专利名称：玉米草的杂交不亲和性特征及其在玉米中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米草杂交障碍特征。含有所述特征的植株具有杂交不亲和性表型。本发明还涉及含有玉米草杂交障碍特征的新型杂交不亲和植株，包括纯种、杂种、单倍体、无性生殖和/或遗传工程植株。含有本发明所述玉米草杂交障碍特征的杂交不亲和植株能用于商业领域以防止这些植株与非所需植株系如遗传工程植株发生非选择性杂交。
玉米能通过自花授粉或异花授粉繁殖。在相同植株上玉米有分开的雄花序(称为雄花穗)和雌花序(称为雌花穗)。当风将花粉从雄花穗吹到从发育穗的顶部突出的玉米须上时，玉米就自然授粉。
大多数玉米产自杂交种子。杂交玉米种子的生产要求消除或灭活源自母本的花粉。花粉的不完全去除或灭活提供了潜在的自花授粉。这种自花授粉种子可能与杂交种子在无意中一起收割并包装。现已开发出数种方法用于控制雄性生育力，并因此防止自花授粉。这些方法包括手工或机械去雄(通常称为去穗)、细胞质雄性不育、遗传雄性不育、杀配子剂等。
杂交玉米种子最常见通过手工或机械去雄生产。该方法操作如下。通常，将两个纯种玉米按垄交替种植在田地里，然后在花粉脱落前，将携带花粉的雄花穗从纯种中去除以便用作雌性植株。只要与外源玉米花粉分开足够的距离，去雄纯种的穗只能与雄性纯种受精，由此产生的种子为杂种。
去雄带来的问题之一是费工费力(因而费用高)，而且有时还不可靠。一种去雄方法包含使用细胞质雄性不育(CMS)纯种。细胞质雄性不育是由母体胞质内导致不育的因子控制的。细胞质雄性不育通过与能育花粉(即来自不是细胞质雄性不育的植株)受精能用于雌性再生。
另一去雄方法包含采用遗传雄性不育。遗传雄性不育是由导致不育以及抑制花药和花粉正常发育的核因子控制的。遗传雄性不育按孟德尔定律遗传，其中不育等位基因(ms)对于花粉生育力(MS)等位基因是隐性的。有许多方法可赋与遗传雄性不育。例如，美国专利4,654,465和4,727,219公开了在基因组内分开位置使用多个突变基因以便提供雄性不育。美国专利3,861,709和3,710,511描述了使用染色体易位产生遗传雄性不育。其他方法包含将编码与雄性组织特异启动子相连的细胞毒性物质的基因或反义系统传递到植株中，在所述反义系统中，鉴定对生育力至关重要的基因并且将该基因的反义基因插入到植株中(参见EP329308和WO90/08828)。
另一去雄方法为应用某些称为杀配子剂、花粉抑制剂或化学杂交剂的化学药品。这些化学药品能阻断或杀死可生育花粉的形成并由此产生短暂的雄性不育。然而，有许多因素会影响这些化学药品的用途，如化学药品的费用、基因型的特异性以及使用时间。
玉米杂种的生产需要纯合自交玉米系。纯合自交系能通过谱系繁殖产生，其中将两个玉米纯种系杂交，各系拥有不同组别的所需特征。选择含有目的特征的优良植株，然后自交多代以便使该系更加纯种。这种不断自交和选择的方法持续5代或更多代。此繁殖的结果产生了遗传上纯合或纯种的系。通常，采用这种方法纯种系的发育周期至少需要5年甚至更长的时间。
当发育纯种系时，一条更快或更完全达到同质性的途径是通过使用单倍体植株。单倍体为只含有体细胞一半染色体数的植株，这些体细胞不是单倍体细胞。已知一些玉米植株可自发产生单倍体。例如，已知具有不定配子体(ig)基因的植株可生成单倍体。另外，已知‘原种6(Stock 6)’系(参见，Birchler，J.A.，“Practical Aspects of HaploidProduction”，The Maize Handbook，Freeling and Walbot(eds).pp.386-388(1996))具有生成单倍体的倾向。杂交中使用ig或‘原种6’将导致子代中产生一些单倍体植株。
或者，单倍体植株能采用本领域已知技术生成。一种这样的技术为花药培养。花药培养是一种方法，通过该方法大量单倍体能直接从体外花药中产生。一般而言，花药培养包含从植株中分离不成熟的花药，并将它们放到能诱导花药内细胞的培养基上，通常其注定成为花粉粒，开始分裂并形成细胞培养物，从中能再生出单倍体植株。许多实施花药的技术在本领域中是已知的，并公开在J.M.Dunwell，“Anther and Ovary Culture”，SWJ Bright和MGK Jones(编辑)，CerealTissue and Cell Culture，Martinus Nijhoff Publisher，1985，Dordrecht，第1-44页以及美国专利5,306,864、5,322,789、5,445,961和5,602,310中。另一种能用于生成单倍体的方法是小孢子培养。除了使用小孢子而非花药产生单倍体植株以外，小孢子培养与花药培养类似(参见，Coumans等，Plant Cell Reports 7618-621(1989)；Pescitelli等，Plant CellReports，7673-676(1989))。花药或小孢子培养的优势在于这使得测试大量新突变和基因组合并从中筛选所需特征成为可能。
无论是自发获得的单倍体还是从花药或小孢子培养中获得的单倍体都是不育的。为了弥补这种不育，可将单倍体的染色体数可加倍。有时染色体加倍能自然发生。但是，多数情况下必须使用药剂才能实现染色体加倍。能产生染色体加倍的药剂包括但不限于秋水仙碱或有丝分裂纺锤体抑制剂。染色体数的加倍导致完全能育和纯种的双单倍体植株。因为这些双单倍体植株繁殖可靠，这使得用于选择所需特征的方法更有效率。具有所需特征或特性的这些双倍的单倍体植株能用在谱系繁殖中以生成商业上有价值的杂种。
有许多不同方法可用于将所需特征或特性导入靶玉米种质源中，不管这种玉米种质源是纯种还是杂种植株。
一种方法中使用回交将所需特征或特性引入靶玉米种质源(称回归亲本)中，方法是将该回归亲本和表达某些目的特征如但不限于疾病抗性、高产率潜力、良好茎强度、合理的耐旱性等的供体植株(非回归亲本)杂交。尽管供体植株优选纯种，其也能是与回归亲本杂交可育的任意植株品种。然后将源自这种杂交的子代与回归亲本回交，鉴定具有所需特征的子代，并且重复此过程。与回归亲本回交并筛选所需特征的过程重复5代或更多代。由该法所产生的子代对于控制被转移特征的基因座是纯合的，除此之外与回归亲本相似。然后将最终的回交代自交，从而为被转移基因提供纯种子代。
第二种方法是利用无融合生殖将所需特征或特性导入靶玉米种质源中。无融合生殖包括无需有性生殖生产杂交种子。无融合生殖在一些植物中为自然繁殖方法，其导致后代遗传上与母体植株相同(即克隆)，从而使得改进的杂种纯种。这将使得农场主和资源缺乏(resource-poor)的农民重复播种他们自产的种子，但是此策略对当前作物如玉米所提供的杂交品种不实用。在此引作参考的美国专利5,710,367描述了具有两个未鉴定基因的单性生殖玉米，所述基因据信控制卵的单性生殖发育，还描述了制作单性生殖玉米的某些方法。
第三种方法是利用遗传工程将所需特征或特性导入靶玉米种质源中。遗传工程是指基因从一个生物转移到另一受体生物的复杂人工技术。农业上可利用遗传工程创造新的含有来自其他生物基因的植物品种，这些基因给受体植株提供了改良特征，如但不限于改进的产量、颜色、高度、耐寒性以及昆虫或疾病抗性。然而，人们对遗传工程植株在田间大环境下种植生长仍有许多忧虑。美国的农业部、食品与医药管理局和环境保护机构都对遗传工程生物包括遗传工程植株的使用实行管制。
