用于核移植的卵的制备方法及其用途的制作方法

专利名称：用于核移植的卵的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种将卵去核的方法，特别是将用作核移植技术中的受体细胞的卵去核的方法。
背景技术：
利用核移植(nuclear transfer)方式进行胚胎克隆的第一个实例在1952年完成(Briggs和King，Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 38 455-461(1952))。之后，已经在多个物种中实施了核移植，“Dolly”绵羊的出世使之达到了顶峰(Campbell等，1996，自然380 64-66)。
通过将一个供体核移植到一个去核的卵母细胞或单细胞受精卵所进行的胚胎重建可以生成遗传学相同的个体。这对于研究(换而言之，作为生物学对照)以及在商业应用上(也就是，繁殖遗传学优势的家畜及肉制品的均一性)都有着显著的优点。核移植也形成了发展遗传学修饰家畜品种的有效方法的基础。如果供体细胞已经被遗传学修饰，那么在核移植后发育成的动物就包含有这种遗传学修饰(McCreath KJ，HowcroftJ，Campbell KH，Colman A，Schnieke AE，Kind AJ.(2000)自然4051004-1005)。
核移植(nuclear transfer或nuclear transplantation)技术包括将来自一个细胞的完整的细胞核转移到另一个已经去除或破坏了细胞核DNA的细胞中。特别的，这个过程包括将供体细胞核引入到受体卵或卵母细胞的细胞浆中，因此该受体卵或卵母细胞从供体细胞核中获得了遗传物质并具有了发育成一个胚胎的能力，这个胚胎将发育成能存活的成年动物。
为了利用核移植技术成功地生成一个动物个体，将供体细胞的细胞核转移到一个去核的受体卵中是必要的。所有两栖动物、哺乳动物和鱼类的成功的核移植方法都要求在引入供体细胞核之前将受体卵去核，该供体细胞核取代受体卵的细胞核并指导发育。去核包括将受体卵的细胞核去除或失活。
受体卵可以是未受精的卵或刚受精的受精卵阶段的卵。如果卵还没有受精，它将含有雌性前核(pronucleus)，后者必须被去除或失活。如果该卵已经受精，它将含有雌性前核和受精后来自精子的一个雄性前核或多个雄性前核。在用供体细胞核取代之前，每个前核都必须被去除或失活。
因此受体卵的去核是核移植方法中一个主要的限制步骤。至今，多种方法已经被应用。
在诸如蟾蜍的两栖动物中，通常利用紫外线照射方法进行去核，该方法通过破坏DNA将细胞核失活(Gurdon，1986 J.Cell.Sci.Suppl.4287-318)。另一种已经应用于诸如豹蛙(leopard frog)卵的两栖动物卵的去核方法是用针头人工操作去核。
在哺乳动物中，通常利用微吸管物理去除卵细胞的细胞核而进行去核(见例如，Campbell等，1996，自然380 64-66；Wakayama等，1998，369-374)。
在鱼类中，物理去核已经被用于制备用于斑马鱼核移植的受体卵(Lee等，自然生物技术，2002，8月；20(8)795-9)。利用X射线对未受精的鳉鱼(medaka fish)卵母细胞进行的去核已经被报道(Wakayama等，PNAS(2001)98，1071-1076)。
然而，尽管在许多物种中已经获得了成功的去核，但在已知的方法中始终存在着问题。例如，物理去核对技术有着很高的要求且成功率低；紫外线照射伴有热的产生，这可能对细胞造成不可接受的损伤；而X射线去核要求高剂量的X射线，这同样可以对细胞造成不可接受的损伤。
