专利名称：多种抗病基因聚合小麦品种的培育方法
技术领域：
本发明涉及作物抗病育种领域中抗病小麦品种的培育方法，特别是涉及多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育方法。
背景技术：
小麦黄矮病是世界小麦主要病害之一，几乎所有生产小麦的国家都有发生。小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒引起的，该病毒是黄症病毒属的代表成员，是一种单体正链RNA病毒，粒体形态为二十面体(T＝3)，六角形，直径25～30nm，无包膜，内核由基因组RNA构成。基因组为5.6～5.9kb，3’端无poly(A)尾。大麦黄矮病毒是由蚜虫传播的，在我国，导致小麦发病的黄矮病毒至少有4种株系类型，分别为GPV、GAV、PAGV和RMV。PAGV、GPV和GAV的致病性较强，RMV的致病性最弱。4种株系传毒介体的成、若蚜都能传播病毒，麦二叉蚜是黄矮病毒GPV，GAV和PAGV等3种强致病性株系的有效传毒介体。病毒从染病植物的筛管侵染开始，导致韧皮部坏死，阻碍运输，延缓生长，并使叶绿素减少。染病后的小麦会出现叶片黄化(桔黄色)，甚至植株矮化最终枯死等症状，造成产量严重损失。
对偃麦草属黄矮病的抗性进行研究，相继在中间偃麦草(Elytrigia intermedia(Nost)Nevski.)，蔓生偃麦草(Ely trigiarepens(L)Desv)和偃麦草(Ag.pulcherrimum)中发现了一些抗病材料，并通过与普通小麦杂交将含有抗性基因的染色体片段成功地导人了普通小麦，育成了一批可在小麦育种上利用的抗黄矮病种质。
Cauderon将普通小麦Vilmorin27(AABBDD，2n＝42)与中间偃麦草(E1E1E2E2XX，2n＝42)杂交育成二体异附加系L1(2n＝44＝21II+1II)(Cauderon Y，B Saigne，M Dauge，et al.InProc.4th.Wheat Genet Symp，Missouri.Columbia，1973，401～407)。研究表明，L1附加的一对染色体为中间偃麦草染色体7X，抗BYDV基因位于7X长臂上，为显性单基因，L1中含有中间偃麦草中2条染色体(EE)，这2条染色体携带着抗小麦黄矮病、锈病等多种基因。辛志勇、徐惠君、陈孝等从以L1为抗源通过中国春Ph基因隐性突变体诱导部分同源染色体重组的后代中，选育出高抗小麦黄矮病的新种质PP9-1(中国科学B辑，1991，(1)36～42)。
小麦白粉病(Erysiphe graminis f.sp.tritici)是一种世界性真菌病害，病菌通过空气传播，过去主要发生在气候较温和、潮湿多雨的局部地区，由于水肥条件不断提高、种植密度加大，为白粉病发生流行提供了良好的田间环境，导致小麦白粉病危害地区和发生频率逐年扩大，居锈病、纹枯病、赤霉病等四大病害之首。长期以来，人们一直重视小麦白粉病的研究工作，把培育抗病品种作为防治小麦白粉病的基本途径。自1930年澳大利亚学者Water house首次报道了小麦品种Thew携带一个显性抗白粉病基因以来，抗病基因的研究得到各国科学家的广泛关注。迄今已报道的白粉病抗性主要由主基因控制，其基因符号为Pm(Powdery mildew)。已鉴定出30个抗病基因，分基因编号为Pm1到Pm30，分布在24个位点上，其中包括8个复等位基因。另有1个基因(Mld)尚未正式定名。其中抗性基因来自普通小麦的15个，四倍体小麦10个，二倍体小麦1个，黑麦4个，山羊草3个，簇毛麦1个，来源不确定的3个。根据植物病理学家鉴定Pm10、11、14、15只抗禾本科杂草白粉菌，根本不抗小麦白粉病菌。目前对我国小麦白粉病菌抗性有效的基因是Pm2、4b、2+6、12、13、16、20、21、22、30等。其中Pm4b基因来自于普通小麦近缘种的四倍体小麦。
小麦条锈病(puccinia striiformisf.sp.tritic)是由条形柄锈菌引起的一种广泛流行的世界性病害。对我国华北，西北，西南，黄淮麦区小麦生产造成经常性的威胁，其他麦区也常有流行。迄今为止共发现23个抗条锈基因位点，分别命名为Yr1-Yr23(Yellow rest)，其中包括3个复等位基因，即26个主效基因。Yr1-Yr10，Yr15-Yr23已经被定位在染色体或染色体臂上。这些基因从抗性上可分为两种类型，Yr1-Yr10，Yr15，Yr17-Yr23为苗期和成株期小种专化性基因；Yr11-Yr14和Yr16为成株期抗性基因。从基因来源上可分为两类来源，一类来自普通小麦；另一类来自小麦的近源种属。Yr5，Yr8，Yr9和Yr15分别来自斯卑尔脱小麦，顶芒山羊草，黑麦和野生二粒小麦。其余基因均来自普通小麦。在已经命名的抗条锈病基因Yr1-Yr18中，大多数基因表现为显性遗传，但在一些品种中抗条锈基因的显隐性依生理小种，杂交组合(遗传背景)，品种与小种的相互作用以及感染时期的不同而表现不同。例如Yr2，Yr6，Yr9在某些杂交组合中表现为隐性遗传。丰抗13是我国抗条锈病较好的推广品种。