涉及遗传工程或遗传修饰(下简称“GM”)作物最大的问题之一包括GM作物可能污染非GM作物。具体而言，人们担心包含在GM作物内的转基因将通过花粉或种子传播到邻近生长着非GM作物的田地里，并给非GM作物授粉。这种所谓的“花粉污染”或“非选择性杂交”给种植了非GM作物的农民增添了高额费用。已经努力采用作物间隔距离、作物轮种和管理实践来减轻“花粉污染”问题。例如在美国，生产种子建议GM和非GM玉米田地的间隔距离为203.1米(约0.126英里)。自然屏障的存在可缩短这种间隔距离。
于是，对于异花授粉的植物如玉米很明显需要一种办法用于防止非选择性杂交，尤其是与GM植株的非选择性杂交。尽管时间调配差异和间隔距离对繁殖分离有益，但生理屏障通常足够防止杂交，尤其是在以风授粉的物种中。一种可能防止非选择性杂交的办法是杂交不亲和性。然而，与自交不亲和性相反，杂交不亲和性(下简称“CI”)在遗传和生理上都没有被清楚地定性。
在驯化玉米中，CI范围在程度上从花粉种类中创造出优选物种一直到防止产籽。由于花粉作用的效率受到影响，带来这些效果的基因称为配子体因子(下简称“Ga”)(参见Nelson，O.E.，The MaizeHandbook，M.Freeling和V.，Walbot编辑，Springer-Verlag(1993))。仅赋予花粉基因型优选性的Ga因子是隐性的，其影响连锁基因的传送以及花粉在混合物中的竞争能力。涉及花粉和穗丝中对应等位基因之间识别的例子为Ga2、Ga4、Ga8以及包含Gal的某些组合。导致产籽失败的不亲和性与Gal的强等位基因一起出现，具体而言，当Gal-s Gal-s植株用gal gal授粉时，该杂交用于从其他玉米植株的花粉中分离出商用爆花玉米。作为分离体系，Gal-s是有缺点的，由于一些玉米品系携带gal-s或另一等位基因Gal-m，这使得它们与含有gal和Gal-s的品系杂交。在这些品系中，障碍不复存在。
因此，本领域需要遗传和生理上清楚定性的玉米的杂交-不亲和性体系，其可防止玉米植株与非所需花粉源的非选择性杂交。
本发明进一步涉及表现TCB特征的杂交不亲和玉米植株，其中所述TCB特征衍生自W22-TCB。这种杂交不亲和玉米植株在其基因组内可进一步含有基因簇，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。该基因簇在其基因组内包含(1)Tcb基因座；和/或(2)至少一个修饰基因。本发明的杂交不亲和玉米植株可以是纯种、杂种、单倍体、无性生殖和/或遗传工程植株。
本发明进一步涉及获取第一纯种玉米植株的方法，当其与第二纯种玉米植株杂交，产生杂交玉米种子，在植物生长条件下种植和生长后，生成表现出杂交不亲和性的TCB特征的杂交玉米植株。该方法的第一步包括从一杂交不亲和并具有TCB特征的玉米植株群体中筛选出第一供体亲本玉米植株。第二步包括将选择的供体第一亲本玉米植株与第二亲本玉米植株杂交。所述第二亲本玉米植株优选含有在杂交组合中编码所需特征的基因。此外，第二亲本玉米植株可能是或可能不是杂交不亲和的并且含有TCB特征。第三步包括收集得到的玉米种子。第四步包括在植物生长条件下种植和生长所得的种子。第五步包括筛选所得植株群体是否存在经过第一步鉴定的TCB特征。最后一步包括从含有TCB特征的所述群体中筛选具有杂交不亲和性的植株，以便进一步杂交和筛选，直至获得对TCB特征是纯合的玉米系，从而以纯种提供该特征用于杂交组合中。作为该方法结果而产生的含有TCB特征的杂交不亲和纯种玉米植株也包括在本发明中。
本发明进一步涉及生产含有TCB特征的杂交不亲和杂交玉米植株的方法。该方法第一步包括将含有杂交不亲和性TCB特征的杂交不亲和纯种玉米植株与第二玉米纯种系杂交以产生分离植株群。第二玉米纯种系优选含有编码所需基因型特征的基因。此外，第二玉米纯种系可能是或可能不是杂交不亲和的并且含有TCB特征。该方法第二步包括收集所得的杂交玉米种子。本发明还涉及作为该方法结果而产生的含有TCB特征的杂交不亲和杂交玉米植株。
本发明进一步涉及筛选用于生产纯种玉米植株的第一供体亲本玉米植株的方法，其中该纯种玉米植株如果与第二纯种玉米植株杂交，则产生杂交不亲和的并且含有TCB特征的杂交玉米植株。该方法包括分析一玉米植株群体中是否存在含有TCB特征的各个植株的步骤。该方法可进一步包括分析所述玉米群体中各植株的DNA是否存在基因组内基因簇的步骤，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。另外，对玉米植株群各植株的DNA可进一步分析(1)位于4号染色体短臂上距离sugaryl基因约6个图单位和距离Gal基因约40个图单位的Tcb基因座；和/或(2)至少一个修饰基因。本发明还涉及作为该方法结果而产生的含有TCB特征的杂交不亲和第一供体亲本玉米植株。
本发明进一步涉及筛选含有TCB特征的杂交不亲和杂交玉米植株的方法。该方法包括分析一玉米植株群体中各植株是否具有TCB特征的步骤。该方法可进一步包括分析玉米植株群中各植株DNA是否存在基因组内基因簇的步骤，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。另外，玉米植株群中各植株的DNA可用于进一步分析(1)位于4号染色体短臂上距离sugaryl基因约6个图单位和距离Gal基因约40个图单位的Tcb基因座；和/或(2)至少一个修饰基因。本发明还涉及作为该方法结果而产生的含有TCB特征的杂交不亲和第一供体亲本玉米植株。
本发明进一步涉及控制田地和/或人工气候室或温室中的玉米植株杂交的方法。该方法包括在田地和/或人工气候室或温室中种植含有上述TCB特征的杂交不亲和玉米植株的步骤。
本发明进一步涉及控制田地中用于杂交种子生产的纯种玉米植株杂交的方法。该方法包括在用于杂交种子生产的田地和/或人工气候室或温室中种植含有上述TCB特征的杂交不亲和玉米植株的步骤。
本发明的其他目的、优点和特征从下列说明书并结合图将变得明晰。
附图简述
图1为染色体(连锁)图，表示Tcb相对于Zea mays中的4号染色体短臂上侧翼基因的位置。
图2A-2F表示杂交的玉米穗，该杂交旨在辨别W22回交子代中分离的玉米草衍生的不亲和性基因。将玉米粒无色、纯育的TCB株的花粉与赋予玉米粒颜色的gal tcbl花粉混合，然后置于测试株中植株的穗丝上(参见图2A和2D)。将各测试植株的花粉用于同Gal-s穗丝(图2B和2E)和Tcbl(图2C和2F)穗丝的杂交。出现了两种类型的植株。第一类植株显示在图2A-图2F中，这些植株的穗丝对有色示踪花粉不会辨别，而且这些植株的花粉在两个测试株中均不可接受。这些植株缺少Gal和Tcbl。第二类植株显示在图2D-2F中，这些植株的穗丝对示踪花粉不可接受，并且这些植株自己的花粉在Gal-s测试株上接受差，但在Tcbl的测试株上可接受。这些植株缺少Gal但携带Tcbl。
图3A表示F1杂合基因型，给出了亲本和重组类型I、II和III用于定位Tcb。图3B表示4号染色体遗传图，指示在短臂邻近的区域中相对于可见标记和分子标记的tcbl位置。着丝粒用实心圆指示。
图4表示玉米草不亲和性(“TIC”)表型和本发明TCB特征之间的差异。