因此，去核步骤仍然是核移植实验中的一个主要限制步骤并且可能是非常难以完成的。这个问题对于禽类细胞是特别重要，这是因为禽类的卵的独特结构，它是特别难以进行成功的去核。雌性前核位于胚盘，胚盘为卵黄表面的一个直径为近乎2毫米的白点。
禽类的卵包括大量的卵黄，比较于其他动物的卵，它非常大并且易碎。因此对它不能象对两栖动物、哺乳动物或鱼的卵那样轻易地进行操作。当尝试用物理去核方法时，发现了一些问题比如禽类的卵中的前核不容易看到并因此很难被人工操作去除。对禽类的卵进行紫外线照射同样是不令人满意的。对应用紫外线照射雌禽的卵的评估显示终止受精卵发育所需的紫外线剂量产生了如此多的热量以致损坏了卵。X射线是不适用的，因为所需的高剂量和照射持续时间可能对细胞造成不可接受的损伤。
因此，可以看到提供另一种有效的去核方法是有意义的，尤其是一种能用于有效地对禽类的卵进行去核的方法。
本发明的进一步的目的是提供了一种将卵去核的方法，这种方法不会对卵造成令它们不能再被用于核移植方法的损伤。
本发明的仍进一步的目的是提供一种简单和快速的去核方法。

发明内容
本发明人已经惊奇地发现γ射线可以用于有效地将卵去核，特别是禽类的卵，因此由被照射卵的细胞核所指导的发育将停止，但是转移到被照射卵的供体细胞核所指导的发育可以继续。
根据本发明的第一方面，提供了一种通过将卵暴露于γ射线照射以将卵去核的方法。
优选地，使用的γ射线的剂量要足够高，以便能有效地终止被照射卵的细胞核所指导的卵或由其产生的胚胎的发育，但也要足够低，以便使得转移到该去核卵的细胞核能指导卵或胚胎的发育。
因此，该剂量使得被照射细胞核不能指导任何的发育。因此，由被照射卵的细胞核在照射之前所指导的任何发育将被终止且由该被照射卵的细胞核所指导的任何发育将被阻止。任何随后的发育均由转移到去核卵中的细胞核所指导。
本发明的方法可以用于任何动物的卵，例如，哺乳动物、两栖动物、禽类、爬行动物或昆虫的卵。在优选的实施方案中，卵为禽类的卵。
在本发明的方法中所使用的卵可以是未受精的卵或刚受精的受精卵阶段的卵。
将卵暴露于γ射线的时间可以长到能给予有效的照射以终止被照射卵的细胞核所指导的发育，及短到使得该卵能用于作为核移植技术的受体卵。如果卵没有受精，所用剂量将能有效地终止同等的受精卵的发育。例如，所用剂量应当是足够短，以使得转移到卵的供体细胞核能指导该卵或来源于该卵的胚胎的发育。
暴露于照射的时间、每分钟的剂量和应用于卵的总剂量依赖于许多因素，例如卵的大小和类型。
在本发明优选的实施方案中，卵暴露于γ射线的时间在1分钟到10分钟的范围内，例如，2到5分钟，优选的为2到4分钟。在本发明另一个优选的实施方案中，卵暴露于γ射线的时间为1到3分钟的范围。
优选地，每分钟的照射剂量范围为每分钟2到25Gy的照射剂量，例如，每分钟2到20、2到15、2到12、2到10、2到8、2到6、5到25、10到25、15到25、5到10、5到15或10到15Gy。
在一个优选的实施方案中，将卵暴露于每分钟15Gy到每分钟25Gy的照射剂量，例如每分钟18.6Gy的照射剂量。在这个实施方案中，优选地，利用爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所的RX20/53M辐射器测定照射剂量。
在另一个优选的实施方案中，将卵暴露于每分钟2Gy到每分钟12Gy的照射剂量。
使用的γ射线照射的总剂量优选的为大于7Gy，例如，大于8Gy，优选的大于9Gy，更优选的大于10Gy，还更优选的大于11Gy，最优选的大于12Gy。
在特别优选的实施方案中，照射的总剂量为12和14Gy之间，例如12.8Gy。