小麦叶锈病也是小麦的主要真菌病害之一，70年代末，河北省石家庄以南叶锈病突发流行，波及河南和山东麦区，产量受到严重损失。以后年度间，病情略有起伏。“六五”期间，抗叶锈病品种占17.3％，“七五”期间为10.5％，“八五”期间，在30个育种单位提供的2524份品种(材料)中，抗病的只有5.4％。应加强叶锈病抗源的筛选和利用。
近年来，小麦秆锈病流行区已从东南沿海、长江流域麦区转向西南麦区。云南、四川、湖北、湖南、豫西南等麦区已普遍发生秆锈病，严重地块减产20-30％，少数重发年份甚至造成了绝收。发病地块在收割时，地表甚至覆有一层显而易见的红褐色真菌孢子粉。秆锈菌能形成自体循环，并不断向外输出初始菌源。
上述5种病害的属性、传播方式不同，发病条件有差异，但可在同一麦区流行危害，甚至在同一年份共同发生。因此，选用兼抗多种病害的品种不但可以控制病害的流行，对多种病害进行综合治理，还可提高品种的种用价值，延长品种的使用寿命。实践证明由于每个基因的来源、背景不同，多个基因的联合作用往往优于单一基因。例如，“洛类”系列品种中含有一段黑麦染色体片段(1B/1R)，该片段同时含有抗白粉病的Pm8基因和3个抗锈病基因(Yr9、Sr31、Lr26)，“洛类”品种曾经是我国20世纪80-90年代推广品种的主要抗源和亲本。目前报道的抗病品种(品系)多是抗同一病害，或同一病害不同抗性基因的累加，兼抗二种或二种以上病害的品种(品系)鲜见报道。
把多种来源不同的基因聚合或累加在一起，传统上一般采用的是人工杂交的方法，将2个或2个以上分别携带不同基因的材料进行一次或多次杂交，从分离后代选择含基因聚合的单株，然后繁殖成群体。这种方法使聚合或累加的基因在纯合过程中时间(世代)较长，聚合的基因越多，时间越长，而且育成的品种总会或多或少地存在杂合基因，群体抗性稳定性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育方法，该方法育种时间短，获得的品系抗性稳定。
一种多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育方法，包括以下步骤1)选择抗黄矮病的单株PP9-1作为母本，以推广小麦品种作为父本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗黄矮病的单株作为下一轮抗病基因聚合的母本；3)以含有Pm4b基因的四倍体小麦为父本，以抗条锈病的推广小麦品种为母本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本；4)将上述得到的用于下一轮抗病基因聚合的母本及父本进行杂交；5)杂种后代自交，自自交后代中选择同时具有黄矮病和白粉病抗性的植株，并对该植株的花药进行培养；6)花药培养过程中经自然加倍，得到兼抗多种病害的普通小麦品系。
所述第一步中的推广小麦品种优选为陕7859或丰抗8号。
所述第三步中的推广小麦品种优选为丰抗13，所述回交进行3代为益。
所述第三步中以抗条锈病的推广小麦品种为母本进行杂交、回交后，再进行自交，自自交后代中选择抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本。进行自交可以改善下一轮抗病基因聚合父本的农艺性状和纯合度。所述自交进行4代为益。
所述用于花药培养的植株以自交的F2代植株为宜。
由于普通小麦本身所含的抗性基因在长期的使用过程中抗性下降，而且某些病害在普通小麦中没有抗性基因，选择小麦近缘种属的抗病基因为小麦育种中的抗源是解决上述问题的重要途径。本发明的发明人经过大量的实验，巧妙地选用普通小麦-中间偃麦草二体异附加系L1的杂交后代PP9-1和含有Pm4b基因的四倍体小麦作为外源抗病基因的供体。使获得多种基因聚合的抗病小麦成为可能。
花药培养的目的是快速纯合基因，缩短选育年限。从杂种F2田间鉴定后兼抗黄矮病和白粉病的植株中选取合适花药进行培养，花药培养过程中经自然加倍，产生再生植株。这些再生植株的基因型都是纯合的，后代不易发生显隐性基因分离现象，遗传性稳定。实验证实，选择在F2进行花药培养，花培后代的再生植株中出现多种基因聚合的概率大大高于F1时花培。
本发明利用生物技术和常规技术相结合的方法，使多个抗性基因聚合，而且选育过程中出现了个别基因产生变异，抗性增强的现象。用该方法得到的抗性品种，有利于限制多种病害的流行和扩展，增加品种抗病的持久性和地区适应性。具有深远的理论及实践意义。
图1为STS分析图谱。
具体实施例方式
实施例1、多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育，包括以下步骤1、以普通小麦-中间偃麦草二体异附加系L1的杂交后代PP9-1为母本，陕7859为父本，进行杂交，杂种1代苗期接种携有黄矮病病毒的蚜虫，以鉴定黄矮病抗性；2、选择高抗黄矮病的单株作为母本，推广品种丰抗8号作为父本进行杂交，自杂种1代中选择农艺性状较好、高抗黄矮病的单株作为下一轮抗病基因聚合的母本；3、以含有Pm4b基因的四倍体小麦波斯小麦为父本，以抗条锈病的推广小麦品种丰抗13为母本进行杂交；4、对杂种1代进行苗期白粉病抗性鉴定，选择抗白粉病的单株为父本，丰抗13为母本进行回交，回交连续3代；5、选择抗百粉病的单株进行自交4代，每代进行白粉病鉴定，保留抗白粉病的植株，选择F4农艺性状较好、高抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本；
