专利名称：金钗石斛的快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种药用石斛的快速繁殖方法，具体地讲，是指一种采用组织培养技术对金钗石斛进行快速繁殖的方法。
背景技术：
植物组织培养是指用植物的各种器官、组织或细胞，在人工控制条件下进行无菌培养，通过生长发育的过程，产生可以用于繁殖的完整植株，并在数量上得到大幅度的增加。该技术取材少，培养植物材料成本低，生长周期短，管理方便。利用植物组织培养这种快速繁殖技术，能在短时间内繁衍出大量植株，并且能较好地保持母本的遗传性状。在我国通过组织培养技术快速繁殖的植物已有近千种。
石斛是我国的一种传统名贵中药，由于生长条件要求苛刻，自然条件下生长极为缓慢，目前大量的采挖已经使一些重要的药用石斛种类濒临灭绝。据调查，现市场上流通的药用石斛有30余种，而以其中的霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛最为珍贵。金钗石斛药用价值非常高，目前的市场价格为7-10元/克。同时，金钗石斛花色艳丽，花期长，适合于做盆花栽培，因此，极具开发利用价值。
对石斛的开发，快速繁殖是第一步。目前有关于霍山石斛、铁皮石斛组培快繁的技术报道较多[如曾宋君、程式君，石斛的试管苗快速繁殖，中药材，1996，19(10)490-491；徐云昌、于力文等，霍山石斛种子试管苗的栽培，安徽农学院学报，1985(1)95-97；赵天榜、陈志秀等，石斛组织培养与栽培技术研究，河南农业大学学报，1994，28(2)128-133等]，从外植体的选择、培养基的筛选等方面可以说已经相当成熟了。一般是以成熟或未成熟的种子为材料，在有激素或无激素的培养基上萌发，形成原球茎，原球茎继续扩增或成苗。具体包括五个步骤(1)外植体的选择与灭菌通常选择果实或当年萌生的有嫩茎尖，果实灭菌一般以70％乙醇杀菌1-2分钟后，再用3％的消洁灵杀菌20-25分钟，无菌水冲洗3-5次，切开果实，将种子撒在培养基表面即可。茎尖则先用无菌水冲洗干净，用70％乙醇消毒10秒钟，再用3％消洁灵杀菌20分钟，无菌水冲洗4-5次，将茎尖接种在培养基上。
(2)腋芽的萌发采用N6培养基，加入1mg/L的6-BA，0.5mg/L的NAA，在25±1℃、光照1500-2000Lx、光照时间为8-10小时/天的条件下培养，直至形成带叶的小苗。
(3)丛生芽诱导将小苗接种在含有2mg/L NAA的1/2N6培养基上培养，直至形成丛生芽，培养条件同步骤(2)。
(4)成苗培养通常将不定芽或丛生芽接种到MS或N6+10％香蕉汁的培养基上，29-31天生根，形成完整植株，培养条件同步骤(2)。
(5)练苗和移栽先将组培苗在室内锻炼20-25天后，洗净根上的培养基，用0.1％的多菌灵消毒后，栽培于活苔藓中，栽后浇足水，以后经常进行人工喷雾，保持环境湿润，每隔10-15天洒一次营养液。成活率可以达到95-97％。
在上述方法和下列关于本发明的描述中，MS和N6培养基是本领域常用的培养基，从有关植物组织培养的书都可找到其配方。BA是6-苄基腺嘌呤，NAA是萘乙酸，Lx是光强的单位——勒克斯。
但上述方法以种子为材料，由于石斛属植物在自然状态下，主要以营养繁殖为主要繁殖方式，虽然开花多，但授粉结实率很低，使得种子的获得具有一定的困难，且接种时间受到严格的限制；选择幼嫩茎尖为材料，不仅接种时间受到限制，材料数量有限，还会明显地影响栽培植株的正常生长；不利于材料的更新。此外，在练苗技术上，多数方法要求较高，如要求栽在活苔藓上，才能获得较高的成活率等，所以难以大规模生产。
目前，关于金钗石斛的离体快繁研究至今未见报道，由于金钗石斛和绝大多数兰科植物一样，种子小，自然条件下萌发率极低，依靠传统的繁殖方式，无法解决金钗石斛的快速繁殖问题。
发明专利内容本发明的目的在于针对现有石斛组织培养方法的不足，对其进行改进，提供一种能够适合金钗石斛、采用组织培养技术进行快速繁殖的方法，该方法可以将金钗石斛的种苗繁殖工厂化，在短时间内获得满足大规模生产所需要的种苗，还具有成本低、种苗生长整齐、练苗方法简便易行、遗传的稳定性好等特点，同时一年四季均能获得所需的外植体。