优选的，将卵暴露于10和62.5Gy之间的总照射剂量，例如，10和50、10和40、10和30、20和62.5、20和50、20和40、20和30、30和62.5、30和50、30和40、40和62.5、40和50以及50和62.5Gy之间。
在一个优选的实施方案中，将卵暴露于37Gy和62.5Gy之间的总照射剂量，更优选的为42.5Gy和47.5Gy之间的总照射剂量，甚至更优选的总剂量为44到45Gy范围内。优选的，在这个实施方案中，利用爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所是RX20/53M辐射器测定照射剂量。
在另一个优选的实施方案中，将卵暴露于6Gy到18Gy之间的总照射剂量。在一个特别优选的实施方案中，总剂量为约12Gy，例如12.8Gy。
最优选的照射是在进行核移植操作之前进行，最优选的是在即将注射供体细胞核之前立即进行。
本发明还提供了根据本发明的第一方面进行去核的卵以及它们在核移植技术中的应用，例如重建一个动物胚胎。
因此，在本发明的第二方面提供了一种产生动物胚胎的方法，其中该方法包括依照本发明的第一方面的方法将卵去核，将供体细胞的二倍体细胞核转移到去核的卵中，并使得到的胚胎发育。
供体细胞核可以来自任何合适的细胞，它可以是完全或部分分化的细胞或未分化的细胞。细胞可以是体外培养或体内提取的。唯一的限制是供体细胞要有着正常的DNA含量和正常的核型。在WO 96/07732中描述了有用的细胞来源。
为了利用本发明的方法产生转基因胚胎和动物，可以利用本领域已知的任何方法对供体细胞核进行遗传学修饰。例如，微注射法、物质转化或转染，例如电穿孔、病毒转染或脂染法。
为了实现核移植，可以使用本领域已知的任何适当的方法，例如细胞融合或微注射法(Ritchie和Campbell，J.Reproduction and FertilityAbstract Series No.15，p60)。
更多的利用核移植技术生产胚胎的有效方法的细节可以在WO96/07732和WO 97/07668中找到，它们的内容将在此一并作为参考。
根据本发明的第三方面，提供了一种利用本发明的第二方面的方法产生的可存活的重建动物胚胎。
根据本发明的第四方面，提供了一种制备动物的方法，其步骤包括(a)根据本发明的第二方面生产胚胎以及(b)使重建的胚胎发育成动物。
本方法可以进一步包括步骤(c)喂养步骤(b)中所形成的动物。
本发明的方法所产生的动物形成了本发明的另外一个方面。
使胚胎在体内或体外发育到足月。其中如果胚胎是哺乳动物，胚胎必须被转移到雌性受体中发育到足月。然而，可以在体外将胚胎发育到胚囊阶段，然后将胚胎转移到受体代理母体，代理母体携带胚胎到足月。然而，如果胚胎是鱼或两栖动物，例如蛙，那么可以将卵保持在卵能正常发育的体外简单的溶液中。
在本发明的优选的实施方案中，卵为一种禽类的卵。如上所述，禽类和其他脊椎动物的卵的差异在于胚胎发育发生在坚硬的卵壳内。
在本发明的这个方面的优选的实施方案中，其中卵是一种禽类的卵，可以将胚胎转移到雌禽的受体输卵管中，使之被产卵于坚硬的卵壳内。
在优选的实施方案中，利用WO 90/13626所描述的技术的改良，可以使禽类的胚胎在体外或在宿主的卵壳中发育到足月。根据本发明的这个方面，将卵从雌禽中取出，根据发明的第一方面将其去核，与受体细胞核融合生成胚胎，并使其在宿主卵壳中发育到孵化。
本发明的这个方面的基本方法可以包括●从雌禽中取出未受精的卵或刚刚受精的卵；●将卵转移到一个制备好的宿主卵壳中；●根据本发明的第一方面进行去核；●将供体细胞或细胞核引入到胚盘中；●将例如从新鲜卵中收集得到的例如卵清的介质加入到卵壳内的经过注射的卵中；●例如用塑料盖覆盖卵并放置于孵化器中孵育，例如在5％二氧化碳，41℃下孵育24小时；●加入更多的介质，用例如密封膜密封卵并孵育，例如在37.5℃下孵育3天；●任选地，将该卵的内容物转移到一个更大的卵中，以留下足够胚胎发育的空间；●孵育直到孵化。