6、将上述得到的用于下一轮抗病基因聚合的母本及父本进行杂交；7、杂种后代自交，F2苗期同时鉴定植株的黄矮病和白粉病抗性；8、自兼抗黄矮病和白粉病的植株中选取合适花药，利用常规方法进行花药培养，培养过程中经自然加倍，产生再生植株，具体方法是，将花药接种于C17培养基上，30天后产生愈伤组织，10天左右转到分化培养基上，分化出绿苗，适时转到壮苗培养基上，培养30天移栽田间。
9、从若干再生植株中经黄矮病、白粉病、条锈病、秆锈病和叶锈病鉴定和农艺性状的选择，选育出普通小麦兼抗多种病害的品系。
实施例2、本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对黄矮病的抗性鉴定1、田间抗性鉴定于田间对本发明兼抗多种病害的普通小麦品系、北京地区推广品种京411和中麦9号各50株接种饲毒(GPV和GAV株系)蚜，每株接种10头，40天后观察发病情况，本发明兼抗多种病害的普通小麦品系没有发现感病株，京411和中麦9号50株均感病，感病率均达到100％。说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系高抗我国现流行的2个BYDV株系GPV和GAV。
2、基因组原位杂交(GISH)分析原位杂交样片在荧光显微镜蓝色(B)荧光激发下中间偃麦草染色体杂交信号为黄色，小麦染色体背景为红色。GISH的结果表明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系根尖细胞有丝分裂中期染色体中有2条染色体端部出现黄色杂交信号，其余部分染色体呈红色，表明这2条染色体端部含有中间偃麦草的DNA片段，而且该染色体片段较小，由于本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的染色体构型2n＝21 II，说明是纯合的小麦-中间偃麦草小片段易位系。
3、RFLP分子标记检测选用位于小麦第7部分同源群染色体长臂端部，分别距着丝点104cM和115cM左右(Devos K M，M D Atkinson，C N Chinoy，et al.Theor Appl Genet，1992，83931～949)的2个探针Psr687和Wg380、限制性内切酶EcoR I和Dra I进行RFLP分子标记检测。发现Psr687与EcoR I酶切组合在L1和本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的DNA杂交带型中于2.1kb处均显示一条7XL的特征带，而本发明兼抗多种病害的普通小麦品系缺少8.6kb处的7DL特征带；Wg380与Dra I酶切组合在本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的DNA杂交带型中于10.0kb处显示一条7XL的特征带，而缺少6.3kb处的7DL特征带。说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系含有Xpsr687位点和Xwg380位点的7DL染色体片段已被7X染色体片段所代换。
实施例3、本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对白粉病的抗性鉴定1、小麦白粉病菌的抗性鉴定分别用28个生理小种编号在11-715之间的不同毒性的白粉病菌系接种苗期的本发明兼抗多种病害的普通小麦品系，调查抗性反应，结果表明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系高抗213号以下生理小种，对335号以后的生理小种感病。由于目前我国发现的白粉病菌主要以177号以下小种为主，毒性频率占90％以上，因此本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的抗性仍然有效。
2、抗性基因遗传分析小麦白粉菌15号小种接种鉴定结果表明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系高抗白粉病。本发明兼抗多种病害的普通小麦品系与感病品种京771、中国春的杂种F1代全部抗病，杂种F2代抗、感株比例分别为185∶52、123∶47，抗感分离符合孟德尔1对显性基因分离比例3∶1，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系含有1对显性抗白粉病基因。
本发明兼抗多种病害的普通小麦品系与供试的已知单显基因系Pm2、Pm4a、Pm6、Pm12、Pm13、Pm16测交的F2代抗感单株比均为15∶1，说明杂种中有2对基因，有此推断本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的抗性基因与上述基因不同。与Pm4b测交的F2代未发现感病单株，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系所含基因与Pm4b相同。