图5A-5B表示Tcbl和Gal花粉的竞争。图5A表示gal tcbl花粉(有色玉米粒株)在与gal Tcbl(无色玉米粒株)竞争中获得成功。将该两个株源的花粉混合，然后放置到雌株的穗丝上，所有雌株都能赋予无色玉米粒。图5B表示gal tcbl花粉(有色玉米粒株)在与Gal-stcbl(无色玉米粒株)竞争中获得成功。将该两个种源的花粉混合，然后放置到相同组别的雌株的穗丝上，所有雌株都能赋予无色玉米粒。
导言本发明涉及玉米草杂交障碍(“TCB”)特征。含有该特征的植株具有杂交不亲和性表型。本发明还涉及含有玉米草杂交障碍特征的新型杂交不亲和植株，包括纯种、杂种、单倍体、无性生殖和/或遗传工程植株。含有本发明所述玉米草杂交障碍特征的杂交不亲和植株能用于商业领域以防止这些植株与非所需植株系如遗传工程植株发生非选择性杂交。定义本发明所提供的标题不是对本发明各方面或实施方案的限制，其应参照说明书全文内容。相应地，下文紧接着定义的术语参照说明书全文内容可被更充分限定。
如本发明所用，术语“等位基因”表示任何一种或多种形式的基因，所有等位基因涉及一种特征或特性。在二倍体细胞或生物中，给定基因的两个等位基因在一对同源染色体上占据对应的基因座。
如本发明所用，术语“玉米”(对应于英文单词corn)表示Zea maysL.的任意种类、栽培品种或种群。
如本发明所用，术语“杂交不亲和性”指两个植株或物种间不能杂交和/或异花授粉。
如本发明所用，术语“原种”表示具有某些优良特征的植株或品种，例如但不限于，高产量、良好的谷粒质量以及疾病抗性。
如本发明所用，术语“已表达序列标志”或“EST”表示为基因提供序列标志的cDNA克隆的部分基因序列数据。
如本发明所用，术语“基因簇”指含有能表达所需特征的遗传物质(如但不限于一个或多个基因或等位基因)并经鉴定的染色体区域。
如本发明所用，术语“杂合的”表示当不同等位基因位于同源染色体上对应的基因座时存在的遗传条件。
如本发明所用，术语“纯合的”表示当相同等位基因位于同源染色体上对应的基因座时存在的遗传条件。
如本发明所用，术语“杂种”表示任意两个遗传不相似的个体间杂交的后代(Rieger，R.，A.Michaelis和M.M.Green，1968，A Glossaryof Genetics and Cytogenetics，Springer-Verlag，N.Y.)。
如本发明所用，术语“杂交”指不同或不相似亲本间后代的形成。
如本发明所用，术语“纯种”表示基本上纯合的个体或物种。
如本发明所用，术语“基因渗入”(对应于英文单词introgressed或introgressing)表示将基因或基因簇从一种植株进入或导入到另一种植株中。
如本发明所用，术语“同功酶”表示酶的可检测的变体，所述变体催化相同反应，但例如在一级结构和/或电泳迁移率上相互区别。
如本发明所用，术语“基因座”表示连锁图内或染色体上的位点，其是特定特征的基因的位置。任意一个基因的等位基因可在该位点出现。
如本发明所用，术语“玉米”(对应于英文单词maize)表示Zeamays L.的任意种类、栽培品种或种群。
如本发明所用，术语“图单位”表示染色体图(连锁图)中距离的单位，通常测定值以厘摩表示。具体而言，图单位是两个连锁基因对间的距离，其中1％减数分裂产物是重组的。
如本发明所用，“微卫星”或“简单序列重复(SSR)”或“二核苷酸重复”或“三核苷酸重复”或“四核苷酸重复”皆指由二、三、四或五核苷酸单元串联重复组成的DNA延伸。SSR区域可短到两个重复单元，但更通常超过8-10个重复单元。简单序列重复基本上在所有研究的真核生物基因组中常见，并在基因的多态性研究中已被确定为有用的工具。
如本发明所用，术语“修饰基因”是指影响另一基因表型表达的基因。
如本发明所用，术语“分子标记”包括但不限于扩增片段长度多态性(AFLP)、已表达序列标志(EST)、限制片段长度多态性(RFLP)、微卫星(也称为“简单序列重复”(SSR))、单核苷酸多态性(SNP)或限定具体基因和染色体位置的同功酶标记。
如本发明所用，术语“植物”或“植株”包括植物细胞、植物原生质体、玉米植株能从中再生的植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植物块以及在植物或部分植物中完整的植物细胞，如胚芽、花粉、胚珠、花、谷粒、穗、穗轴、叶、种子、外壳、茎、根、根尖、花药、穗丝等。
如本发明所用，术语“群体”表示衍生自共同遗传植株的杂合集合。
如本发明所用，术语“限制片段长度多态性”或“RFLP”表示个体间在由特定限制酶切割的DNA片段大小上的变化。导致RFLP的多态性序列在物理图和遗传连锁图上用作标记。
如本发明所用，术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指在超过1％的群体中发生的点突变。
如本发明所用，术语“变种”或“栽培品种”表示一组相似的植株，其结构特征和性能在相同种内可与其他变种区分开来。发明详述本发明涉及对杂交不亲和性的玉米草杂交障碍特征(“TCB特征”)。含有TCB特征的杂交不亲和性玉米植株(1)当与缺乏TCB特征的玉米植株的花粉授粉后不能产籽，但与携带TCB特征的植株授粉后则能产籽(参见实施例2中的第1-120行)和/或(2)保持有功能花粉并且自身授粉后能产籽或导致其他玉米植株与所述植株授粉后产籽。本发明的TCB特征可基因渗入到不含有这种特征的玉米植株中(如纯种、杂种、单倍体、无性生殖和/或遗传工程植株)，为了产生新的含有TCB特征的杂交不亲和玉米植株(参见实施例2)。
本发明的TCB特征由基因簇组成，所述基因簇显性表达，位于4号染色体的短臂上(通常称为“S”)，介于图单位40-85之间(显示在
图1中)。优选基因簇位于4号染色体短臂上介于图单位40-80之间(显示在
图1和图3B中)。最优选基因簇位于4号染色体短臂上介于图单位66-75之间(参见图3B)。
该基因簇优选含有位于上述染色体位置内的基因座，并在本发明中称作“玉米草杂交障碍”或“Tcb”基因座。Tcb基因座位于4S染色体上距离sugaryl标记约6个图单位(或厘摩)，距离Gal标记约40图单位(或厘摩)。Tcb基因座含有控制花粉和穗丝亲和性的基因。由至少一个包含Tcb基因座的基因编码的一种特性在本发明中被称为“穗丝效应”作用。更具体地，含有Tcb并且用作雌性亲本时表现出穗丝效应的杂交不亲和玉米植株(或纯合或杂合)，当用不表现杂交不亲和TCB特征的玉米植株的花粉授粉后不产籽，如但不限于dent(gal)系和pop(Gal-s)系。对Tcb基因座杂合并且表现出穗丝作用的玉米植株，在与通过纯合Gal-s穗丝拒绝gal花粉相似的水平上拒绝gal和Gal-s花粉。然而，含有Tcb基因座并且当用作雌性亲本时表现出穗丝效应的杂交不亲和玉米植株，当与不含有Tcb基因座以及不表现穗丝效应的其他玉米植株的花粉授粉后不产籽，如dent(gal)或pop(Gal-s)玉米系，含有Tcb基因座并且当用作雌性亲本时表现出穗丝效应的杂交不亲和玉米植株，当被含有Tcb基因座表现穗丝效应的玉米植株授粉后接受花粉并产籽。作为雌性亲本对杂交障碍的Tcb特性和作为花粉亲本克服障碍的能力一起遗传，并且可能是Tcb基因座的相同或不同基因的功用。