本发明进一步提供利用本发明的方法产生的动物。


本发明现在将仅以实施例的形式进行阐述，并参照下图，其中图1是典型的核移植过程的总体示意图。
具体实施例方式
实施例1核移植方法(如同图1所示)主要包括以下步骤首先从供体动物2中提取并培养细胞1，以及从另一个动物7的受体卵细胞4a中去除细胞核3，然后将从第一个动物中提取的细胞与去核的卵细胞4b融合，得到一个融合细胞5，培养细胞5并将其移植到代理母体6。该移植的卵可以发育成克隆的动物8。
对于成功的核移植步骤，受体卵细胞的去核是目前可获得的核移植方法中非常重要和限制性的步骤。
在本实施例中，γ射线照射被用于将禽类的卵去核。使用的γ射线照射源是英国爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所的RX20/53M辐射器。
为了终止在雌禽新产的卵中的胚胎发育，将卵暴露于γ射线照射下2.5分钟。为了确定抑制受精的受精卵发育所需的近似剂量，从产卵雌禽中取出受精卵阶段的蛋，然后用γ射线源照射2.5分钟提供将近45Gy的照射剂量。
初步结果显示每分钟15-25Gy(优选的每分钟18Gy)的剂量照射1到3分钟能有效地终止新产的卵中的胚胎的发育。发现1到3分钟37Gy的总剂量是有效的，44Gy或45Gy也是有效的。本实施例中所提及的所有剂量都是用英国爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所的RX20/53M辐射器(Gravatom工业公司(Gosport，Hampshire))进行测定。
为了确定抑制受精的受精卵发育所必需的大约剂量，将受精卵阶段的卵从有生育能力的产卵雌禽中取出，并用加热的孵育器将其转运到γ射线照射源。然后这些卵被照射一系列不同的时间，然后培养以评价这些胚胎最后的发育能力。对对照卵也进行相同的操作，除了不被照射。其中一个实验的结果显示在表1中。
表1显示对卵的处理和转运造成了对照胚胎的不正常发育，正常预期60％的卵将正常发育。在本实施例中，只有30％的卵正常发育。然而，进一步的研究说明除去将卵转运到照射源的要求将避免对照卵的问题。
表1γ射线照射大酒瓶(magnum)覆盖的受精卵

注解收集受精卵并放置于宿主卵壳中；用可移动培养箱(39℃)将其从Roslin研究所转运到爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所；培养最多到7天Nd＝无发育Sb＝小囊胚层Lb＝大囊胚层3d，5d，7d＝发育阶段的天数正常发育＝7天表中显示的数据说明γ射线照射能完全抑制或严重损害被照射胚胎的发育。
实施例2正确确定γ射线照射剂量方法校正实施例1中使用的RX20/53M辐射器照射源显示在低剂量时，该机器高估了应用于目标的γ射线剂量。为了更准确地评估抑制被照射细胞核所指导的胚胎发育和使得转移到被照射卵的受体细胞核能指导发育的照射最小剂量，利用爱丁堡输血所的Nordion国际公司的Gammacell3000 Elan机器重复照射实验。
照射前卵的制备和照射后对卵的处理与对实施例1所描述的试验中所使用的卵的处理是一致的。
简要的，将大酒瓶所覆盖的来自能生育雌禽的卵放置于“I期”培养宿主卵壳中(受精到囊胚层形成一见WO 90/13626)，用单层纱布覆盖于卵黄以阻止胚盘干燥，并将其放置于高湿度的，5％CO2/42℃的孵化器中。
将被照射的卵转移到湿化加热(37℃)的转移盒中，并转送到辐射器。37℃的转运孵化器含有水以保持高湿度，以及在转运到爱丁堡的照射源前将30秒中等CO2气流引入到移动孵化器中，并在卵上放置泡沫。