3、抗白粉病基因的分子标记1)抗感基因池(BSA)的构建从本发明兼抗多种病害的普通小麦品系与中国春杂交的F2代接种白粉病15号小种的抗感分离群体中，随机选取抗病和感病植株各10株，分别提取DNA，抗、感单株DNA按等体积比例混合构成抗病池和感病池。
2)STS特异引物PCR反应上游引物P15’-ACGAGTGATGCTCCAGGATATGG-3’；下游引物P25’-GATCCACCTTTTCCTTGACAAGC-3’；扩增反应体系为25μL，其中含模板DNA 40ng，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，4种dNTP各100μmol/L，Taq酶1U，引物各10μmol/L。反应条件为94℃，变性1分钟，随后进行30个循环96℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，最后72℃延伸10分钟。第一轮扩增后，从扩增产物中取3.0μL作为模板DNA，进行第二轮扩增。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳2小时左右，溴化乙锭中染色，紫外扫描仪上观察并照相。结果如图1所示，本发明兼抗多种病害的普通小麦品系、Pm4a、Pm4b及抗病池、抗病单株均扩增出一条1.7kb的特异带，而感病品种中国春及感病池、感病单株中无此带(图中第1泳道为Marker；第2泳道为本发明兼抗多种病害的普通小麦品系；第3泳道为中国春；第4泳道为Khapli/8*Cc(Pm4a)；第5泳道为VPM/百农3217×3(Pm4b)；第6泳道为抗病池；第7泳道为感病池；第8、10、12、14、16泳道为抗病单株；第9、11、13、15、17泳道为感病单株)，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系的抗性基因为Pm4。
实施例4、本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对条锈病的抗性鉴定1、田间鉴定以北京地区主栽品种京411为对照，用注射法接种CY27、CY28、CY29、CY30、CY31及它们的混合新鲜菌种，每次每品种接种25株。于京411充分发病时调查抗感植株，按有无病症分为抗、感二级，抽穗后再复查一次。结果表明，对照京411全部感病，本发明兼抗多种病害的普通小麦品系幼苗期和成株期对CY27、CY28、CY29、CY30、CY31及它们的混合小种均表现免疫，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对我国目前流行小种均高度抵抗。
2、抗病基因遗传分析用本发明兼抗多种病害的普通小麦品系与春性感条锈病品种京771杂交，得到F2群体。用涂抹法对(本发明兼抗多种病害的普通小麦品系/京771)F2及其双亲的2叶龄苗接种CY31小种的新鲜菌种，30天后调查抗感株数，然后移入温室，缓苗后接种白粉病15号生理小种，白粉病发病后调查抗感植株。
结果是87个单株中，66株抗条锈病，21株感条锈病，抗感比例为3∶1(如表1所示)。在抗白粉病的64株中，48株抗条锈病，16株感条锈病；感白粉病的23株中，抗条锈病的18株，感条锈病的5株，抗感比均为3∶1，表明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对CY31的抗性由1对显性基因控制。从表中也可看到本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对白粉病15号小种的抗性亦是由一对显性基因所控制。同时发现兼抗条白∶抗条感白∶感条抗白∶感条感白的单株比为9∶3∶3∶1，符合两对基因独立分配的比例，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系中含有的抗条锈病基因与抗白粉病基因在遗传上不存在连锁关系表1、F2群体对条锈病CY31和白粉病15号小种的抗性分离T
X20.05＝3.843、RAPD分析利用(本发明兼抗多种病害的普通小麦品系/京771)F2幼苗接种CY31后的抗感分离植株，常规方法提取DNA，组成抗感池。抗、感病池由20株抗、感单株的DNA等比混合而成。PCR扩增在25μl反应液中进行。其中模板DNA 50ng、MgCl21.5mmol/L、dNTP 0.1mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、随机引物(Operon公司产品)0.2μmol/L。共45个循环，每个循环的条件是95℃15s、37℃5s、72℃1min。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，共检测了520个引物。从520个引物中，仅筛选出一个引物OPY08(5’-AGGCAGAGCA-3’)在抗感池中有多态性。OPY08在本发明兼抗多种病害的普通小麦品系、抗病池DNA上可扩增出5种不同长度的DNA产物，而在感病池、京771及丰抗13号上扩增出4种不同长度的DNA产物，与本发明兼抗多种病害的普通小麦品系和抗病池相比，缺少一条700bp长度的DNA产物。可以认为本发明兼抗多种病害的普通小麦品系和抗病池具有的这条特异带OPY08700与本发明兼抗多种病害的普通小麦品系所携带的抗条锈病菌CY31基因相关。
