一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法与流程

本发明涉及生物分析技术领域，特别是涉及一种基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测microrna的方法。

背景技术：

microrna是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性非编码单链rna，长度为21～25nt的短序列，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mrna特异性的碱基互补配对，引起靶mrna降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。由于microrna序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为microrna的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等。

因此，microrna被认为是一种潜在的生物标志物，实现microrna的选择性灵敏定量检测对于理解其生物功能和临床应用都具有很重要的价值。

由于microrna分子只有21～25nt左右大小，检测较为困难。现有的检测方法中，核酸印迹分析作为microrna分析的标准方法，但该方法存在着灵敏度较低(高于1纳摩尔每升)、操作耗时以及样品消耗量大等缺点，因此该方法并不适于低丰度microrna的分析测定。

为了提高检测灵敏度，基于聚合酶链式反应(pcr)和恒温核酸扩增技术的microrna检测方法逐渐发展起来。基于聚合酶链式反应(pcr)的方法实现了检出限的大幅降低(达到100飞摩尔每升左右)，但该方法所必需的反转录环节增加了探针设计的难度；此外，为了实现聚合酶链式反应(pcr)所需的精确温度循环过程，需要使用价格昂贵而操作复杂的热循环仪，这也限制了该方法的广泛应用。

滚环扩增(rca)、环介导恒温扩增(lamp)以及指数扩增反应(expar)等恒温扩增技术的发展使得microrna的检测可以在某一特定温度下进行，达到了较高的灵敏度，但大多数恒温扩增技术反应时间较长，反应机理较为复杂，难以满足临床检测的需求。例如，为了达到10飞摩尔每升的检出限，分支滚环扩增(rca)需要长达8个小时的反应时间，而恒温指数扩增(expar)需要设计带有限制性核酸内切酶特异性识别位点的核酸模板。

依赖解旋酶辅助的恒温扩增(hda)技术是核酸等温扩增技术中的一种，该技术模拟自然界生物体内dna复制的自然过程，在恒温条件下利用解旋酶解开dna双链，同时dna单链结合蛋白(ssb)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由dna聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶作用下又解成单链，并作为下一轮合成的模板进入上述循环扩增反应，最终实现靶序列的指数式增长。目前有关hda检测方法的报道较少，相关研究主要是利用hda技术对一些病原菌进行检测，但尚未见采用hda方法检测microrna的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测microrna的方法。本发明将hda技术引入到microrna检测中，实现了对microrna的超高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测microrna的方法，步骤如下：

(1)提取样品中的总rna；

(2)向提取的总rna中加入单链dna探针和过量的核酸外切酶i，在反应缓冲液中进行孵育，实现目标microrna与单链dna探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶i将多余的单链dna探针消除；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对目标microrna进行扩增反应，通过荧光信号检测目标microrna的表达。

优选的，步骤(1)中，提取样品中的总rna采用的方法为：利用总rna提取试剂盒对样品中的rna进行抽提与纯化。

优选的，步骤(2)中，所述单链dna探针中包含hda扩增的模板序列，并且所述单链dna探针的3’末端与待检测的目标microrna完全互补。

优选的，步骤(2)中，所述反应缓冲液中含有：1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反应缓冲液、20个单位的rna酶抑制剂、10毫摩尔每升的氯化钠以及10毫摩尔每升的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液。

优选的，步骤(2)中，孵育的温度为95℃，孵育的时间为5min。

优选的，步骤(3)中，扩增反应的温度为60-70℃，扩增反应的时间为30min。

优选的，步骤(3)中，所述上游引物与单链dna探针的3’端互补；所述“下游引物”与单链dna探针的5’端一致，可保证hda扩增反应的进行。

作为本申请的一种优选的实施方案，所检测的目标microrna为mir-21；用于检测mir-21的单链dna探针序列如seqidno.1所示；用于检测mir-21的上游引物和下游引物的序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示；具体如下：

单链dna探针：5’-aatattttccaacaacgcttctgcaatcggatattggcctctcaatgctttttcgtaccaacttatcaaatcatcctcagtcaacatcagtctgataagcta-3’；(seqidno.1)

上游引物：5’-tagcttatcagactgatgttgactgagg-3’；(seqidno.2)

下游引物：5’-aatattttccaacaacgcttctgcaat-3’；(seqidno.3)

本发明的第二方面，提供一种检测microrna的试剂和/或试剂盒，包括：单链dna探针、上游引物和下游引物；

所述单链dna探针中包含hda扩增的模板序列，并且所述单链dna探针的3’末端与待检测的目标microrna完全互补；

所述上游引物与单链dna探针的3’端互补；所述“下游引物”与单链dna探针的5’端一致，可保证hda扩增反应的进行。

优选的，所述试剂和/或试剂盒中还包括：核酸外切酶i、单链结合蛋白和解旋酶。

作为本申请的一种优选的实施方案，提供了一种检测mir-21的试剂和/或试剂盒，包括：单链dna探针、上游引物、下游引物、核酸外切酶i、单链结合蛋白和解旋酶；

所述单链dna探针的序列如seqidno.1所示；所述上游引物和下游引物的序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明的第三方面，提供上述试剂和/或试剂盒在非疾病的诊断目的的检测microrna中的用途。

本发明的有益效果：

(1)本发明设计了一种借助核酸外切酶i(exoi)的消化以降低背景、利用解旋酶辅助的恒温扩增(hda)反应以放大信号的快速检测microrna的免标记荧光定量方法。

