnert，H.J.等(1995)植物细胞7，1099-1111；Ingram，J.和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403；Bray，E.A.(1997)植物科学趋势2，48-54；Shinozaki.K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)植物生理115，327-334；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999)对于旱胁迫反应的分子高级植物对寒冷、干旱、热和盐胁迫反应的分子，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.主编，R.G.LandesCompany；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)植物生物学最新观点、(Curr.Opin.Plant Biol.)3，217-223；Taji，T.等，(1999)植物细胞生理40，119-123；Takahashi，S.等，(2000)植物细胞生理41，898-903.)。
这些结果显示本发明人的cDNA微阵列系统有益地具有发现胁迫诱导基因的功能。在其余的30个新干旱诱导基因中，所发现的cDNA分子(FL-5A3、FL6-55、FL5-1N11、FL5-2024、FL5-2H15和FL1-159)表现出与推定的冷顺应蛋白(编号AC006438)、LEA76型1蛋白(编号X91919)、非特异性转脂蛋白(LTP1；编号M80567)、推定的水通道蛋白(编号AC005770)、T45998EST和HVA22同系物(编号AB015098)的同一性。
另外，通过cDNA微阵列分析已经确定了全部19个冷诱导基因(表1和2)。这些基因中有9个已经报道是冷诱导基因，即rd29A、cor15a、kin1、kin2、rd17、erd10、erd7和erd4(Kiyosue等，1994；Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1997，1999，2000；Taji等，1999；Thomashow，1999)和DREB1A基因(Lui等，1998)。
同样，在其余的新冷诱导基因中，发现了cDNA分子(FL3-5A3、FL5-3A15、FL5-3P12、FL5-90、FL5-2I22和FL1-159)，它们表现出与推定的冷顺应蛋白(编号AC006438)、铁蛋白(编号X94248)、EXGT-A2(编号D63510)、β-淀粉酶(编号AJ250341)、DC1.2同系物(编号X80342)、和HVA22同系物(编号AB015098)的同一性，而且还发现了cDNA分子(FL5-1A9、FL5-95和FL5-3M24)它们表现出与结瘤素样蛋白(编号CAA22576)、水稻乙二醛酶I(编号AB017042)和LEA蛋白同系物(SAG21；编号AF053065)的序列相似性。
而且，本发明人应用全长cDNA微阵列确定了DREB1A转录因子控制的胁迫诱导基因。图2显示了DREB1A靶基因鉴定的一种方法。由转基因拟南芥植物(一种35SDREB1A转基因植物)制备的mRNA(其在CaMV 35S启动子的控制下超量表达DREB1A cDNA)和由一种野生型对照植物制备的mRNA分别用于制备Cy3标记和Cy5标记的cDNA探针。混合这些cDNA探针，然后将它们与一种cDNA微阵列进行杂交。在35SDREB1A转基因植物中的表达水平比在野生型对照植物的表达水平高两倍以上的基因被确定为一种DREB1A靶基因。
通过cDNA微阵列分析已经鉴定了全部12个DREB1A靶基因(表1和2)。这些基因中的6个已经报道为DREB1A靶基因，rd29A/cor78、cor15a、kin1、kin2、rd17/cor47和erd10(Kasuga等，1999)。同样，在其余6个新DREB1A靶基因中，发现了cDNA分子(FL3-5A3、FL5-2I22、FL5-94和FL5-77)，它们表现出与推定的冷顺应蛋白(编号AC006438)、DC 1.2同系物(编号X80342)、烯醇化酶(编号X58107)和peroxiredoxin TPX1(编号AFl2l355)的序列同一性，而且发现了一种cDNA分子(FL3-27)表现出与豇豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(编号Z21954)和crd4cDNA(Kiyosue等，1994；Taji等，1999)的序列相似性。