实施例5、本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对叶锈病的抗性鉴定以5389品种为对照，用注射法接种叶锈PHT、THT、PCR、FHP等混合菌种，每次每品种接种25株。于叶锈病充分发病时调查抗感植株，病害反应型按0、1、2、3、4四级记载，抽穗后再复查一次。结果表明，对照5389全部感病，本发明兼抗多种病害的普通小麦品系幼苗期和成株期对PHT、THT、PCR、FHP等混合菌种均表现免疫和高抗，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对叶锈病具有高度抵抗能力。
实施例6、本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对杆锈病的抗性鉴定以701品种为对照，用注射法接种杆锈菌21号和34号小种群，每次每品种接种25株。于杆锈病充分发病时调查抗感植株，病害反应型按0、1、2、3、4四级记载，抽穗后再复查一次。结果表明，对照品种701全部感病，本发明兼抗多种病害的普通小麦品系幼苗期和成株期对杆锈菌21号和34号小种群均表现免疫和高抗，说明本发明兼抗多种病害的普通小麦品系对叶锈病具有高度抵抗能力。
权利要求
1.一种多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育方法，包括以下步骤1)选择抗黄矮病的单株PP9-1作为母本，以推广小麦品种作为父本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗黄矮病的单株作为下一轮抗病基因聚合的母本；3)以含有Pm4b基因的四倍体小麦为父本，以抗条锈病的推广小麦品种为母本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本；4)将上述得到的用于下一轮抗病基因聚合的母本及父本进行杂交；5)杂种后代自交，自自交后代中选择同时具有黄矮病和白粉病抗性的植株，并对该植株的花药进行培养；6)花药培养过程中经自然加倍，得到兼抗多种病害的普通小麦品系。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于所述第一步中的推广小麦品种为陕7859或丰抗8号。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于所述第三步中的推广小麦品种为丰抗13，所述回交进行3代。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于所述第三步中以抗条锈病的推广小麦品种为母本进行杂交、回交后，再进行自交，自自交后代中选择抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本。
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于所述自交进行4代。
6.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于所述用于花药培养的植株是自交的F2代植株。
全文摘要
本发明公开了一种多种抗病基因聚合小麦品种的培育方法，涉及作物抗病育种领域中抗病小麦品种的培育方法，目的是提供一种育种时间短，获得的品系抗性稳定多种抗病基因聚合的抗病小麦品种的培育方法，该方法包括以下步骤1)选择抗黄矮病的单株PP9－1作为母本，以推广小麦品种作为父本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗黄矮病的单株作为下一轮抗病基因聚合的母本；3)以含有Pm4b基因的四倍体小麦为父本，以抗条锈病的推广小麦品种为母本进行杂交、回交，自回交后代中选择抗白粉病的单株作为下一轮抗病基因聚合的父本；4)将上述得到的用于下一轮抗病基因聚合的母本及父本进行杂交；5)杂种后代自交，自自交后代中选择同时具有黄矮病和白粉病抗性的植株，并对该植株的花药进行培养；6)花药培养过程中经自然加倍，得到兼抗多种病害的普通小麦品系。
文档编号A01H1/02GK1539263SQ03109788
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月21日 优先权日2003年4月21日
发明者陈孝, 辛志勇, 徐惠君, 谢皓, 林志珊, 马有志, 杜丽璞, 张增艳, 李连城, 叶兴国, 吴立人, 盛宝钦, 牛永春, 陈 孝 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所