柑橘黄龙病菌的PCR快速检测方法与流程

本发明涉及一种柑橘黄龙病菌的检测方法，尤指一种检测柑橘黄龙病菌（candidatusliberibacterspp.）的pcr（聚合酶链式反应）方法。

背景技术：

柑橘黄龙病（candidatusliberibacterspp.）是世界范围内最具毁灭性的柑橘病害之一，目前正严重威胁亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区柑橘产业的发展。我国最初是在广东、广西等地区报道发生，随着全球气候变暖，柑橘木虱越冬地区界线北移，柑橘黄龙病的疫区有不断扩大的趋势。黄龙病菌是由昆虫介体传播，局限于韧皮部的革兰氏阴性细菌，暂定为韧皮部杆菌属(candidatusliberibacter)的3个种，分别为亚洲种(ca.l.asiaticus)、非洲种(ca.l.africanus)和美洲种(ca.l.americanus)，其中ca.l.asiaticus在世界范围内分布最为广泛，引起柑橘产业损失最为严重，在中国分布的黄龙病原菌也为该种。柑橘黄龙病引起植株生长受阻，枝梢黄化，其最典型的症状叶片斑驳型黄化和“红鼻果”可做为初步田间诊断的依据。

目前该病菌已经被列为我国进境和国内检疫性有害生物。美国、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多个许多国家和地区，都将其列为检疫性有害生物，对柑橘黄龙病菌实施检疫，并禁止其出口和输入。

商业化生产中，柑橘黄龙病近距离和中距离传播的主要途径是柑橘木虱取食产生的。此外，在果园管理维护中的嫁接等人为活动也有利于柑橘黄龙病在植株间的传播。其远距离传播则主要通过种苗、接穗、砧木的运输交易来实现。因此，建立快速、高效的柑橘黄龙病菌检测技术，是防治柑橘黄龙病的重要基础。目前，通过pcr技术检测柑橘黄龙病菌，主要是根据柑橘黄龙病16srrna区域筛选出的特异性oi1/oi2（oi1：5’-gcgcgtattttacgagcgca-3’；oi2：5’-gcctcgcgagttcgcaacccat-3’,pcr产物大小为1160bp左右）（sandrinejagoueix,josephmariebové,moniquegarnier,pcrdetectionofthetwo«candidatus»liberobacterspeciesassociatedwithgreeningdiseaseofcitrus,molecularandcellularprobes,volume10,issue1,1996,pages43-50,issn0890-8508,）。柑橘黄龙病菌检测方法虽然具有较高的特异性，但灵敏度不够时常出现假阴性，影响了检测的准确性。

16srrna序列在目前使用比较广泛，但是其不足处也逐渐显露，16srdna存在于所有细菌染色体基因中，16srrna基因序列比gyrb基因序列所携带的信息量较大，长度适中，但其分辨率较低。因此，需要找到更有效的检测方法。

技术实现要素：

yrb基因其显著优点是基因进化率较大，碱基替换率较高，在相似细菌的检测和鉴定方面比16srrna基因更具有优势。柑橘黄龙病gyrb基因含2460个核苷酸，在ncbi中搜索到18条柑橘黄龙病gyrb基因系列，通过dnaman比对找到一些保守区域，设计了一对特异性引物在序列1953-2414pb之间。在实验中通过凝胶电泳的条带断定，gyrb引物比16srrna更加灵敏。

因此，本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种能准确鉴定柑橘黄龙病的pcr快速检测方法。该方法所使用的一对引物是基于柑橘黄龙病菌的促旋酶b亚单位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，本检测技术所使用的这对引物有别于其它检测技术。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种柑橘黄龙病的pcr检测方法，该方法是以柑橘黄龙病菌的特异性引物对待测样品进行pcr扩增，最后电泳鉴定。该特异性引物为：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

上述特异性引物的设计是基于柑橘黄龙病菌的促旋酶b亚单位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，pcr产物大小为461bp左右。本发明是以柑橘黄龙病菌特异性引物对待测样品进行pcr扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是基于柑橘黄龙病菌的促旋酶b亚单位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列。本检测技术所使用的这对引物有别于其它检测技术，可以用于快速和准确检测出柑橘黄龙病。

附图说明

图1用本发明的特异性引物作pcr的电泳结果。

图中：从左至右的电泳带依次为：m-marker、+-阳性对照（来自宜章县已确定的阳性菌）、--阴性对照（清水）、1-6为病株（来自江永县以确定的阳性菌）；从上往下的电泳带依次为：柑橘黄龙病菌的dna模板量为稀释10倍、100倍、1000倍。

