一种结直肠癌诊断和治疗效果评价相关的基因的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体地，本发明涉及种结直肠癌诊断和治疗效果评价相关的基因。
背景技术：
：中医证候是对疾病的高度概括，是一系列复杂临床症状和体征的集中描述。在这些表象背后，应该有其特定的生物学基础。也就是说，每个证候群的背后都有支持它的相应基因组学背景，证候复杂多样性的表现很可能就是基因多态性和不同功能基因异常表达的表型。因此，从基因的表达差异方面寻找证的相关基因，就有可能使对证本质的认识提高到一个新的高度。结直肠癌(colorectalcancer，crc)是最常见的恶性肿瘤之一，我们在前期对结直肠癌中医证型的流行病学调查中发现，脾气亏虚证是最常见的单纯虚证，与湿热内蕴证及肝肾亏虚证的病因病机、临床表现有明显差异，因而本研究选择以此二型为对照探讨结直肠癌脾气亏虚证在基因水平上可能的发生机制，为探讨脾气亏虚证的本质提供参考。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种通过检测ccin基因或蛋白表达差异来对结直肠癌进行诊断或对治疗效果进行评价的方法。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了检测ccin基因或ccin蛋白的产品在制备脾气亏虚型晚期结肠癌患者诊断或治疗效果评价工具中的应用。进一步，所述检测ccin基因或ccin蛋白的产品包括检测ccin基因或ccin蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合ccin基因的核酸或者能够结合ccin蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ccin基因的表达水平；所述物质能够检测ccin蛋白的表达水平。本发明的检测ccin基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。上面所述的核酸包括扩增ccin基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。在本发明的具体实施方案中，所述核酸为qpcr实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。上面所述的核酸还可包括探针，与ccin基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。本发明的检测ccin蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等。本发明的检测ccin蛋白的产品包括特异性结合ccin蛋白的抗体。所述chka蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述ccin蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与ccin蛋白的结合能力即可。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ccin蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ccin蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用dmso、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-nh2、生物素标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-nh2、碱性磷酸酶标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-nh2、过氧化物酶标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-nh2、藻胆蛋白标记试剂盒-sh、b-藻红蛋白标记试剂盒-nh2，b-藻红蛋白标记试剂盒-sh、r-藻红蛋白标记试剂盒-nh2、r-藻红蛋白标记试剂盒sh(dojindolaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)555标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)647标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗体标记试剂盒、qdot(tm)抗体标记试剂盒(invitrogencorporation)和ez-标记物蛋白质标记试剂盒(funakoshicorporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。进一步，所述检测ccin基因或ccin蛋白的产品可以是检测ccin基因或ccin蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。利用所述产品检测晚期结肠癌患者血液中的ccin基因或ccin蛋白的表达水平，如果与非脾气亏虚型晚期结肠癌患者相比，血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平显著降低，则诊断所述晚期结肠癌患者为脾气亏虚型晚期结肠癌患者，如果药物干预治疗后，脾气亏虚型晚期结肠癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平显著上调且与非脾气亏虚型晚期结肠癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平基本持平，则评价该脾气亏虚型晚期结肠癌患者的脾气亏虚证已经痊愈，不需继续服用药物，反之，则评价该患者治疗效果不好，需要继续服用药物。作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检患者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自患者的血液。本发明还提供了一种用于脾气亏虚型晚期结肠癌患者诊断或治疗效果评价的工具，所述工具能够检测晚期结直肠癌患者样本中ccin基因或ccin蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合ccin基因的核酸或者能够结合ccin蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ccin基因的表达水平；所述物质能够检测ccin蛋白的表达水平。进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。进一步，所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和对照人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ccin基因的异常与晚期结直肠癌的脾气亏虚证相关也属于ccin基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测ccin基因转录水平的针对ccin基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的ccin蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括ccin基因在内的多个基因的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括ccin蛋白在内的多个蛋白质的表达水平。通过将多个与多个其他标志物同时检测，可大大提高诊断准确率。本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ccin抗体的其他性质同前面所述。进一步，所述患者样本可以使用例如自活检患者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自患者的血液。