本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒及其应用。
技术背景
柑橘是世界上最重要的商品水果之一，我国是柑橘的主产国，柑橘产业在我国农村社会与经济中具有重要的地位和作用。近年来，柑橘黄龙病和柑橘溃疡病在我国柑橘产区的发病率不断上升，二者复合侵染的情况越来越多，每年给我国柑橘产业造成逾百亿元的经济损失。目前尚缺乏柑橘黄龙病和溃疡病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这两种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延；此外，还要加强非疫区的管理，防止这两种病害的侵入，因此，针对柑橘黄龙病和溃疡病建立早期快速定量检测方法就显得尤为重要。
针对柑橘黄龙病与柑橘溃疡病的检测，目前已有核酸杂交和血清学检测的方法，但都非常耗时和繁琐。普通PCR、实时荧光定量PCR也可用于此二种病害的检测，但普通PCR检测灵敏度不足。而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析；另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受柑橘样品DNA纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计和对低含菌量病样的检测灵敏度不足。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低。因此，实时荧光定量PCR已不能完全满足黄龙病和溃疡病高灵敏度定量检测的需求。
本发明开发了一套柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法，与现有方法相比，新开发的检测方法具有如下几个方面的优点。1.可进行简便可靠的绝对定量：本发明所使用的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病原菌的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。2.抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：已有的柑橘黄龙病菌和溃疡病菌实时荧光定量PCR检测方法由于受到柑橘样品中的杂质及柑橘基因组的干扰，对低含菌量柑橘病样的检测极为困难，而本方法的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘样品中的杂质及柑橘基因组与病原菌靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰；由于该方法使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病原菌靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。3.高特异性：本发明根据柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌检出的特异性。4.功能更多：本发明同时使用柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，可在一次实验可同时检出2种病原菌，减少了实验时间和步骤。5.检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
根据检索相关的研究及专利文献,未见有柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测的相关文献报道。
技术实现要素：
一种柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒，其组成包括：病样DNA提取试剂盒、数字PCR反应试剂、柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌特异性引物及特异性探针、阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板。
其中，所述病样DNA提取试剂盒的组成成分为：2% CTAB 溶液、巯基乙醇、酚/氯仿溶液以及无水乙醇溶液。
所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针HLB1-P以及KYB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘黄龙病菌阳性对照样品模板、柑橘溃疡病菌阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板各1支。
上述引物与探针的序列为：
柑橘黄龙病菌的特异引物及探针为：
上游引物HLB1-F：5' GGCTCAACCTTGGAACTGC 3'
下游引物HLB1-R：5' TTGCTCCCCACGCTTTC 3'
探针HLB1-P：FAM 5’TTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGG 3’BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为FAM，3’端淬灭基团为BHQ。
柑橘溃疡病菌的特异引物及探针为：
KYB1-F：5' GGACCGTCGCTGTCAAGTA 3'
KYB1 -R：5' CAACTGTAACGGTGGACCTC 3'
KYB1 -P：HEX 5' CACTGTTTGCCGACGCCAACG 3' BHQ
所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
上述柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒用于柑橘黄龙病菌与溃疡病菌检测，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样DNA：
a)采集柑橘病样200mg，加液氮研磨成粉末状；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取缓冲液及5μL巯基乙醇，震荡混匀，65℃水浴20分钟，12000 r/min,离心10 分钟；
c)吸取上清液，加入等体积的酚/氯仿溶液,混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
d)吸取上清，加入等体积无水乙醇，12000 r/min,离心10 min；
e)弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
f)室温下干燥沉淀，溶于40μl去离子水，即提取得到样品DNA。
（2）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针HLB1-P、KYB1-P各0.4μL，10μM的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.8μL，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（3）PCR扩增：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
（4）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的靶标的拷贝数：扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™ 3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
本发明的有益效果在于：
（1）可进行简便可靠的绝对定量：本发明所使用的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病原菌的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。