由至少一个包含Tcb基因座的基因编码的第二特性在本发明中被称为“花粉效应”。更具体地，含有Tcb基因座并且当用作雄性亲本时表现出花粉效应的玉米植株，保持有功能花粉并能自我生殖，并且可使某些其他玉米植株，如dent(gal)系受精。含有Tcb基因座并且表现出穗丝和花粉效应的杂交不亲和玉米植株，(a)用作雌性亲本时拒绝dent(gal)系的花粉；以及(b)用作雄性亲本时可自我授粉，也能对dent(gal)系授粉。
尽管本发明优选含有TCB特征和Tcb基因座的杂交不亲和玉米植株具有至少一个编码穗丝和花粉效应作用的基因，含有TCB特征和Tcb基因座并具有至少一个仅编码穗丝效应或花粉效应作用的基因的玉米植株也包括在本发明中。
除了Tcb基因座以外，本发明所述的基因簇还含有至少一个修饰基因，其修饰Tcb基因座的效果。至此，本发明人认为至少一个修饰Tcb基因座效应的修饰基因位于Gall标记的方向距离Tcb基因座约6.5个图单位或厘摩(参见
图1)。其他修饰Tcb基因座的效果并位于(1)该基因簇内；(2)4号染色体上该基因簇的外边；和/或(3)除了4号染色体外的一个或多个染色体上的修饰基因也在本发明预期内。此外，本发明所述的基因簇也可含有其他基因，因此这些基因也在本发明的预期范围内。
现有技术具体为Kermicle，J.L.等，Maydica 35399-408(1990)与本发明的区别在于所述现有技术讨论的是称为玉米草不亲和性或“TIC”的表型。而TIC表型与TCB特征是不同的。如图4所显示，Kermicle等中所讨论的TIC表型包括TIC-CP1(Gal-m)(其与花粉效应作用Tcb相关)、TIC-CP2以及一些未定义的功能。TIC-CP2是TIC丢失花粉排斥的雌性功能后的稀缺变体。含有TIC-CP2的玉米植株用作雄性亲本时，能够给含有TIC和dent(gal)但不是pop(Gal-s)系的玉米植株授粉。相反，本发明涉及TCB特征。本发明的TCB特征包括Tcb基因座和一个或多个修饰Tcb基因座效果的修饰基因。本发明的Tcb基因座含有至少一个编码穗丝效应和/或花粉效应作用的基因。在Kermicle等中一般性涉及的未定义的功能已经被本发明人发现，其涉及TCB特征并包含一个或多个修饰基因和至少一个编码穗丝效应作用的基因。
含有杂交不亲和性的TCB特征的玉米原种的例子是dent纯种W22-TCB。杂交不亲和纯种W22-TCB含有本发明所述的基因簇。更具体地，该基因簇含有Tcb基因座、至少一个编码穗丝和花粉效应作用的基因以及至少一个对Tcb基因座的修饰基因。另外，W22-TCB还含有TIC-CP1。2500个纯种系W22-TCB种子已于2000年3月30日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，保藏编号PTA-1601。该保藏是按照布达佩斯条约要求做的。保藏期限为自保藏日起30年，或保藏中心自最后一次请求保藏后5年，或该申请授权成为美国专利后的有效期期间，无论怎样期限会更长。这些种子将更新以免在保藏中心失活。
本发明进一步预期来自dent纯种W22-TCB的TCB特征在杂交中的应用，以便开发出新的含有杂交不亲和TCB特征和商业上所需特性的纯种和杂种植株。采用本领域中公知的植物育种和分子生物学技术，能开发出这样一些新的纯种和杂种植株。例如，纯种W22-TCB能用于新建杂交不亲和的并含有TCB特征的第一纯种dent系。含有TCB特征的该第一纯种dent系能与第二纯种dent系杂交以创造出合乎商业要求特征的杂交不亲和dent杂种。此外，W22-TCB以及从其衍生的杂种能用于花药组织的培养以创造出单倍体和双倍体植株以及单性生殖玉米植株。另外，本发明进一步预期新型玉米杂交不亲和的含有TCB特征的纯种、杂种、单倍体、单性生殖和/或遗传工程植株，其中TCB特征衍生自W22-TCB。
分子生物学技术能用于鉴定含有TCB特征的植株。例如，分子标记可用于鉴定本发明所述的基因簇。任何可用于鉴定与TCB特征有关的基因簇的分子标记预期在本发明保护范围内。例如，介于
图1所显示的phi021和nc005之间包括这二者的标记以及介于图3B中所显示的umc1117和bnlg490之间包括这二者，尤其是mmc0471的标记都可用于鉴定基因簇。因此，在本发明所述保藏的dent纯种W22-TCB和分子标记之间，含有本发明所述TCB特征和基因簇的其他来源的遗传材料当然可以为本发明当前采用本领域公知的常规技术所能允许鉴定的这种材料。更具体而言，采用本领域中公知技术，本发明所述的TCB特征和基因簇可用于鉴定其他异花授粉的单子叶和双子叶植物中所述TCB特征或类似特征以及类似基因、基因簇和/或分子标记，如但不限于油菜籽和黑麦。对和本发明所述在玉米中杂交不亲和性体系相似的方式发挥作用的同源杂交不亲和性体系的鉴定在油菜籽中特别重要。油菜籽为异花授粉物种(油菜籽含有自交不亲和性体系可防止自花授粉)。遗憾地是，已知本领域报道了非GM油菜籽物种被GM油菜籽物种中转基因所污染。与本发明所述杂交不亲和玉米植株功用相似的杂交不亲和的油菜籽的开发可有益于防止GM油菜籽物种造成非所需的和非选择性的油菜籽杂交。
本发明所述的TCB特征采用本领域公知的植物育种技术可基因渗入到玉米植株中。具体而言，表现本发明TCB特征的玉米植株可作为花粉亲本与含有编码合乎商业要求的特征基因的其他供体玉米植株杂交以便新建含有上述TCB特征的杂交不亲和的纯种、杂种、单倍体、单性生殖和/或遗传工程玉米植株。在其基因组内含有TCB特征的杂交不亲和纯种玉米系，当与第二纯种玉米系杂交时，可产生杂交不亲和的并具有TCB特征的杂种玉米植株。通过从一杂交不亲和的并含有TCB特征的玉米植株群体中筛选第一供体亲本玉米植株，可开发出这些杂交不亲和的纯种玉米植株。当含有TCB特征的合适供体亲本玉米植株鉴定后，其与第二供体亲本玉米植株杂交。第二供体亲本植株可以是或不是杂交不亲和的并且其含有TCB特征。此外，第二供体亲本玉米植株在杂交组合中优选含有编码合乎商业特征的基因。这些合乎商业的特征包括但不限于昆虫抗性(如但不限于对蜘蛛(对应于英文单词mite)、蚜虫、甲虫以及蜘蛛(对应于英文单词spider)等的抗性)、线虫抗性(如但不限于对粘虫(Fall Armyworm)和食虫(WesternRootworm)等的抗性)、疾病抗性(如但不限于对Northern叶枯病、Southern叶枯病、锈病、Stewart枯萎病、玉米坏死病(Corn LethalNecrosis)、丝黑穗病、玉米枯黄病矮小病毒、玉米枯黄病斑驳病毒、玉米矮小花叶病毒等的抗性)等。将所得的种子收集、种植并生长在植物生长条件下。然后从得到的植株群中筛选出那些含有上述TCB特征的植株。将这些植株筛选出来在自花授粉或近缘授粉条件下进一步杂交，直到获得对TCB特征纯合的纯种系。然后把该杂交不亲和的纯种玉米系用于自交、回交、杂种生产、群体杂交等。
例如，含有合乎商业特征的纯种玉米系(回归亲本)能与基因组内携带本发明所述的TCB特征的供体纯种(非回归亲本)杂交。然后将该杂交的子代与回归亲本反向交配。从所得子代中筛选那些从非回归亲本中转入了杂交不亲和性的TCB特征的植株。在与回归亲本进行了3代，优选4代，或更优选5代或更多代选择杂交不亲和性的回交后，所述子代对于控制杂交不亲和性的TCB特征的基因座将是杂合的，但是其大多数或几乎所有其他基因将类似于回归亲本。
各种以实验室为基础的技术，如标记辅助的选择以及本领域中其他已知技术，可用于回交以鉴定与回归亲本具有最高遗传一致性程度的子代。这使得可以生产和鉴定与回归亲本具有至少90％，优选95％和更优选至少99％的遗传一致性的纯种玉米系。