本发明的方法是在现有石斛组织培养技术的基础上增加“丛生芽增殖培养”步骤，以提高繁殖的效率。也就是说，本发明在现有技术五步骤(1)外植体的选择与灭菌；(2)腋芽的萌发；(3)丛生芽诱导；(4)成苗培养；(5)练苗和移栽的基础上，在步骤(3)“丛生芽诱导”之后增加“丛生芽增殖培养”步骤，其具体操作是将已经通过丛生芽诱导的材料培养在下列培养基中1/2MS，0.1-0.2mg/LNAA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25-30g/L，活性炭0.5g/L，pH为5.6-5.8，培养条件为25-28℃，光强2000-3000Lx，培养时间为25-30天，光照时间10-12小时/天。
本发明的较佳方案是对原有五步骤中的一步或多步进行改进，各步骤的较佳方案如下(1)外植体的选择与灭菌——选用二年生茎段为外植体，茎段洗净、去除叶鞘后，切成具有1-4个腋芽、长3-5厘米段，用300-500mg/L的多菌灵溶液浸泡2-4小时，再用70％乙醇杀菌1-2分钟后，用0.1％氯化汞杀菌15-20分钟，无菌水冲洗3-5次，取出材料，切成具有一个腋芽、长度为1厘米左右的小段，最后用12％次氯酸钠杀菌0.5-1分钟，无菌水冲洗三次。
(2)腋芽的萌发——采用培养基配方为1/2MS，0-1mg/L BA，0-1mg/L NAA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25g/L，活性炭0.5g/L，pH为5.6-5.8。培养条件为25±1℃、光照1500-2000Lx，光照时间为8-10小时/天，培养时间为28-32天。
(3)丛生芽诱导——采用培养基配方为1/2MS，0.1-0.5mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25-30g/L，活性炭0.5g/L，pH5.6-5.8。培养条件为25-28℃，光强1500-2000Lx，光照时间10-12小时/天，培养时间为28-32天。
(4)成苗培养——采用培养基配方为MS或N6+10％香蕉汁，0.1-0.2mg/LNAA，1-2mg/LBA，培养条件为25±1℃、光照1500-2000Lx，光照时间为8-10小时/天，培养时间为60-90天。
(5)练苗和移栽——不再进行室内练苗，而是将洗净培养基的瓶苗在阴凉处晾20-30小时，缓慢降低其含水量；更换活苔藓为商品水藓，栽培后7-10天内不浇水，以减少栽培后的腐烂问题。一个月后，开始施肥。施肥每周2次，用0.3-0.5％的复合肥叶面喷施。这样，不仅可以缩短周期半个月左右，还可以免去对活苔藓的依赖，使得大规模工厂化生产成为可能。
在上述发明中，步骤(2)中，激素浓度最好是采用0.1mg/L NAA+1mg/LBA；步骤(3)中，BA的浓度最好是0.5mg/L；“丛生芽增殖培养”步骤中，NAA浓度最好是0.2mg/L在步骤(5)中，晾的时间最好为24小时，栽培后不浇水的时间最好是10天。
在本方法中，由于采用营养体为材料，而不是利用种子作为材料，因此保证了遗传的稳定性。利用二年生茎段作为外植体的最大优势，是可以在一年四季中任何时候取材，并且材料量充足。增加了丛生芽增殖，可以大大提高快繁的效率，而练苗方法的改进，不仅保证了较高的成活率，也使得该技术满足了大规模推广和工厂化生产的要求。
本发明方法具有如下优点或效果1、本方法克服了传统繁殖方法繁殖速度慢，很难满足大规模生产需求的不足。可以将金钗石斛的种苗繁殖工厂化，在短时间内能够繁殖出满足大规模生产所需要的种苗；2、本方法具有成本低、种苗生长整齐等特点；3、由于采用成熟的茎段作为外植体，保证了遗传的稳定性，同时由于其数量多，可以在一年四季中随时更新。
具体实施例方式实施例1(1)外植体的选择与灭菌将采回的二年生茎段先用毛刷蘸洗洁精将表面的污垢洗净，剥去残留的叶鞘，用解剖刀切成具有1-4个腋芽，长3-5厘米段，用300mg/L的多菌灵溶液浸泡2小时，其间经常摇动，到时弃去多菌灵溶液，材料用流水冲洗干净，加入70％乙醇1分钟，倾出乙醇后用0.1％氯化汞杀菌20分钟，无菌水冲洗3-5次，取出材料，用解剖刀切成具有一个腋芽，长度为1厘米左右的小段，再用12％次氯酸钠杀菌1分钟，接种。其污染率为16.7％，而常规方法的结果污染率高达95.2％，与本发明的方法相比差距甚大。
(2)腋芽的萌发诱导时间为28天，培养条件为25℃，光强2000Lx，光照时间10小时/天。培养基配方为1/2MS，0.1mg/LNAA，1mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25g/L，活性炭0.5g/L，pH5.6。结果在88个外植体材料中，腋芽萌发率为25％，明显好于对照组的9.7％。