（2）抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：已有的柑橘黄龙病菌和溃疡病菌实时荧光定量PCR检测方法由于受到柑橘样品中的杂质及柑橘基因组的干扰，对低含菌量柑橘病样的检测极为困难，而本方法的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘样品中的杂质及柑橘基因组与病原菌靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰，由于该方法使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病原菌靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。
（3）高特异性：本发明根据柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌检出的特异性。
（4）功能更多：本发明同时使用柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，可在一次实验可同时检出2种病原菌，减少了实验时间和步骤。
（5）检测速度快：本发明提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。
综上，本发明试剂盒和方法可以满足柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的早期、准确、定量分析的要求，可为柑橘黄龙病菌与柑橘溃疡病菌的早期、精确和定量检测、流行病学调查提供科学依据，具有良好的发展应用前景。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体的实施例做进一步说明，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限止。
实施例1：引物初步筛选及检测。
利用primer primer5软件检测引物间的互补性及引物退火温度，选择退火温度适宜、扩增的目的片段易于区分的引物对。本发明针对柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌各设计2对引物和探针。
本实施例给出了筛选最佳引物的过程，用于筛选的备选引物如下，见表1。
表1 柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的备选引物序列
用于备选的引物及探针组合包括：HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，HLB2-F+HLB2-R+HLB2-P，KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P，KYB2-F+KYB2-R+KYB2-P，使用探针法荧光定量PCR分别进行特异性分析，20μL的反应体系，Premix Ex Taq缓冲液10μL、模板3μL，引物终浓度500 nM，探针终浓度250 nM，补ddH2O至20 μL。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5s，58℃ 40s，40个循环，最后10℃停止反应。其Ct值如表2所示，因此根据实验结果选择检测效果更好的HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物与探针组合。
表2 不同引物对荧光定量PCR中的Ct值
实施例2：引物特异性分析
为验证本发明柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法对柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌检测的特异性，分别运用HLB1-F + HLB1-R+ HLB1-P，和 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物与探针组合对黄龙病和溃疡病病样进行检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针和引物HLB1-P、KYB1-P、HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.4μL，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。数字PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；58℃延伸2min，98℃变性30s；共进行40个循环，最后10℃停止反应。在FAM通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘溃疡病阳性对照样品、柑橘黄龙病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘黄龙病病样与柑橘黄龙病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性。在VIC通道下检测本研究室保存的柑橘溃疡病病样、柑橘炭疽病病样、柑橘脚腐病病样、柑橘衰退病病样、柑橘裂皮病病样、柑橘黄龙病病样、柑橘溃疡病阳性对照样品、柑橘黄龙病阳性对照样品、健康柑橘阴性对照样品的荧光信号，结果显示：柑橘溃疡病病样和溃疡病阳性对照样品为阳性，其余样品显示阴性，实验结果见表3。该实验表明HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物与探针组合有较好的检测特异性。
表3 数字PCR定量检测方法的检测特异性验证
实施例3：不同退火温度对柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR的影响.
运用HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物与探针组合。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针和引物HLB1-P、KYB1-P、HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.4μL，柑橘黄龙病与柑橘溃疡病复合侵染病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min，98℃变性30s，然后分别在温度梯度（56，58，60，62）下退火延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
结果：不同退火温度下，FAM信号通道和VIC检测通道中的检测值差异不大，根据实验结果选择60℃的退火延伸温度。
实施例4：不同引物和探针浓度对柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR反应的影响.
运用不同浓度组合的HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，与 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P进行数字PCR检测。运用数字定量PCR体系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，引物探针HLB1-F/HLB1-R/KYB1-F/KYB1-R/HLB1-P/KYB1-P浓度均为10μmol/L，加入不同体积的引物和探针，柑橘黄龙病与柑橘溃疡病复合侵染病样DNA模板3μL，其余用ddH2O 补足至16μL。PCR扩增反应程序为：96℃预变性10min；98℃，变性30s；60℃退火延伸2min，共进行40个循环，最后10℃停止反应。所使用的引物、探针量以及试验结果如表4所示。
表4 双重PCR体系中不同浓度的引物与探针组合。
根据实验结果，选择最佳的第3个组合。
实施例5：柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法的建立
1、双重数字PCR定量检测试剂盒的组装
柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测试剂盒，该试剂盒包含：柑橘病样DNA提取试剂、数字PCR反应试剂、黄龙病菌与溃疡病菌阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。
所述DNA提取液包括：2% CTAB 溶液 [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% (v/v) PVP]；巯基乙醇；酚/氯仿溶液；无水乙醇溶液。