本发明所述的杂交不亲和的纯种玉米系可用于额外的杂交以新建杂交不亲和杂种植株。例如在其基因组中含有TCB特征的第一杂交不亲和的纯种玉米植株可作为花粉亲本与第二纯种玉米系杂交。优选地，第二纯种玉米系拥有合乎商业特征，如但不限于昆虫抗性(如但不限于对蜘蛛(对应于英文单词mite)、蚜虫、甲虫以及蜘蛛(对应于英文单词spider)等的抗性)、线虫抗性(如但不限于对粘虫(FallArmyworm)和食虫(Western Rootworm)等的抗性)、疾病抗性(如但不限于对Northern叶枯病、Southern叶枯病、锈病、Stewart枯萎病、玉米坏死病(Corn Lethal Necrosis)、丝黑穗病、玉米枯黄病矮小病毒、玉米枯黄病斑驳病毒、玉米矮小花叶病毒等的抗性)等。此外，该第二纯种玉米系可以含有或不含有对杂交不亲和性的TCB特征。将所得的种子收集、种植并生长在植物生长条件下。然后从得到的植株群中筛选出含有对杂交不亲和性的TCB特征的杂种植株。然后筛选出表现TCB特征的杂交不亲和性杂种植株。
含有本发明所述TCB特征的杂交不亲和的玉米植株为开发新纯种或杂种玉米植株目的，可在田地和/或人工气候室或温室中用于控制杂交。具体而言，本发明的杂交不亲和玉米植株可种植在田地和/或人工气候室或温室中，并用于创造新的含有某些合乎商业特征的纯种和杂种玉米植株，而无需担心这些玉米植株将被非所需玉米种源(如GM玉米植株)的花粉非选择性杂交和污染，所述非所需玉米种源位于同一田地中或位于相邻的田地中，或位于同一人工气候室或温室中。例如，在基因组内含有本发明所述TCB特征的杂交不亲和的纯种玉米植株可种植在用于自交种子生产的田地和/或人工气候室或温室中。这些杂交不亲和的纯种玉米植株可种植在含有GM玉米植株的同一或邻近的田地，或同一人工气候室或温室中。然后将这些杂交不亲和的玉米植株杂交以产生杂交种子。由于所述纯种玉米植株是杂交不亲和的，它们将不会被任何源自GM玉米植株的花粉致育。相反，这些植株将仅被源自含有本发明所述的TCB的杂交不亲和的玉米植株的花粉致育。
以实施例方式而不是限制，本发明将给出下列实施例。实施例1玉米草杂交障碍基因座的鉴定和特征表1不亲和性原种原种 不亲和性基因源 区别特征gal tcbl dent玉米纯种W22可接受所有花粉；不能致育Gal-s/Gal-s或TCB/-Gal-s tcbl白云爆花玉米(White 纯合不接受但杂合以不同程Cloud Popcorn)杂种 度可接受gal花粉；不能致育TCB/-Gal-m tcbl中心高原玉米草48703可接受所有花粉；能致育(Central Plateau teosinte Gal-s/Gal-s但不能致育48703) TCB/-TCB单元型中心高原玉米草48703 TCB/-不接受tcbl；致育所有雌蕊基因型。TCB/TCB自交不亲和性弱。
gal Tcbl 中心高原玉米草48703 Tcbl/-依据修饰基因构成不接受或部分接受tcbl；不能致育Gal-s/Gal-s
为了使遗传背景标准化，将目的基因通过回交插入到中西部美国(Midwestern US)dent纯种W22，其缺少已知的不亲和性因子(galtcbl)。Gal-s配对系的开发首先由W22与白云杂种爆花用玉米杂交，然后自花授粉前将含有子代的Gal-s回交W22 5代以建立纯合谱系。首先通过与如所提供的各种gal tcbl原种杂交5代，然后继续与W22杂交，将中心高原玉米草集合48703的不亲和性基因(Wilkes，“Teosintethe closest relative of maize.”The Bussey Institute of Harvard University，Cambridge，MA(1967))转移到玉米中。筛选导致多因子单元型指定的TCB的强不亲和性，在与W22杂交3代后为常规用途建立Tcbl试验对象。在进行额外的回交代后从TIC中分离出Gal-m tcbl和gal Tcbl(在Kermicle等，Maydica 35399-408(1990)的表3中分别鉴定为B类和C类)。在将TCB掺入到纯种W22背景前，采用衍生的原种进行实验，包括首先用gal tcbl授粉，一天后用植株自己的花粉授粉。实施例1b绘制Tcbl遗传图将Tcbl的Tassel seed 5(Ts5)与4号染色体测试对象原种淡绿色17(vl7)、棕色中脉3(bm3)和含糖1(sul)(Maize Genetics CooperationStock Center)杂交，F1与隐性测试对象回交产生5点测交群体，用于对Tcbl相对于4个可见标记进行这位。由于降低的存活率和在含糖(sugary)类型内划分淡绿色秧苗表型的困难，仅确定了非含糖谷粒类型的特征。将非含糖谷粒样本田间播种，按表型类型分成vl7、bm3和ts5以鉴定交换体类型，然后与TCB/sul互相杂交以测定Tcbltcbl组成。额外的vl7-Su交换个体在温室中种植鉴定为淡绿色秧苗，然后对田间移栽株根据成熟植株表型分类，确定为Tcbltcbl。从子代中建立5个vl7-Sul交换体，其中淡绿色表达为不完全外显，因而不能测定有效的群体大小。在研究的遗留3个子代中，有15个vl7-Sul交换体存在于237个植株中，或6.3±1.6％，与前报道7.6±1.3％(Stinard，Maize Gen.Coop.Newsletter 7279(1998))比较。实施例lc简单序列重复分析依据MaizeDB中的数据选择已知或被怀疑定位于4号染色体短臂上的简单序列重复(SSR)。采用Dellaporta在“Plant DNA miniprepand microprepversion 2.1-2.3”，The Maize Handbook，Freeling andWalbot(eds.)第522-525页(1994)中所述的方案从样品中抽提DNA。在PTC-200 Thermal Cycler(MJ Research)上进行PCR反应。扩增条件与Senior等Crop Sci，381088-1098(1998)中所述的“touchdown”方案(profile)除了用连续4℃循环终止前，最后循环重复30次而非20次以外均相同。将15μl反应混合液组成为各引物3 pmol、2.5mMMgCl2、各dNTP 100μM、10mM Tris pH 9、50mM KCl、0.1％TritonX-100、1mg/ml纯化BSA(New England Biolabs)、0.6单位Taq DNA聚合酶(Promega)以及约30ng模板DNA。扩增完成后，每个样品中加入3μl的加样染料(30％甘油、0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯腈蓝)，各混合液取6μl在4％Metaphor(FMC Bioproducts)琼脂糖凝胶上1×TBE中电泳(Sambrook等，Moleucular cloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Lab Press，New York 1989)。电泳后，将凝胶在0.5μg/ml的溴化乙啶中染色并在UV透射仪上测定。等位基因构成首先确定为vl7 bm3 sul多测试对象以及对所有SSR标记的Ts5Tcbl原种。然后对那些在两亲本型之间具有可检测的多态性的片段，检测Ts5和sul之间的重组体。