(3)丛生芽的诱导诱导时间为28天，培养条件为28℃，光强1500Lx，光照时间12小时/天。培养基配方为1/2MS，0.5mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖30g/L，活性炭0.5g/L，pH5.8。在接种的50个材料中，丛生芽诱导率为18％，对照为4％，本发明的方法明显好于对照组。
新增步骤——丛生芽的增殖采用培养基为1/2MS，0.2mg/LNAA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖30g/L，活性炭0.5g/L，pH5.8。培养条件为28℃，光强3000Lx，光照时间10小时/天。可以在30天内，使丛生芽的数量增加17.2倍，繁殖效率明显提高。
(4)成苗培养培养基采用MS+0.1mg/LNAA+1mg/L BA，培养条件为25℃、光照2000Lx，光照时间为8小时/天，培养时间为60-90天，平均苗高为4.6cm，明显优于对照的2.5cm。
(5)练苗和移栽洗净的瓶苗，在阴凉处晾干24小时，栽于润湿的水藓中，10天后开始浇水，一个月后，开始用0.3％的复合肥叶面喷施，每周2次。成活率为96.3％，与对照95-97％相近，但该方法解决了必须栽于活苔藓中的制约，为大规模工厂化生产创造了条件。
综合以上各步，本发明的方法，不仅在取材方便性，腋芽的萌发率，丛生芽的诱导率，增殖倍数和瓶苗质量等方面明显优于对照，而且为大规模工厂化生产，提供了可行的练苗和移栽的方法，与对照相比具有明显的优势。
实施例2其它同实施例1，步骤(1)的杀菌方法为300mg/L多菌灵4小时+70％乙醇1分钟+0.1％氯化汞15分钟+12％次氯酸钠0.5分钟。结果在接种的859个外植体材料中，污染率为47.7％，明显好于对照组。
实施例3其它同实施例1，步骤(1)的杀菌方法为500mg/L多菌灵2小时+70％乙醇1分钟+0.1％氯化汞15分钟+12％次氯酸钠1分钟。结果在接种的633个外植体材料中，污染率为45.2％，明显好于对照组。
实施例4其它同实施例1，步骤(2)中，诱导时间为32天，培养条件为25℃，光强1500Lx，光照时间8小时/天。培养基配方为1/2MS，1mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25g/L，活性炭0.5g/L，pH5.8。结果在88个外植体材料中，腋芽萌发率为25％，明显好于对照组的9.7％。
实施例5其它同实施例1，步骤(2)的培养基所用激素仅采用1mg/L NAA。步骤(3)中，诱导时间为32天，培养条件为25℃，光强2000Lx，光照时间10小时/天。培养基配方为1/2MS，0.3mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25g/L，活性炭0.5g/L，pH5.6。结果在35个接种材料中，丛生芽诱导率为5.7％，好于对照组的4％。
实施例6其它同实施例1，步骤(3)中，诱导时间为30天，培养条件为28℃，光强1500Lx，光照时间12小时/天。培养基配方为1/2MS，0.1mg/LBA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖30g/L，活性炭0.5g/L，pH5.8。结果在接种的50个材料中，丛生芽诱导率为18％，明显好于对照组。
实施例7其它同实施例1，新增步骤——丛生芽的增殖中，培养时间为25天。培养条件为25℃，光强2000Lx，光照时间12小时/天。培养基为1/2MS，0.1mg/LNAA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖25g/L，活性炭0.5g/L，pH5.6。结果在接种的30瓶材料中，增殖倍数为2.3，明显好于对照组的1.2。
实施例8其它同实施例1，新增步骤——丛生芽的增殖中，培养时间为25天。培养条件为28℃，光强3000Lx，光照时间10小时/天。培养基为1/2MS，0.2mg/LNAA，50％香蕉汁100mL/L，蔗糖30g/L，活性炭0.5g/L，pH5.8。结果接种的30瓶材料中，增殖倍数为17.2，明显好于对照组。
实施例9其它同实施例1，步骤(4)的培养基采用N6+10％香蕉汁+0.2mg/LNAA+2mg/LBA，培养条件为25℃、光照1500Lx，光照时间为10小时/天，培养时间为60-90天，结果瓶苗的苗高为4.6cm，明显好于对照组的2.5cm。