所述PCR反应试剂包括：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针HLB1-P以及KYB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘黄龙病菌阳性对照样品模板、柑橘溃疡病菌阳性对照样品模板以及阴性对照样品模板各1支。
所述引物与探针的序列为：
柑橘黄龙病菌的特异引物及探针为：
上游引物HLB1-F：5'-GGCTCAACCTTGGAACTGC-3'
下游引物HLB1-R：5'-TTGCTCCCCACGCTTTC-3'
探针HLB1-P：FAM 5’-TTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGG-3’ BHQ
该探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；
柑橘溃疡病菌的特异引物及探针为：
上游引物KYB1-F：5'-GGACCGTCGCTGTCAAGTA-3'
下游引物KYB1 -R：5'-CAACTGTAACGGTGGACCTC-3'
探针KYB1 -P：HEX 5'-CACTGTTTGCCGACGCCAACG-3' BHQ
该探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。
2、一种柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法，其具体检测方法包括如下步骤：
（1）提取柑橘病样DNA：
g)采集柑橘病样200mg，加液氮研磨成粉末状；
h)研磨粉末加入500μl的CTAB提取缓冲液及5μL巯基乙醇，震荡混匀，65℃水浴20min，12000 r/min,离心10 min；
i)吸取上清液，加入等体积的酚/氯仿溶液,混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
j)吸取上清，加入等体积无水乙醇，12000 r/min,离心10 min；
k)弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
l)室温下干燥沉淀，溶于40μl去离子水，即提取得到样品DNA。
（2）配置数字PCR反应体系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探针HLB1-P、KYB1-P各0.4μL，10μM的探针HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.8μL，，柑橘病样DNA模板3μL，其余用ddH2O补足至16μL。
（3）PCR扩增：96℃预变性10min；98℃，变性30s，60℃延伸2min，共进行40个循环；最后10℃停止反应。
（4）检测扩增产物的荧光信号，确定柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的靶标的拷贝数：扩增产物荧光信号的检测方式为读取FAM与VIC通道的荧光信号，通过QuantStudio™ 3D Digital PCR机载软件进行定量分析，计算靶标拷贝数。
实施例6柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法与现有荧光定量PCR检测方法的检测灵敏度对比分析
为比较本检测方法与现有的荧光定量PCR检测方法的检测灵敏度，提取黄龙病菌和溃疡病菌复合侵染样品的DNA模板，然后10 倍梯度稀释为10-1至10-5等系列稀释液，作为PCR的模板。以本试剂盒中二个病原菌的阴性对照模板和阳性对照模板为参照，使用柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法进行检测，实验检测方法及体系参照本发明前述说明。同时作为对照，分别使用现有的黄龙病菌与柑橘溃疡病菌荧光定量PCR检测方法进行检测，柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR实验参照文献：Wenbin Li et al.,2006；柑橘溃疡病菌实时荧光定量PCR实验参照文献：J. Cubero and J. H. Graham, 2005。实验结束后，记录检测结果。
结果发现：两种检测方法均对黄龙病与溃疡病罹病样检出阳性结果。本发明所用的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法在样品稀释梯度为10-1至10-4的4 个DNA 模板中可检出阳性结果(表4)，其中在10-4稀释的DNA 模板中可以检测到约0.811个柑橘黄龙病靶标和1.623个柑橘溃疡病菌靶标；而现有的黄龙病菌荧光定量PCR检测方法和溃疡病菌荧光定量PCR检测方法只能在10-1至10-3等3个稀释度DNA 模板中检出阳性结果。表明本发明所采用的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法不但可以同时检测柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌，而且其检测灵敏度比现有的黄龙病菌及溃疡病菌荧光定量PCR检测方法的检测灵敏度高10倍。
表5 两种病原菌检测方法的检测灵敏度对比研究。
实施例7. 柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法对田间实际样品的检测
进一步于广东的高要、怀集等地砂糖橘园中从1-12月各采集1个柑橘病样，每地各采集12个样品，提取DNA使用双重数字PCR检测方法进行检测。结果：本发明所用的柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重数字PCR定量检测方法在36个样品中，检测出16个黄龙病菌阳性样品，同时检测出7个溃疡病菌阳性样品。10、11、12月份采集的样品更易检出黄龙病菌，而4、5、6、7、8、9月份采集的样品更易检出溃疡病菌。
表6 田间柑橘病样的实际检测
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒及其应用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> HLB1-F
<400> 1
ggctcaacct tggaactgc 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> HLB1-R
<400> 2
ttgctcccca cgctttc 17
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> HLB1-P
<400> 3
ttgtctagag tttaggagag gtgagtgg 28
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> KYB1-F
<400> 4
ggaccgtcgc tgtcaagta 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> KYB1 -R
<400> 5
caactgtaac ggtggacctc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> KYB1 -P
<400> 6
cactgtttgc cgacgccaac g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> HLB2-F
<400> 7
catgcaagtc gagcgcgtat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> HLB2-R
<400> 8
ttagcacacg tttccatgcg 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> HLB2-P
<400> 9
cgggtgagta acgcgtagga atctac 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> KYB2-F
<400> 10
gggttcagcc gactgcagat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> KYB2-R
<400> 11
acaggtcact gaagctgccc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> KYB2-P
<400> 12
cgctcggcgg acgatgtc 18