表2根据由Ts5 V17 Bm3 Sul(Tcbl)/ts5 vl7 bm3 sul(tcbl)杂合子与ts5 vl7 bm3 sul雌株的杂交所产生的测交群体，玉米草杂交障碍1(Tcbl)相对于4个可见标记在玉米染色体臂4S上的位置。对从非含糖谷粒生长的重组子代通过与TCB Sul/+sul的相互杂交以及与纯合sul的杂交评价Tcbl重组类型植株数 以重组类型 以重组类型 在与sul/sul雌 Tcbltcbl作为雄株产 作为雌株含 株(植株数)构成籽率％ 糖谷粒％ 杂交株中的含糖谷粒％I.ts5-Vl7 6 70.8 3.8-21.9 54.5(4)TcblII.vl7-Bm3组A 4 66.3 4.2-19.2 57.8(3)Tcbl组B 5 0.0a28.1-35.350.3(4)tcblIII.bm3-Sul 11 0.0b24.9-34.050.5(7)tcbl
a0谷粒b共8谷粒根据单交换体类型归纳了回交数据，未发现多交换体。ts5和vl7重组的6个植株样品(参见图3A的区域I)保留了所有三个Tcbl特征。相反，11个bm3-Sul交换体(区域III)未保留任何特征。9个vl7-Bm3交换体(区域II)分成两类4个保留所有Tcbl特征，而5个未保留任何特征。通常，3个特征的共分离定义了玉米草杂交障碍1基因座。大约在vl7和bm3中间，其在Neuffer等，Mutants ofMaize，Cold SpringHarbor Lab Press，New York(1997)的1995玉米遗传图上绘至于位置74(参见图3B)。
多重测试株和Ts5 Tcbl亲本之间多态性的简单序列重复(SSR)标记对重组体在4个介于由可见标记及tcbl所定义的Ts5和Sul之间的区域中进行追溯测试(参见图3B)。该数据将umc1117和phi074放置在Tcbl远端、介于vl7和Ts5之间，将bnlg490放置于Tcbl和bm3中靠近Tcbl的位置，以及将nc005和bnlg1937放置于bm3和Sul之间，该群体中mmc0471未从Tcbl中分离。
上述连锁研究中Tcbl/tcbl植株对tcbl花粉的排除是可变的。Ts5Tcbl亲本类型的9个回交植株产自1.5-15.3％含糖谷粒而非孟德尔预期的25％。相似地，6个ts5-V17交换植株范围为3.8-21.9％含糖。相比较而言，正反交中的范围只有1.1-3.8％，例如，当将交换植株的花粉放到TCB Sul/+sul雌株上。这种较低值与将TCB Sul/+sul雄株的花粉放置到TCB Sul/+sul雌株上的情况下sul谷粒的范围相同。考虑到介于tcbl和sul基因座之间有6％的重组，后者的结果与完全排除tcbl花粉一致。当回交植株为雌株时，对所观察到的Tcbl衰减的类似解释为一个或多个修饰基因在TCB的Ts5 Tcbl原种发育过程中丢失或者Ts5自身衰减了Tcbl作用。
第二衰减的Tcbl株在TCB重复与纯种W22回交后鉴定。比较该衍生的Tcbl株与TCB/+和Gal-s/-基因型用gal tcbl风吹授粉后防止产籽的能力。在该测试条件下，Gal-s/Gal-s植株基本上不育，甚至Gal-s/gal杂合子的产籽率低于0.1％。47个TCB/+植株上没有一个谷粒产籽。相反，在衰减Tcbl纯合子中获得了32％的产籽率，在杂合子中获得了43％的产籽率。该结果显示纯种W22携带一个或多个修饰基因，这些基因降低了Tcbl在排斥Tcbl花粉中的有效性。
表3Galgal和Tcbltcbl构成不同的植株的平均产籽率。
允许用gal tcbl对去穗植株进行风吹授粉。
雌性亲本基因型 植株数目 平均产籽率(％)gal tcbl/gal tcbl 71 98.3Gal-s tcbl/Gal-s tcbl 43 0.0aGal-s tcbl/gal tcbl 45 0.1gal Tcbl/gall Tcbl 42 31.9gal Tcbl/gal tcbl 45 42.9TCB/+ 47 0.0ba共2个谷粒b0个谷粒Tcbl与一起存在于TIC单元型中的Gal-m分离，提供适用于测试Gal-s和Tcbl不亲和性体系之间相互作用的材料。为此目的，将galTcbl或Gal-s tcbl花粉与gal Tcbl混合，并施用到各种不亲和性基因型的穗丝上。所用的gal tcbl株赋予有色谷粒，其他株则无色。因此，gal tcbl花粉可充当示踪剂以测定各种雌性亲本如何有效地辨别含有gal tcbl和Gal-s或Tcbl的花粉。
正如根据TCB与gal tcbl混合物所预期，gal Tcbl与gal tcbl花粉混合物在含有Tcbl穗亲本上基本上生产全部产籽的谷粒(图2D)。TCB/+雌株几乎全部可辨别gal tcbl花粉，而衰减Tcbl纯合子和杂合子(两者皆纯合的gal)有色谷粒平均大约20％，与亲和的gal tcbl植株一样多。(参见实施例1a校正混合物中两类活花粉的比例。)Gal-m tcbl/gal Tcbl采用衰减的Tcbl基因型而非TCB/+基因型加倍了杂合子曲线的斜率。因此，TCB的强障碍不是由于Tcbl与Gal-m的如此组合，而是由于其他因子的增强。采用这种混合物授粉的纯合Gal-s tcbl植株基本上是不育的。但是，与gal或Gal-m(两者皆为纯合tcbl)杂合的Gal-s植株部分产籽。其中只有完全亲和的gal tcbl约一半的有色谷粒，这表明Tcbl的Gal-sl-雌蕊对tcbl花粉具有决定性的优先权。
Gal-s tcb与gal tcb花粉的混合物(图5B)在Gal-s纯合子和杂合子(都是tcbl/tcbl)产籽良好，几乎完全辨别gal Tcbl花粉，这也在预料之中。用该混合物授粉的TCB/+雌株几乎不育，而衰减的Tcbl/tcbl杂合子产穗基本良好。衰减Tcbl原种的纯合或Gal-m的加入都不会导致不亲和性的水平接近TCB/+的水平。Tcb/-雌株相对于galtcbl存在较少部分的有色谷粒，这再次表明在两个不亲和体系之间存在部分杂交识别。
Tcbl能在授粉前或后被表达。如果后合子，产籽率降低应伴随变形的分离情况，如TCB/sul杂合子的F2群体中缺少含糖谷粒。在该情况下未观察到产籽率下降，提供了反对后合子机理的证据。
然而可以想像地是，其他类型杂交后所观察到的不育能反映后合子的致死率。为证明这种可能性，分离杂合TCB的回交子代中10个植株和标准tcbl/tcbl植株连续数天授粉。第一天施用颜色标记的galtcbl，第二天接着施用植株自己的花粉。6个产生全穗的植株多数为有色谷粒，这表明与gal具有亲和性。4个植株产生大多数无色或仅产生无色以及弱有色的谷粒，其是TCB/+亲本的特征，这表明尽管采用不亲和的gal tcbl预先授粉，胚珠仍保持存活。实施例1fTcb作用的主要修饰基因的定位为了确定与tcb连锁的任何修饰基因，将具有强Tcb作用的Gal-m Tcbl Sul株与gal Tcbl sul杂交两次。在62个携带Tcbl的子代株中，当自花授粉时，除了4个以外全部生成7.0％或更少的含糖谷粒，这表明强Tcbl作用。剩余的4个穗携带了9.8-19.6％含糖，这表明位置距离Tcb大约6.5厘摩的修饰基因丢失。4个中有3个从gal tcbl sul亲本中获得gal，其修饰基因位于邻近Tcbl，朝向gal的位置。当Ts5与Tcbl重组后该修饰基因明显去除，从而生成用于绘制Tcbl遗传图的Ts5/Tcbl测试染色体。其缺少解释了在所得原种中Tcbl作用的衰减，并且与表3中所报道的W22大量回交的植株同样如此。实施例2玉米草杂交障碍特征转移到商用原种杂种和纯合系中表现TCB特征的玉米植株通过排斥花粉可防止与某些遗传测试株原种杂交。该杂交障碍能用作从被非所需花粉源的污染中分离出含有TCB特征的品种。为了测试TCB能否防止被商用原种杂种和纯合系授粉，在位于夏威夷群岛的莫洛凯岛上1999/2000冬季进行了杂交实验。