将所鉴定的干旱-诱导或冷-诱导基因分入下列3组中(图4)1)干旱-和冷-诱导基因2)特异性干旱诱导基因3)特异性冷诱导基因对于下面21个基因，难以将它们分入上面的3组，所以不对它们进行这样的分类erd3、FL3-519、FL3-3A1、FL5-1F23、FL2-1F6、FL3-5J1、FL5-1N11、FL5-2H15、FL5-2G21、FL5-2I23、FL5-1C20、FL2-1H6、FL5-2E17、FL3-3B1、FL5-3E18、FL3-2C6、FL5-1P10、FL2-5G7、FL2-1C1、FL2-5A4和FL5-3P12。
最后，将已鉴定的基因分类为20个干旱-和冷-诱导基因、5个特异性干旱诱导基因和2个特异性冷诱导基因。然后，干旱-和冷-诱导基因分入下列2组1)DREB1A靶基因2)非DREB1A靶基因的基因因此，有16个干旱-和冷-诱导基因分为12个DREB1A靶基因和4个非DREB1A靶基因的基因。(2)RNA凝胶印迹分析在cDNA凝胶印迹分析中，用最小的努力挖掘出适宜的数据是重要的。本发明人用下列方法对cDNA微阵列分析的有效性进行评价。
首先，鉴定具有高于α-微管蛋白表达率(干旱2小时/未胁迫)2倍的表达率的80种基因。对这80种推定的干旱诱导基因进行RNA印迹分析，其中44种被鉴定为实际的基因。来自微阵列分析的结果和来自RNA印迹分析的结果之间的差异是由下列引起的(1)基因的低表达，(2)高背景，(3)cDNA斑点上划痕或灰尘，和(4)具有低特异活性的糟糕的cDNA探针。因而，将上述实验数据进行标记并将其中的一半从下列分析中排除。数据处理后，基于cDNA微阵列分析最终鉴定出44个干旱诱导基因、19个冷诱导基因和12个DREB1A靶基因。此后，进行RNA凝胶印迹分析，以证实用cDNA微阵列所获得的结果。通过对鉴定的44个干旱诱导基因、19个冷诱导基因和12个DREB1A靶基因的微阵列分析所获得的表达数据结果，与通过用RNA印迹分析所获得的结果一致。
附图3显示微阵列分析结果与RNA印迹分析结果在6个新DREB1A靶基因(FL3-5A3，FL3-27，FL5-2z22，FL5-94，FL5-77和erd4)方面的比较。所有6种基因均通过干旱和冷处理诱导，并在未胁迫条件下在35SDREB1A植物中过量表达。
对来源于干旱处理的野生型植物(脱水2或10小时(置于一张滤纸上))、冷处理的野生型植物在(4℃下冷却2或10小时)、或未处理的35SDREB1A转基因植物(35SDREB1A对照)的样品，用Cy3-dUTP进行荧光标记，而对来源于未处理的野生型植物的样品(对照)，用Cy5-dUTP进行荧光标记。这些样品与cDNA微阵列杂交，然后通过扫描计算相对表达率，并显示于一个附图(附图3)中。此附图显示了干旱-和冷-处理野生型植物和35SDREB1A转基因植物的RNA印迹分析图像。用Genflank，EMBL和DDBJ数据库对两种DREB1A靶基因(FL3-5A3和FL3-27)的全长cDNA序列独立注册，登记号分别为AB044404和AB3044405。
同样，用一种含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列，分离出301个干旱诱导基因、54个冷诱导基因和211个高盐胁迫诱导基因。(3)启动子区域的鉴定作为启动子区域鉴定的结果，获得了8种类型的基因(FL3-5A3、FL5-2H15、FL5-3M24、FL5-90、FL5-2I22、FL6-55、FL1-159和FL5-2D23)的启动子区，它们是在含有大约1,300个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列中获得的。这些启动子的序列显示于序列号1至8中。
基因名 启动子区域序列FL3-5A3序列号1FL5-2H15 序列号2FL5-3M24 序列号3FL5-90 序列号4
FL5-2I22 序列号5FL6-55 序列号6RL1-159序列号7FL5-2D23 序列号8作为启动子区域鉴定的结果，获得了10种类型的基因(PL05-08-P24、FL05-09-G08、FL05-09-P10、FL05-10-N02、FL05-18-I12、FL05-21-F13、FL06-10-C16，、FL06-15-P15、FL08-10-E21和FL09-11-P10)的启动子区，它们是在含有大约7,000个拟南芥属全长cDNA分子的全长cDNA微阵列中获得的。这些启动子的序列显示于序列号9至18中。基因名序列号FL05-08-P24 序列号9FL05-09-G08 序列号10FL05-09-P10 序列号11FL05-10-N02 序列号12FL05-18-I12 序列号13FL05-21-F13 序列号14FL06-10-C16 序列号15FL06-15-P15 序列号16FL08-10-E21 序列号17FL09-11-P10 序列号18已知一种保守序列“PyACGTG(G or T)C”(其中，Py代表一个嘧啶碱基，即C或T)在许多ABA-反应基因中充当一种ABA-反应性元件(ABRE)(Ingram，J.，和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403；Bray，E.A.