CCAT1长链非编码RNA及其小分子抑制剂在肝细胞癌治疗方面的应用的制作方法

本发明属于基因治疗领域，涉及基因靶标及其抑制剂的应用，具体涉及lncrnaccat1及其小分子抑制剂在肝细胞癌治疗方面的应用。
背景技术：
：肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，每年约有60万患者被诊断出患有肝细胞癌。目前，对于肝细胞癌的治疗主要是手术切除、肝脏移植、放化疗等，但仅有20％的患者能够被治疗。我国肝细胞癌年死亡率占肿瘤死亡率的第2位。肝细胞癌的病因及发病机制尚未确定，因此，寻找新的肝细胞癌的治疗靶点和药物是研究重点。非编码rna是指不编码蛋白质的rna，其中包括rrna、trna、snrna、snorna、mirna及长链非编码rna(lncrna)。lncrna是一类长度大于200碱基的rna分子，由于缺少有效的开放式阅读框不编码蛋白，但具备复杂的生物学功能并在各种生物过程中发挥重要的作用，如染色质修饰、x染色体的失活、参与基因转录、翻译以及到蛋白活动调控等，其变异和调节能够导致包括肿瘤在内的多重疾病。异常表达的lncrna可通过不同途径和不同作用机制参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的各个阶段，是肿瘤进展的关键因素。近年来研究表明异常表达的lncrna通过多重途径参与了肿瘤细胞的凋亡、増殖、侵袭与转移等调控，与肝癌等肿瘤的发生与转移具有密切的关系。其中，lncrnaccat1是最早在结肠癌中发现的一个与结肠癌发生发展有关的lncrna。技术实现要素：本发明目的在于提供lncrnaccat1及其小分子抑制剂在肝细胞癌治疗方面的应用。实现本发明上述目的技术方案如下：lncrnaccat1作为药物靶标在制备治疗肝癌药物方面的应用。lncrnaccat1抑制剂在制备治疗肝癌药物方面的应用。优选地，所述抑制剂为具有如下结构通式的吡咯并嘧啶酯类小分子化合物：其中，r为烷基。优选地，所述抑制剂选自如下结构的化合物：一种药物组合物，含有上述任一所述的抑制剂。上述药物组合物在制备治疗肝癌药物方面的应用。本发明的突出优点：本发明发现，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ可以显著抑制肝癌hep3b细胞中lncrnaccat1的表达，从而显著抑制肝癌hep3b细胞的体外增殖和体内成瘤能力。吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ及其他lncrnaccat1的抑制剂可以用于开发制备成治疗肝癌的药物。附图说明图1为各组hep3b细胞lncrnaccat1相对表达水平；图2为各组hep3b细胞相对增殖活力(％)；图3为各组体内抑瘤率(％)；图4为各组移植瘤lncrnaccat1相对表达水平。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料人肝癌细胞系hep3b细胞为本公司长期冻存。spf级4周龄雄性裸鼠购于上海斯莱克实验动物公司。吡咯并嘧啶酯ⅰ、ⅱ、ⅲ由本公司合成部按照文献方法合成，结构经核磁确证。用dmso溶解制成1mg/ml的母液，根据需要稀释至不同浓度。胎牛血清购自杭州四季青生物工程和材料研究所，dmem培养基购自gibco公司。二、实验方法1、细胞培养和分组复苏培养人肝癌细胞系hep3b细胞。以含10％胎牛血清的dmem培养基(含双抗)常规培养于37℃、5％co2和相对湿度95％的恒温培养箱中。细胞经过消化传代，取对数生长期的细胞进行培养及实验。实验前用台盼蓝拒染法确保所用细胞拒染率在95％以上。给药组分组和给药浓度如下：吡咯并嘧啶酯ⅰ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯ⅰ；吡咯并嘧啶酯ⅱ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯ⅱ；吡咯并嘧啶酯ⅲ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯ⅲ。2、rna提取和rt-pcr检测ccat1相对表达水平将hep3b细胞消化计数后加入6孔板，细胞密度为2.5×105/ml，细胞贴壁后，加入吡咯并嘧啶酯5μm、20μm培养24h，收集细胞，测定ccat1相对表达水平。另设置对照组，对照组不添加吡咯并嘧啶酯。使用trizol试剂(invitrogen公司)提取总rna。使用primescriptrt试剂盒(takara公司)在标准条件下的随机引物，将总rna(500ng)反转录为10μl的最终体积。ccat1表达水平的检测按照stbrpremixextaq(takara公司)的使用说明进行。通过2-δδct方法，根据内参gapdh含量计算ccat1的相对表达水平。lncrnaccat1和gapdh的rt-pcr引物如下：ccat1上游引物：5’-ccaattgaaccgagccttgt-3’；ccat1下游引物：5’-tcgtgagcgttttcgcaatg-3’；gapdh上游引物：5’-tcctctgacttcaacagcgacac-3’；gapdh下游引物：5’-tctctcttcctcttgtgctcttgc-3’。