如以下表4所示，将87个不同商用和测试杂种植株的花粉(参见1-110行)放置在dent纯合W22-TCB杂合株的穗丝上。在对每个到此为止所能检测到的杂种的一次尝试性杂交中，74个潜在的穗不含谷粒，5个穗有一个谷粒，6个穗有二个谷粒，以及2个穗有3个谷粒。平行实验中，将代表21个纯合体系植株的花粉放置到W22-TCB纯合株(含有Tcb基因座和至少一个编码穗丝和花粉效应作用的基因，以及在两种染色体中对Tcb基因座的修饰基因)中。该数据显示玉米杂交障碍可有效地防止被商用原种纯种和杂种杂交。
表4
1行号＝种植顺序。
2选择说明＝说明植株是否用作雄株或雌株。
3入号＝公司对杂种或纯种的标号。
4授粉源 ＝采集雄性花粉的行号。
5谷粒数 ＝相互测试杂交穗上授粉的谷粒数。
6#植株号 ＝植株直立计数号。
7开花数据-雌株＝月中穗丝表达的天数，其中穗在穗中央有50％长大约3英寸。
8开花数据-雄株＝月中花粉表达的天数，其中雌蕊在穗中央有50％长大约3英寸。
9来源＝提供种子的个人和/或公司。
10nk ＝无谷粒11k ＝谷粒数12v.v. ＝胎生
＝授粉失败所有文献在此引作参考。
本发明通过以上描述和实施例进行了说明。对本领域那些专业技术人员来说，由于许多变化是明显的，所以以上说明旨在非限制性描述。因此，所有这些变化都包括在本发明权利要求书保护的范围和实质内。
针对在此所述的本发明方法的组成、操作和排列，在不背离如本发明权利要求所限定的内容和范围的情况下，能作出许多变化。
权利要求
1.含有TCB特征的杂交不亲和的玉米植株。
2.权利要求1的杂交不亲和植株，其中所述植株被缺少TCB特征的植株授粉后不能产籽，但被携带TCB特征的植株授粉后能产籽。
3.权利要求1或2的杂交不亲和植株，其中所述植株保持有功能花粉并且被自己授粉后能产籽，或者被所述植株授粉后导致其他玉米植株产籽。
4.权利要求1的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为纯种植株。
5.权利要求1的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为杂种植株。
6.权利要求1的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为单倍体植株。
7.权利要求1的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为无性生殖玉米植株。
8.权利要求1、4、5、6或7的杂交不亲和玉米植株，其中所述植株为遗传工程植株。
9.权利要求9的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4号染色体短臂上，介于图单位40-85之间。
10.权利要求9的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含Tcb基因座。
11.权利要求10的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因约6个图单位，以及距离Gal基因约40个图单位。
12.权利要求10的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因。
13.权利要求10或12的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码花粉效应作用的基因。
14.权利要求9、10、12或13的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含至少一个修饰基因。
15.杂交不亲和玉米植株，其包含TCB特征并且(1)被缺少TCB特征的植株授粉后不产籽，而被携带TCB特征的植株授粉后产籽；和(2)其保持有功能花粉并且被自己授粉后产籽或者被所述植株授粉后导致其他玉米植株产籽。
16.权利要求15的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为纯种植株。
17.权利要求15的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为杂种植株。
18.权利要求15的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为单倍体植株。
19.权利要求15的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为无性繁殖玉米植株。
20.权利要求15、16、17、18或19的杂交不亲和玉米植株，其中所述植株为遗传工程植株。
21.权利要求15的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。
22.权利要求21的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含Tcb基因座。
23.权利要求22的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因约6个图单位，以及距离Gal基因大约40个图单位。
24.权利要求22的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因。
25.权利要求22或24的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码花粉效应作用的基因。
26.权利要求21、22、24或25的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含至少一个修饰基因。
27.杂交不亲和玉米植株，其包含TCB特征并且其中所述TCB特征衍生自保藏号为ATCC PTA-1601的植株W22-TCB。
28.权利要求27的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。
29.权利要求28的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含Tcb基因座。
30.权利要求29的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因约6个图单位，以及距离Gal基因大约40个图单位。
31.权利要求29的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因。