每次取2个卵，并放置在辐射器罐中。
将卵分成对照和处理组，处理组被照射。将实施例2的卵分为四组处理组1(照射总剂量为6.4Gy)、对照组1(照射总剂量为0Gy)、处理组2(照射总剂量为12.8Gy)和对照组2(照射总剂量为0Gy)。照射后(处理组的卵)，将卵放回箱内。当所有的卵被处理后，孵育箱被转运回实验室，其中它们被放回5％CO2/42℃的孵化器中。
实施例2结果如上所述，将实施例2的卵分为四组处理组1(照射总剂量为6.4Gy)、对照组1(照射总剂量为0Gy)、处理组2(照射总剂量为12.8Gy)和对照组2(照射总剂量为0Gy)。
在照射后3天用Hamburger和Hamilton(1951)J.Morphol.88，49-92分级来评估受精卵的发育。
结果显示于表2和3中。
表2受精卵的1分钟(6.4Gy)照射

3天后正常的发育应为17级(Hamburger和Hamilton，1951)。
SB小囊胚层LB大囊胚层Nd无发育15，16，17依照Hamburger和Hamilton(1951)的分级
sm小avirreg平均15级但不规则的形态nfd不再发育用对照的受精卵获得正常发育。
3个被照射的受精卵虽然发育成胚胎，但滞后到15级且小或形态不规则。
表3受精卵的2分钟(12.8Gy)照射

仅仅4/7的对照卵正常发育2分钟的照射造成胚盘的不再发育(产下的卵囊胚层大约为3mm)，一些出现空泡。
实施例3通过核移植产生胚胎用实施例2所描述的方法将受体卵去核。
简要的，将大酒瓶所覆盖的来自能生育雌禽的蛋放置于“I期”培养宿主卵壳中(受精到囊胚层形成—见WO 90/13626)，用单层纱布覆盖于卵黄以防止胚盘干燥，并将其放置于高湿度的，5％CO2/42℃的孵化器中。
将被照射的卵转移到湿化加热(37℃)的转移盒中，并转送到辐射器。37℃的转运孵化器含有水以保持高湿度，以及在转运到爱丁堡的照射源前将30秒中等CO2气流引入到转移孵化器中，并在卵上放置泡沫。
取卵并放置在辐射器罐中，用总剂量为12.8Gy的γ射线照射2分钟时间。照射后，按下面所描述的将细胞微注射到卵中。
将2μl的细胞悬浮液吸取到显微镜的玻片上并形成小滴。将研究装置微细管控制器所操纵的玻璃微细管(尖端被斜削成30°角，直径为25-30μm)降低，以浅小的角度进入小滴以致尖端刚刚接触到玻片表面。利用手工操纵的注射器通过负压控制将细胞吸入到微细管中。当细胞升至液面时，通过吸纳细胞悬浮液和排出过多的溶液将1-10个细胞装载于最小量的体积中(小于0.5nl)。
移开玻片，并调整显微镜的焦点以提供一个适合注射卵的物镜下的工作距离。将用纱布层从卵黄中取出的卵放置在显微镜下并定位胚盘。调整放大倍数使得整个胚盘(大约3mm)充满整个视野。将微细管以45°的角度降低到胚盘中心上方的位置，并用微操作器控制使得刚刚穿入卵黄膜和穿透将近50μm到胚盘细胞浆中。然后增加放大倍数以观察穿刺位置，使得更好地评估进入的深度。用涂料在距离尖端50μm处标记微细管以判断深度。用手工控制的空气注射器尽可能慢地注射入细胞悬浮液。注射后撤出针头，应用新的纱布层，重新放置petridish盖，将卵放回5％CO2/42℃的孵化器孵育过夜。
从供体雌禽中取出卵后24小时，将经过注射后的卵转移到“II期”培养(胚胎形态发生，见WO 90/13626)，并监测这些卵。
可以看出这个方法比目前的去核方法有着很多优点，例如，可以在对卵不造成能阻止它应用于核移植实验的损害下对禽类的卵进行去核。如果有需要，这也是一种应用于其他动物的合适的方法。