(1997)植物科学趋势，2，48-54；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999).对干旱胁迫反应的分子。高等植物对冷、干旱、热和盐胁迫反应的分子，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.，编辑R.G.Landes公司)。而且，还已知由9个核苷酸组成的保守序列“TACCGACAT”组成的序列(干旱反应元件DRE)，对rd29A在干旱-、冷-和高盐-胁迫条件下表达的诱导控制是必须的，但是，没有作为一种ABA-反应元件(ABRE)的功能(Yamaguchi-Shinozaki，K.，和Shinozaki，K.(1994)植物细胞6，251-264)。还已知CRT或LTRE，它们是DRE或DRE-相关的核心基序(CCCAG)，存在于干旱-和冷-诱导基因的区域(例如kin1、kin2、rd17/cor47和cor15a)(参见表3，Baker，S.S.等，(1994)植物分子生物24，701-713；Wang，H.等(1995)植物分子生物28，605-617；Iwasaki，T.等(1997)植物生理115，1287)。表3cDNA微阵列分析a)鉴定的DREB1A靶基因启动子区域中观察到的ABRE、DRE和CCGAC核心序列

在表3中，a)，b)和c)如下定义a)ABRE、DRE和CCGAC核心序列是指在被分离出的最长的cDNA 5′-末端的上游1,000bp观察到的序列。b)圆括号中的数据代表在被分离出的cDNA 5′-末端开始的核苷酸。减号的含义是一种存在于推定的转录起始位点5′-末端上游的核苷酸。c)由9个核苷酸组成的每种序列，含有一个CCGAC核心基序，而且这些序列一种与另一种相互重叠。
本发明人通过cDNA微阵列分析鉴定了12个DREB1A靶基因。在与FL3-5A3和FL3-27的cDNA分子相对应的基因的启动子区域观察到9bp的一个DRE序列(表3)。在与FL3-5A3、FL5-2I22、FL5-77和FL5-94的cDNA分子相对应的基因的启动子区域观察到一种核心，序列“CCGAC”(表3)。几乎所有的干旱-和冷-诱导的基因均为DREB1A靶基因，其中每种基因在其启动子中均包含一种DRF/CRT顺式作用元件(表3和附图4)。在已鉴定的12种DREB1A靶基因中的6个启动子区域观察到一种ABRE序列(“PyACGTG(G或T)C”(表3)。这表明许多干旱-和冷-诱导基因受依赖ABA的和不依赖ABA的两种途径控制。但是，一些干旱-和冷-诱导基因(FL5-3M24、FL5-3A15、FL5-1A9和FL5-2024)在35SDREB1A转基因植物中没有增加(附图4)。这表明这些基因不是DREB1A靶基因。在FL5-3M24的cDNA的5′-末端上游的2,000bp的区域没有发现核心序列＂CCGAC＂。这表明与干旱-和冷-诱导基因的表达有关的一种新顺式作用元件存在于FL5-3M24基因的启动子区域中的可能性。(4)各种胁迫处理时间与表达率之间的关系关于上述分离出的18种类型的胁迫诱导基因的各种胁迫处理时间与表达率之间的关系的分析结果，显示于下列附图5至39中。基因名胁迫结果(显示结果的附图)FL3-5A3 冷(附图5)，干旱(附图6)和高盐(附图7)FL5-2H15 冷(附图8)，干旱(附图9)和高盐(附
图10)FL5-3M24 干旱(附
图11)和高盐(附
图12)FL5-90冷(附
图13)FL5-2I22 冷(附
图14)，干旱(附
图15)和高盐(附
图16)FL6-55干旱(附
图17)和高盐(附
图18)FL1-159 干旱(附
图19)FL5-2D23干旱(附图20)和高盐(附图21)FL05-08-P24 干旱(附图22)FL05-09-G08 干旱(附图23)FL05-09-P10 干旱(附图24)和ABA(附图25)FL05-10-N02 高盐(附图26)FL05-18-I12 干旱(附图27)，高盐(附图28)和ABA(附图29)FL05-21-F13 干旱(附图30)和冷(附图31)FL06-10-C16 干旱(附图32)，高盐(附图33)和ABA(附图34)FL06-15-P15 干旱(附图35)，高盐(附图36)和ABA(附图37)FL08-10-E21 干旱(附图38)FL-9-11-P10 高盐(附图39)如附图5至39所示，通过本发明的方法分离出的胁迫诱导基因具有不同的分布型，但是均可以通过施加各种类型的胁迫来诱导表达。本发明的效果本发明提供了一种胁迫反应启动子。本发明的启动子是有用的，它可以被用于抵抗环境胁迫植物的分子育种。