实施例10其它同实施例1，步骤(5)中，将达到出瓶标准的瓶苗，轻轻拉出培养瓶，小心洗净所附着的培养基，在阴凉处凉20小时后，将其栽培于培养基质上，培养基质选用商用水藓，栽植后7天之内不淋水，一个月后，开始施肥。施肥每周2次，用0.3％的复合肥叶面喷施。结果成活率为83.5％。
实施例11其它同实施例10，瓶苗在阴凉处凉30小时，栽植于水藓后10天之内不淋水，复合肥浓度为0.5％。结果成活率为96.3％，与对照组相近。
根据对实施例1-11的统计，本方法从外植体杀菌到练苗完成，具体比率(平均值)如下如接种外植体数量为100个，杀菌后未染菌数量83.3个，经培养有20.825个腋芽萌发，诱导产生的丛生芽数量为3.748个，增殖一代为64.47个，二代为1108.96个，三代为19074个。
权利要求
1.一种金钗石斛的快速繁殖方法，包括(1)外植体的选择与灭菌；(2)腋芽的萌发；(3)丛生芽诱导；(4)成苗培养；(5)练苗和移栽等步骤，其特征在于在步骤(3)和(4)之间还包括“丛生芽增殖培养”步骤，即将已经通过丛生芽诱导的材料培养在下列培养基中1/2 MS、NAA 0.1-0.2mg/L、50％香蕉汁100mL/L、蔗糖25-30g/L、活性炭0.5g/L，pH为5.6-5.8；培养条件为温度25-28℃、光强2000-3000Lx；培养时间为25-30天，光照时间为10-12小时/天。
2.如权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(1)中，选用二年生茎段为外植体，首先用300-500mg/L的多菌灵溶液浸泡2-4小时，然后用70％乙醇杀菌1-2分钟，再用0.1％氯化汞杀菌15-20分钟，最后用12％次氯酸钠杀菌0.5-1分钟。
3.如权利要求2所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(2)中，所采用的培养基配方为1/2MS、0-1mg/L BA、0-1mg/L NAA、50％香蕉汁100mL/L、蔗糖25g/L、活性炭0.5g/L，pH为5.6-5.8；培养条件为温度25±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为8-10小时/天，培养时间为28-32天。
4.如权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(3)中，所采用的培养基配方为1/2MS、0.1-0.5mg/LBA、50％香蕉汁100mL/L、蔗糖25-30g/L、活性炭0.5g/L，pH为5.6-5.8；培养条件为温度25-28℃、光强1500-2000Lx；光照时间为10-12小时/天，培养时间为28-32天。
5.如权利要求4所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(4)中，所采用的培养基配方为MS或N6+10％香蕉汁、0.1-0.2mg/LNAA、1-2mg/LBA；培养条件为温度25±1℃、光照1500-2000Lx；光照时间为8-10小时/天，培养时间为60-90天。
6.如权利要求5所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(5)中，将洗净培养基的瓶苗在阴凉处晾20-30小时，缓慢降低其含水量，然后将其栽培于商品水藓中，栽培后7-10天内不浇水，一个月后，开始每周施肥2次，用0.3-0.5％的复合肥叶面喷施。
7.如权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于在步骤(2)中，激素浓度采用0.1mg/L NAA+1mg/L BA；步骤(3)中，BA的浓度是0.5mg/L；“丛生芽增殖培养”步骤中，NAA浓度是0.2mg/L；在步骤(5)中，晾的时间为24小时，栽培后不浇水的时间是10天。
全文摘要
金钗石斛的快速繁殖方法，在现有技术五步骤的“丛生芽诱导”步骤之后增加“丛生芽增殖培养”，该步骤采用1/2MS+0.1－0.2mg/LNAA+50％香蕉汁100ml/l+蔗糖25－30g/l+活性炭0.5g/l培养基，培养条件为25－28℃，光强2000－3000Lx，培养时间25－30天，光照10－12小时/天。本方法具有繁殖快、成本低、种苗生长整齐、练苗简便、遗传稳定性好、外植体易得等优点。
文档编号A01H4/00GK1402971SQ0213475
公开日2003年3月19日 申请日期2002年9月17日 优先权日2002年9月17日
发明者叶庆生, 刘伟, 王小菁 申请人:华南师范大学