本发明还提供了一种用于脾气亏虚型晚期结肠癌患者诊断或治疗效果评价的方法，所述方法包括如下步骤：(1)获取晚期结直肠癌患者的样品；(2)检测样品中ccin基因或蛋白的表达水平；(3)如果与非脾气亏虚型晚期结肠癌患者相比，血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平显著降低，则诊断所述晚期结肠癌患者为脾气亏虚型晚期结肠癌患者，如果药物干预治疗后，脾气亏虚型晚期结肠癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平显著上调且与非脾气亏虚型晚期结肠癌患者血液中ccin基因或ccin蛋白的表达水平基本持平，则评价该脾气亏虚型晚期结肠癌患者的脾气亏虚证已经痊愈，不需继续服用药物，反之，则评价该患者治疗效果不好，需要继续服用药物。本发明的优点和有益效果：本发明发现了一种诊断脾气亏虚型晚期结肠癌患者或者评价脾气亏虚型晚期结肠癌患者治疗效果的分子标志物，利用该分子标志物对脾气亏虚型晚期结肠癌患者进行诊断或者评价其治疗效果的方法，是一种无创、快速、高效的方法，利于在临床上推广。附图说明图1显示利用基因芯片检测ccin基因的异常表达情况的统计图；图2显示利用qpcr检测ccin基因的异常表达情况的统计图。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1ccin基因的差异表达1、病例收集收集医院肿瘤科经病理明确诊断的iii-iv期结直肠癌患者；选择脾气亏虚证5例作为实验组，非脾气亏虚证5例作为对照组；仅接受纯中医治疗。1.1结直肠癌的诊断及分期标准参照中华人民共和国卫生部医政司2010年10月编著的《结直肠癌诊疗规范》，2011nccn肿瘤临床实践指南(中国版)第一版tnm分期标准。1.2中医症候的诊断标准脾气亏虚证：主证：腹部隐痛，大便不畅或虽有便意解之困难，便溏；次证：神疲乏力，食欲不振，食后作胀，面色萎黄，舌淡胖，苔白，脉沉细。具备主证1项，次证3项可诊断。1.3纳入、排除标准纳入标准：(1)汉族iii-iv期结直肠癌患者，有病理诊断，仅接受纯中医治疗；(2)kps评分≥60；(3)年龄18-75岁之间(包含18岁和75岁)；(4)预计生存期在3个月以上；(5)依从性好，签署知情同意书自愿参与实验。排除标准：(1)合并有严重的或需要治疗的心脑血管、肝、肾和造血系统疾病；(2)孕妇、哺乳期及精神病患者；(3)有明显的复合证患者。2、治疗方法脾气亏虚证5例使用四君子颗粒(吉林省集安益盛药业股份有限公司生产)进行干预，每次15g，水冲服，3次/d，治疗时间为21d，期间患者不接受其他中医药治疗。3、总mrna提取对照患者，疗前和治疗后患者清晨空腹采集外周静脉血5ml，以红细胞裂解液分离出白细胞，加入细胞20倍体积的trizol，用移液器进行反复抽打细胞直至无成团细胞块，使之充分溶解于trizol中形成清亮不黏稠的液体，置-80℃冰箱中保存。trizol一步法抽提总mrna。总mrna纯度及完整性分析：采用分光光度计在260nm和280nm处分别测定吸光度(a)值，a260/a280比值1.8-2.0为较纯的mrna；经琼脂糖凝胶电泳检测：28s条带亮度约是18s条带的2倍表明所提取rna完整性较好，可用于芯片检测。4、agilent表达谱芯片杂交rna质检合格后，参照芯片标准流程进行样本标记、芯片杂交以及洗脱。首先，总rna反转录成双链cdna，再进一步合成以cyanine-3-ctp(cy3)标记的crna。将标记好的crna和芯片杂交，洗脱后利用agilentscannerg2505c(美国安捷伦科技有限公司)扫描得到原始图像。5、数据处理采用featureextraction软件(version10.7.1.1，agilenttechnologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用genespring软件(version12.5：agilenttechnologies)进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，在用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为detected的探针留下进行后续分析。利用t检验得到的差异显著性p值和标准化信号值的差异倍数foldchange值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且p<0.05。6、结果结果显示，脾气亏虚证与对照组相比共筛选出126条差异表达基因，其中上调的71条，下调的55条。经四君子颗粒干预后与干预前相比，筛选出15条差异表达基因，其中表达上调有12条，下调有3条。其中，ccin基因是差异表达基因，表达结果如图1所示。实施例2差异表达基因的验证选择差异表达的ccin基因进行大样本验证。1、病例收集按照实施例1的方法收集脾气亏虚型晚期结直肠癌患者50例、非脾气亏虚型晚期结直肠癌患者50例作为对照。2、治疗方法同实施例1。3、在mrna水平上进行验证3.1提取血液总rna步骤同实施例1。3.2逆转录用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。3.3qpcr(1)引物设计根据genbank中ccin基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：ccin基因：正向引物为5’-ttcttcaattacatcaatctca-3’(seqidno.1)；反向引物为5’-atcaggacactctcaatc-3’(seqidno.2),gapdh基因：正向引物为5’-gaaggtgaaggtcggagt-3’(seqidno.3)；反向引物为5’-catgggtggaatcatattggaa-3’(seqidno.4)。(2)按照表1配制pcr反应体系：其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。表1pcr反应体系试剂体积正向引物1μl反向引物1μlsybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl模板2μl去离子水补足25μl(3)pcr反应条件：95℃5min，(95℃10s，60℃40s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。4、统计学方法结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。5、结果结果如图2所示，与非脾气亏虚型晚期结直肠癌患者相比，脾气亏虚型晚期结直肠癌患者血液中ccin基因的mrna水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。脾气亏虚型晚期结直肠癌患者经四君子颗粒干预后与干预前相比，ccin基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，基本与对照组持平，无显著差异。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>新疆医科大学第四附属医院；西南医科大学附属中医医院；乌鲁木齐市中医医院；新疆生产建设兵团医院（石河子大学医学院第二附属医院）<120>一种结直肠癌诊断和治疗效果评价相关的基因<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ttcttcaattacatcaatctca22<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2atcaggacactctcaatc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gaaggtgaaggtcggagt18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4catgggtggaatcatattggaa22当前第1页12