3、吡咯并嘧啶酯体外对肝癌细胞增殖能力的影响将hep3b细胞消化计数后加入96孔板，细胞密度为1×106/ml，每孔100μl，细胞贴壁后，加入吡咯并嘧啶酯5μm、20μm培养48h向各孔中分别加入10μlcck-8试剂，振荡细胞板后继续培养1h，酶标仪检测吸光度值a(测定波长450nm，参比波长655nm)，计算各组增殖抑制率，该实验重复3次。对照组不添加吡咯并嘧啶酯。增殖抑制率(％)＝(1-a给药组/a对照组)×100％。4、吡咯并嘧啶酯体内对肝细胞癌移植瘤的影响40只裸鼠饲养于spf环境下，随机分为吡咯并嘧啶酯ⅰ组、吡咯并嘧啶酯ⅱ组、吡咯并嘧啶酯ⅲ组和正常对照组，每组10只。适应性驯养1周后，在裸鼠腋窝皮下接种0.1ml的hep3b细胞悬液(含5×106个对数生长期的细胞)。当肿瘤体积生长至100mm3左右(约10d)的时候开始分组腹腔给药吡咯并嘧啶酯，给药剂量为10mg/(kg·d)。正常对照组给与等体积的生理盐水。连续给药14天后，按如下公式计算抑瘤率(％)。抑瘤率(％)＝(1-负载外泌体组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100％。5、测定移植瘤中ccat1相对表达水平液氮磨肿瘤组织提取rna，取100mg组织加入1mltrizol，提取总rna。使用primescriptrt试剂盒(takara公司)在标准条件下的随机引物，将总rna(500ng)反转录为10μl的最终体积。ccat1表达水平的检测按照stbrpremixextaq(takara公司)的使用说明进行。通过2-δδct方法，根据内参gapdh含量计算ccat1的相对表达水平。lncrnaccat1和gapdh的rt-pcr引物如下：ccat1上游引物：5’-ccaattgaaccgagccttgt-3’；ccat1下游引物：5’-tcgtgagcgttttcgcaatg-3’；gapdh上游引物：5’-tcctctgacttcaacagcgacac-3’；gapdh下游引物：5’-tctctcttcctcttgtgctcttgc-3’。6、统计学方法采用spss16.0统计软件进行数据分析，以p<0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、吡咯并嘧啶酯对hep3b细胞中lncrnaccat1相对表达水平的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ给药组hep3b细胞lncrnaccat1相对表达水平均显著降低(p＜0.05)，且高浓度组(20μm)比低浓度组(5μm)hep3b细胞lncrnaccat1相对表达水平降低更为显著。表1和图1为各组hep3b细胞lncrnaccat1相对表达水平比较。表1各组hep3b细胞lncrnaccat1相对表达水平2、吡咯并嘧啶酯体外对hep3b细胞增殖能力的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ给药组hep3b细胞的增殖活力显著降低(p＜0.05)，且高浓度组(20μm)比低浓度组(5μm)hep3b细胞增殖活力降低更为显著。表2和图2为各组hep3b细胞相对增殖活力比较。表2各组hep3b细胞相对增殖活力(％)3、吡咯并嘧啶酯体内对肝细胞癌移植瘤的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ给药组移植瘤体积明显较小(p＜0.05)，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ显示出明显的体内抑瘤作用。表3和图3为各组体内抑瘤率(％)。表3各组体内抑瘤率(％)吡咯并嘧啶酯ⅰ组吡咯并嘧啶酯ⅱ组吡咯并嘧啶酯ⅲ组抑瘤率(％)5257554、吡咯并嘧啶酯对移植瘤lncrnaccat1相对表达水平的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ给药组移植瘤lncrnaccat1相对表达水平显著降低(p＜0.05)。表4和图4为各组移植瘤lncrnaccat1相对表达水平比较。表4各组移植瘤lncrnaccat1相对表达水平组别ccat1/gapdh吡咯并嘧啶酯ⅰ组0.56吡咯并嘧啶酯ⅱ组0.49吡咯并嘧啶酯ⅲ组0.61对照组1.15上述实验可以发现，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ可以显著抑制肝癌hep3b细胞中lncrnaccat1的表达，从而显著抑制肝癌hep3b细胞的体外增殖和体内成瘤能力。吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ及其他lncrnaccat1的抑制剂可以用于开发制备成治疗肝癌的药物。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。当前第1页12