序列表<110>理化学研究所(RIKEN)丰田自动车株式会社(TOYOTA MOTOR CORPORATION)<120>环境胁迫效应因子<130>xxxxx<150>JP 2001-309984<151>2001-10-05<150>JP 2000-356652<151>2000-11-22<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2072<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1tgggcttttg atccacatga cgatcatata gttctttcct tcaacacaaa acacttgaag 60tgtatcttat caactaaact ctattccagc aaaattattt caaaattaga tatatgggag 120aatttttaca ggccattcta gattttcatt aacgctgtga tttatccgtt aataagtacg 180attaagagta aaacgacgtc gtttgcaatt gaaacaaaaa tccccaattc agaaataaga 240aaccctagat cctcaaatct cttcttcttt tcttcttcga attcactcct gtattttgaa 300atcaaagtga attgcaaggc acaaagttca tgctttaaag cactgcaaat ggcgaagtca 360tgatttatat ggcatttttc ctgtttttgt ttcaattgca aacgacgtcg ttttgctctt 420aaacggtctc attaacggat aaatcacatc ttctaattgc tctgtttatt cagttgatgt 480tgtgactaat ttggctctgt caacgaaagt tagtgatttt atctgaagtc aacacgtaat 540tgatgatttt aatcacaaag tacaaagttt atgtttaaag caccacaaat tgcgaagtcg 600tgatttaaat gacatttttc ccgttctggt taaactaagt ttctattatt taatatggat 660attgtggagc gtagtgtcag cactcagcag cttatttaac gtgatactct ttaaccgagt 720aacaactagt gaggtcatat tcaggaccga tccaacaata ttgagggttt tactccaagt 780aaaattttag ttttattttt aattatcata aacgacataa atataatatg gaaagatcac 840aaatactgat taaaaactaa aatcatcaaa acgaaaaaga aaaaagaaaa aattgggttc 900aactctcatg agttattaaa cattttaggt tttaggctta aatctttaaa aaaaatcaga 960actgaaaaac gaaaaattct aattttattt tggactctga ttcatagctt atgtcgctta 1020tgtagttatg ctagggatga atctgtattt cgttaccgta atgagagttc gatactctct 1080tacttgttac gattctggag catgttacat ttttttcttt ccgtcaacaa caactttaat 1140atggtaaaac aaaatttatt tttatttggc tggtcctact caagacaaat cttctgccga 1200catcacataa tcatattaaa aaccataact tctgccactc tgtttttttt tttttttgta 1260accattaact gattggattt tgatccatct catctgattt tttagctcaa caatttactt 1320gcacattttc tatttggttt tatttatact tagttacata tatgattatc gaactagtat 1380ctctttataa ttaagtattt ttctattttt ttttaattta gatttttgtg aattcattta 1440cagtagaaaa ctgtaaaacc atatggtcta attatagaat gaaaacttca acgaatccat 1500acaacttatt ggctaaatat aataaatctg cttgaagcat attgttatta tttagttgga 1560tttgacgatc tctgacttta atgtataccg acatacccta tgatttagat gttgattttt 1620cccattctta atatatccat gttaagagat tccaccataa catatctaat tatttgcatt 1680gtaataaata