图2oi1/oi2特异性引物作pcr的电泳结果图。

图中：从左至右的电泳带依次为：m-marker、+-阳性对照（来自宜章县已确定的阳性菌）、--阴性对照（清水）、1-6为病株（来自江永县以确定的阳性菌）；从上往下的电泳带依次为：柑橘黄龙病菌的dna10¹、10²、10³倍稀释。

具体实施方式

一、引物设计：

本发明人利用原核生物进化过程中核酸序列的保守性，从ncbi搜索并下载柑橘黄龙病菌（candidatusliberibacterspp）的促旋酶b亚单位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列（ap014595.1），运用premier软件得到一些候选引物，最后通过筛选，设计出一对引物：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

将引物oi1/oi2和引物gyr1/gyr2分别经blast检索，见下表1及表2，结果表明，与引物oi1/oi2和引物gyr1/gyr2的序列100%覆盖且100%相同的全部是柑橘黄龙病菌的核苷酸序列。

表1柑橘黄龙病菌引物oi1/oi2的blast结果

表2柑橘黄龙病菌引物gyr1/gyr2的blast结果

由此，在ncbi中搜索candidatusliberibacter，找到gryb基因并下载，利用dnaman处理且比对，寻找其保守区域，利用primer5设计并且评估设计的引物。），设计出一对特异性引物：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

上述引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，预期pcr产物为461个左右碱基。

二、pcr过程：

用上述gyr1/gyr2和oi1/oi2引物对对柑橘黄龙病菌进行pcr检测，pcr反应体系为20µl，具体见下表3：

表3pcr反应体系各主要成分及用量

gyr1/gyr2引物反应条件：94℃预变性5min，然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，在此条件下进行35个循环，最后72℃再延伸10min。

oi1/oi2引物反应条件：94℃预变性5min，然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，在此条件下进行35个循环，最后72℃再延伸10min。

将冷却至50-60℃的1.0%琼脂糖胶液倒入制胶板内，待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入1×tbe稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

取反应产物5μl与2μlloadingbuffer和sybrgreen核酸凝胶染液按3:6:3混合，取10μl混合液进行电泳进行检测，以2000bpdnaladder作为标准分子。采用电压110v，电泳时间30min，用紫外凝胶成像系统观察，结果扩增出461bp的条带，与预期的大小相符。

与现有技术相比，本发明的优点是：本方法所使用的引物对是柑橘黄龙病菌的转促旋酶b亚单位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，该引物对有别于其它检测技术，可以用于快速检测柑橘黄龙病。

应用实施例

用本发明中的特异性引物对来自湖南省江永县允山镇和日供销社（e111°15′37″；n25°15′54″）的柑橘黄龙病菌株上分离到的病原菌进行pcr，对已确定的6个阳性病菌的dna进行10¹、10²、10³稀释，同时进行pcr扩增，扩增出461个碱基的条带。见图1，结果检测出10¹稀释的1-6号阳性菌的条带都与阳性对照条带一致；10²稀释的1-6号阳性菌的条带都与阳性对照一致；10³稀释的1、2、3、5、6号阳性菌与阳性对照一致，4号阳性菌的特征和阴性对照一致。说明本发明的这对特异性引物对柑橘黄龙病菌是特异的和高的灵敏度，可快速检测出柑橘黄龙病。

比较实施例

用本oi1/oi2特异性引物对来自湖南省江永县允山镇和日供销社（e111°15′37″；n25°15′54″）的柑橘黄龙病菌株上分离到的病原菌进行pcr，对已确定的6个阳性病菌的dna进行10¹、10²、10³稀释，同时进行pcr扩增，扩增出1161个碱基的条带。见图2，结果检测出10¹稀释的1、2、3、4、6号阳性菌的条带都与阳性对照条带一致，5号阳性菌的特征和阴性对照一致；10²稀释的1、2、4、6号阳性菌的条带都与阳性对照一致，3、5号阳性菌的特征和阴性对照一致；10³稀释的1、2、4号阳性菌跑出1161pb的条带，+、3、5、6号阳性菌的特征和阴性对照一致。说明oi1/oi2这对特异性引物对柑橘黄龙病菌是有特异的，但快速检测出柑橘黄龙病的灵敏度不高，出现假阴性居多，不能准确的检测出柑橘黄龙病。