32.权利要求29或31的杂交不亲和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植中编码花粉效应作用的基因。
33.权利要求28、29、31或32的杂交不亲和玉米植株，在其基因组内进一步包含至少一个修饰基因。
34.权利要求27的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为纯种植株。
35.权利要求27的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为杂种植株。
36.权利要求27的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为单倍体植株。
37.权利要求27的杂交不亲和玉米植株，其中所述玉米植株为无性生殖玉米植株。
38.权利要求34、35、36或37的杂交不亲和玉米植株，其中所述植株为遗传工程植株。
39.获得纯种玉米植株的方法，当所获纯种玉米植株与第二纯种玉米植株杂交后，产生杂交不亲和并含有TCB特征的杂种玉米植株，该方法包含下列步骤(a)从一玉米植株群体中筛选第一供体亲本植株，其中所述第一供体亲本植株是杂交不亲和的并含有TCB特征；(b)用含有有杂种组合中编码所需特征基因的第二亲本玉米植株与所筛选出的第一供体亲本玉米植株杂交；(c)从步骤b)得到的杂交株中收集种子；(d)在植株生长条件下将步骤c)中收集的种子种植并生长；(e)筛选出具有步骤(a)中所鉴定的TCB特征的所得植株群体；以及(f)从具有杂交不亲和性的TCB特征的所述群体中筛选植株，用于进一步杂交和筛选，直至获得对杂交不亲和性的TCB特征纯合的系，从而提供这种纯种特征用于杂种组合中。
40.权利要求39的方法，其中第一供体亲本玉米植株在其基因组内进一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。
41.权利要求40的方法，其中第一供体亲本玉米植株进一步包括Tcb基因座。
42.权利要求41的方法，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因约6个图单位，以及距离Gal基因大约40个图单位。
43.权利要求41的方法，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因。
44.权利要求41或43的方法，其中所述Tcb基因座包含至少一个在所述植株中编码花粉效应作用的基因。
45.权利要求40、41、43或44的方法，其中第一供体亲本玉米植株进一步包含至少一个修饰基因。
46.权利要求39的方法，其中第二亲本玉米植株是杂交不亲和的并包含TCB特征。
47.杂交不亲和的纯种玉米植株，其包含权利要求39的方法所产生的TCB特征。
48.表现TCB特征的杂交不亲和的杂种玉米植株的生产方法，该方法包括下列步骤(a)把权利要求39的纯种玉米植株与第二玉米纯种系杂交，所述第二玉米纯种系包含编码所需表型特征的基因，从而生成分离植株群体；以及(b)从步骤a)得到的杂交株中收集种子。
49.权利要求48的方法，其中第二玉米纯种系是杂交不亲和的并包含TCB特征。
50.杂交不亲和的杂种玉米植株，其包含权利要求48的方法所产生的TCB特征。
51.筛选适用于生产纯种玉米植株的第一供体亲本玉米植株的方法，其中所述纯种玉米植株如果与第二纯种玉米植株杂交，则产生杂交不亲和并含有TCB特征的杂种玉米植株，该方法包含下列步骤分析玉米植株群体中各植株是否存在TCB特征。
52.权利要求51的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在其基因组内基因簇的步骤，其中所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。
53.权利要求52的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株的DNA是否存在所述Tcb基因座的步骤。
54.权利要求53的方法，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因约6个图单位，以及距离Gal基因约40个图单位。
55.权利要求53的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因的步骤。
56.权利要求52、53或55的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个在所述植株中编码花粉效应作用的基因的步骤。
57.权利要求52、53、55或56的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个修饰基因的步骤。
58.包含由权利要求1的方法生产的TCB特征的杂交不亲和第一供体亲本玉米植株。
59.含有TCB特征的杂交不亲和的杂种玉米植株的筛选方法，该方法包含下列步骤分析杂种玉米植株群体中各植株是否具有TCB特征。
60.权利要求59的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在基因簇的步骤，所述基因簇位于4号染色体的短臂上，介于图单位40-85之间。
61.权利要求60的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在Tcb基因座的步骤。
62.权利要求61的方法，其中所述Tcb基因座位于4号染色体的短臂上，距离sugaryl基因大约6个图单位，以及距离Gal基因约40个图单位。
63.权利要求61的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个在所述植株中编码穗丝效应作用的基因的步骤。
64.权利要求61或63的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个在所述植株中编码花粉效应作用的基因的步骤。
65.权利要求60、61、63或64的方法，其进一步包括分析所述群体中各植株DNA是否存在至少一个修饰基因的步骤。
66.包含由权利要求60方法产生的TCB特征的杂交不亲和杂种玉米植株。
67.控制玉米植株田间杂交的方法，所述方法包括在田间种植权利要求1、4、5、7、8、15、16、17、19、20、27、34、35、37、38、47、50、58或66的杂交不亲和玉米植株的步骤。
68.控制田间用于杂交种子生产的纯种玉米植株杂交的方法，所述方法包括在田间种植用于杂交种子生产的权利要求4、8、16、20、34、38、47或58的杂交不亲和纯种玉米植株。
全文摘要
本发明涉及玉米草杂交障碍特征。含有所述特征的植株具有杂交不亲和性表型。本发明还涉及含有玉米草杂交障碍特征并显现合乎商业特性的新型杂交不亲和植株，包括纯种、杂种、单倍体、无性生殖和/或遗传工程植株。
文档编号A01H1/02GK1419407SQ01807101
公开日2003年5月21日 申请日期2001年3月30日 优先权日2000年3月30日
发明者杰里·L·克米科尔, 马修·M·S·伊文思, 史蒂文·R·格里什 申请人:威斯康星校友研究基金会