ttatcattaa aaaaaaatac aactggacag ctggctcgtc ccattgtttc 1740ttacgtccac caattacatt tgttaaagca aacttattag aacgttcatg tgtgagaagt 1800tggtgtcgac atgtgtctaa ggtctatgtc agaaatcgga ttagcttatt aagtaaacta 1860tactatatca ttgttaatat agataaaata tctagttcgt ccaaattaaa ctattttcat 1920aactgccacg tggcgtaaac gtatccatcg agtcacttgt aatatcttta taaccaaagt 1980cttccaacac attcatcacc atctatctac tctttactct cttctcttct cacatcaatt 2040attcatagtt ctctcttctc cggcaagaaa ag 2072<210>2<211>2000<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2ctcctgtttc atgatcatat ataaaaggaa agagattgat tcagctaatc aaattcataa 60acatggataa gatatcacaa actctaaacc tagctcaaac tatgaacaat agaggataac 120cacttgaaac ctaattttaa tcagaagatt ttagtacttg tgctgcttat tcaaaattcc 180tttgcccaaa aaaaaaaagt ttgacttacc ttttgaaaga cgaacgtatc cactatggaa 240caatctttcg taatctcact ttctagtttg gtatttaaaa aacccaaaat ttgattgtca 300aattaaatac aataagagat tcctaaaccc agaattcaat tgcgaaatca aacagagacg 360atacagagag agcgagagag cgagagagag agagtgattt acgtgagaac gaatcggata 420aacggaaatt tccagaagcc ggatgagttt cccgctattg tgatgagtaa caaaacaaat 480tcgggagttg tctatttaat acttatcaat agcccatgaa cgcagagacg tatggacgcg 540agaatcgtta gtacgtgaca cgtgtaaacc agtgacgtca ccgctctcgt cacaaacccg 600ctagtattgt cctcttctat tttatctcac acaatcatgt taggttatca tagtaccact 660aaacatttat gtgagaatgg atggatatta gacaaccgac gacaaataaa acaaacaaaa 720gtagatagac gaccataaat taaactataa acgaagattg agggaaaaaa tcattggttt 780agattttcga acaaatatcg tgaaaagttt ttcatcttgt agtttttgta attaatggtg 840tatgaaaaat cattggtttg tttagttgaa ttaaatttca gtaaacggtt tagagtatga 900acccactcaa taaagatttg actgccaagc gttactggtg tctggtggat tgaatagtta 960agagtataag gtttgggcca ttatgtggtt tttattaaag ttgaaggtct catttattaa 1020ttccttagag ctgatggcta atgtacaacg aatttgattc aggagtaaga taaacggtac 1080acccaaacac gcgacgcgag cgaagaagac gatgacgaac 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ctaactacca 1980aggaaccaaa aacatgacaa 2000<210>3<211>2000<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3catataccaa ccgcctaaca ttacagcctg tccccatccc ctatctttat ttttcttttt 60ggctcattta gcttcaactt tttttaatag gtgtgattag aacatactaa aaaaaacata 120tgttttaact