在本说明书中所提及的文献在此一同并入作为参考。对于本发明的实施方案的各种修改和变更并不脱离本发明的范围和精神，这对本领域人员来说是显而易见的。事实上，对本领域人员而言是显而易见的那些对实施本发明所描述的方案的各种修改都是被本发明所包括的。例如，剂量、总剂量和该剂量可以被给予的时间都可以根据要求进行修改。
权利要求
1.一种将卵去核的方法，其中将卵暴露于γ射线照射下。
2.根据权利要求1的方法，其中γ射线照射的剂量要足够高以便使得该卵可以被用于核移植方法中。
3.根据权利要求2的方法，其中γ射线照射的剂量要足够高以便终止被照射卵的细胞核所指导的卵或由其产生的胚胎的发育，而且γ射线照射的剂量还要足够低以便使得转移到该去核的卵中的细胞核能指导卵或胚胎的发育。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述的卵暴露于γ射线照射下1至3分钟。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述的卵暴露于照射下，照射剂量为每分钟2Gy到每分钟12Gy的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中γ射线照射的总剂量为大于7Gy。
7.根据权利要求6的方法，其中γ射线照射的总剂量为大于10Gy。
8.根据权利要求7的方法，其中γ射线照射的总剂量为大于12Gy。
9.根据权利要求8的方法，其中γ射线照射的总剂量为12Gy到14Gy的范围内。
10.根据权利要求8的方法，其中γ射线照射的总剂量为37Gy到62.5Gy的范围内。
11.根据权利要求10的方法，其中γ射线照射的总剂量为44.5Gy到47.5Gy的范围内。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述的卵为禽类的卵。
13.一种产生动物胚胎的方法，该方法包括利用根据权利要求1到12中任一项的方法将细胞去核的步骤。
14.一种产生动物胚胎的方法，该方法包括根据权利要求1到12中任一项的方法将卵去核，将供体细胞的二倍体细胞核转移到该去核的卵中，以及使形成的胚胎发育。
15.根据权利要求13或权利要求14的方法，其中所述供体细胞是经过遗传学修饰的。
16.一种制备动物的方法，包括步骤(a)根据权利要求13到权利要求15中任一项的方法产生胚胎；以及(b)使所述胚胎发育成动物。
17.根据权利要求16的方法，当从属于权利要求12时，其中所述方法进一步包括将所述胚胎转移到受体雌禽，使所述胚胎产于具有硬壳的卵中并使所述胚胎发育和孵化成幼禽的步骤。
18.根据权利要求16的方法，当从属于权利要求11时，其中所述的胚胎可离卵发育。
19.根据权利要求16的方法，当从属于权利要求11时，其中所述的方法包括根据权利要求1到11中任一项的方法将卵去核，将供体细胞核转移进该卵中，并使胚胎在宿主卵壳内发育到孵化的步骤。
20.根据权利要求16到19中任一项的方法，进一步包括自步骤(b)中形成的动物进行繁殖的步骤(c)。
21.一种利用根据权利要求1到12中任一项的方法被去核的卵。
22.一种利用根据权利要求13到15中任一项的方法产生的胚胎。
23.一种利用根据权利要求16到20中任一项的方法产生的动物。
全文摘要
一种通过将卵暴露于γ射线照射下而将卵去核的方法。使用的γ射线照射剂量要足够高以便终止被照射卵的细胞核所指导的卵或由其产生的胚胎的发育，而且还要足够低以便使得转移到该去核的卵中的细胞核能指导卵或胚胎的发育。
文档编号A01K67/027GK1604735SQ02824919
公开日2005年4月6日 申请日期2002年12月13日 优先权日2001年12月13日
发明者海伦·桑, 艾德里安·舍曼 申请人:维尔基公司