tatattatat gaataaagtg ttgtttttaa tagtttatat ttctattaca 180agtacaatat ataggatatt ttggttaaca attttaaatt taaaagatat tgtgagtaca 240aatcattaag cttaacacaa atgttcattg cttcttaatt cttacaatcg gaaaatttgg 300acaaaaaatc tagactaatc tccaaaacat tgtgaaaaat tgggggtttt ttttatcatt 360taaattgtct atagtggtca atcattatta aaaaaaattg ttttttgttg aaattttaaa 420ttataaaaaa aaaacacgtt tatacataaa atgcaaaaac ttttcttaaa ccaaattaca 480gagaaaggct atcaccatcc ttgtcttgat gccaaccaca cttgtaatcc caaaatacat 540acttaaacta tactatacta acatgaattg gttatacgat tatctatcta gttagctaca 600taattcatat aattagtttt ttaaaatata cttatgtaat gatagtaact aaaaaatata 660ctatctcgag aaatccaacc aaaatgctat gatagtatat aaaataaaat gaaagaaaga 720ggaaccaagt tgtgaaacca tttaccaaga agaagaagaa aaaaacaaga tggtcgagtc 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1.一种环境胁迫反应启动子，它包括下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由选自序列号1至8的任意核苷酸序列组成的DNA；(b)由含有相对于选自序列号1至8的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一个或多个核苷酸的一种核苷酸序列组成的并具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA；以及(c)在严格条件下与由选自序列号1至8的任意核苷酸序列组成的DNA杂交，并且具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA。
2.一种环境胁迫反应启动子，它包括下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由选自序列号9至18的任意核苷酸序列组成的DNA；(b)由含有相对于选自序列号9至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一个或多个核苷酸的一种核苷酸序列组成的并具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA；以及(a)在严格条件下与由选自序列号9至18的任意核苷酸序列组成的DNA杂交，并且具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA。
3.权利要求1或2的启动子，其中所述的环境胁迫是至少一种选自冷胁迫、干旱胁迫、盐胁迫和高光胁迫的环境胁迫。
4.一种表达载体，所述表达载体包括权利要求1至3任一项的启动子。
5.权利要求4的表达载体，其中还插入了一种所需基因。
6.一种转化体，所述转化体包括权利要求4或5的表达载体。
7.一种转基因植物，所述的转基因植物包括权利要求4的表达载体或 5的重组载体。
8.权利要求7的转基因植物，其中的植物是一种植物体、植物器官、植物组织或植物培养细胞。
9.一种用于生产抗胁迫植物的方法，它包括培养或栽培权利要求7或8的转基因植物。
全文摘要
本发明提供了一种胁迫反应启动子。本发明的环境胁迫反应启动子包含下列(a)、(b)or(c)的DNA;(a)由选自序列号:1至18的任意核苷酸序列组成的DNA;(b)由含有相对于选自序列号:1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一个或多个核苷酸的一种核苷酸序列组成的并具有充当一种环境胁迫反应启动子功能的DNA;以及(c)在严格条件下与由选自序列号:1至18的任意核苷酸序列组成的DNA杂交,并且具有充当一种环境胁迫反应启动子的DNA。
文档编号A01H5/00GK1373222SQ01145739
公开日2002年10月9日 申请日期2001年11月22日 优先权日2000年11月22日
发明者筱崎一雄, 关原明, 楠城时彦 申请人:理化学研究所, 丰田自动车株式会社