当靶microrna(即目标microrna)存在时，可以与单链dna探针的3’末端特异性结合形成microrna-dna探针异源双链核酸分子，从而保护该dna探针免受核酸外切酶i(exoi)的消化，未与靶microrna特异性结合的单链dna探针则被核酸外切酶i(exoi)直接消化以降低背景信号；随后加入的上游引物将靶microrna从microrna-dna探针杂交双链上竞争下来，并在dna聚合酶的作用下延伸为完整的双链dna结构；在单链dna结合蛋白(ssb)和解旋酶的共同作用下，此双链dna通过解旋酶辅助的扩增反应(hda)实现信号放大。最后，以sybrgold作为荧光指示剂，短时间内即可产生可用于实时定量测定的荧光信号，相比基于滚环扩增(rca)的方法需要6-8小时的扩增检测时间，本发明中解旋酶辅助的扩增反应(hda)在30分钟内即可达到较高的扩增效率，实现microrna的快速高效检测。

(2)本发明通过使用核酸外切酶i(exoi)，消化了未特异性结合靶microrna的单链dna探针，大幅降低了背景信号；在解旋酶与单链dna结合蛋白(ssb)共同作用下进行的扩增反应放大信号的效率也很高；此外，结合作为荧光指示剂的sybrgold，可以产生用于实时定量测定的荧光信号，因此，本发明的检测方法的检测灵敏度较高，检出限低至12.8飞摩尔每升，同时具有较宽的线性范围(100飞摩尔每升到10纳摩尔每升)。

(3)本发明对探针的设计是基于沃森-克里克碱基互补配对原则，避免了单链dna探针与非靶rna的非特异性结合；本发明中所使用的核酸外切酶i(exoi)基本可完全消化未特异性结合靶microrna的单链dna探针，避免了后续非特异性扩增可能产生的干扰信号，此外，我们对各项反应条件也做了细致的优化，因此发明的检测方法的特异性较高。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：本发明的基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测microrna的原理图；

图2：(a)对解旋酶辅助的扩增反应(hda)的实时荧光定量检测结果。曲线2为50纳摩尔每升的mir-21存在时的荧光强度随时间的变化；曲线1为没有mir-21存在时的荧光强度随时间的变化。(b)对解旋酶辅助的扩增反应(hda)产物的凝胶电泳分析。泳道1是没有mir-21时的扩增反应产物表征；泳道2是有50纳摩尔每升的mir-21存在时的扩增反应产物表征，泳道m为dnamarker。

图3：(a)不同mir-21浓度下的实时荧光定量检测结果。(b)δpoi值与mir-21浓度对数的线性关系图。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图4：(a)不同种类microrna存在时核酸外切酶i(exoi)消化产物的凝胶电泳分析结果。泳道m是dnamarker；泳道1是1微摩尔每升的mir-21与1微摩尔每升的单链dna探针存在时的无酶切产物表征；泳道2是1微摩尔每升的mir-21与1微摩尔每升的单链dna探针存在时，加入20个单位核酸外切酶i的酶切产物表征；泳道3是1微摩尔每升的mir-141与1微摩尔每升的单链dna探针存在时的无酶切产物表征；泳道4是1微摩尔每升的mir-141与1微摩尔每升的单链dna探针存在时，加入20个单位核酸外切酶i的酶切产物表征；泳道5是1微摩尔每升的let-7a与1微摩尔每升的单链dna探针存在时的无酶切产物表征；泳道6是1微摩尔每升的let-7a与1微摩尔每升的单链dna探针存在时，加入20个单位核酸外切酶i的酶切产物表征。(b)不同种类microrna存在时δpoi值的对比图。blank表示的是没有任何microrna存在时的δpoi值；mir-21、mir-141和let-7a的浓度均为1纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中尚未见采用hda方法检测microrna的报道。基于此，本发明提出了一种基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测microrna的方法。

本发明的设计构思在于：首先设计了一个简单的单链dna探针，靶microrna可通过沃森-克里克碱基互补配对原则与此单链dna探针的3’末端特异性结合形成microrna-dna探针异源双链核酸分子，因为核酸外切酶i(exoi)是一种可以由3’末端向5’末端方向高效降解单链dna分子的的核酸外切酶，因此靶microrna与dna探针的特异性结合会保护探针免受核酸外切酶i(exoi)的消化，未与靶microrna特异性结合的单链dna探针则会被外切酶i(exoi)消化以获得较低的背景信号；随后，上游引物的加入会将microrna从microrna-dna探针杂交双链上竞争下来，在dna聚合酶的作用下，上游引物与dna探针延伸为完整的双链dna；接下来，在单链dna结合蛋白(ssb)和解旋酶的共同作用下，此双链的两端部分解旋为单链结构，使得上游引物和下游引物可以同时分别与其上、下游进行杂交结合，上、下游引物在dna聚合酶的作用下得到延伸进而形成两条新的双链dna，这些双链dna又可作为底物引发下一轮的扩增反应，如此往复，最终实现指数式的扩增，获得大量dna双链结构。最后，以sybrgold作为荧光指示剂，可以实现对此扩增过程的实时监测与定量。本发明的设计原理图如图1所示。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种基于依赖解旋酶dna恒温扩增技术检测mir-21的方法，步骤如下：

(1)利用总rna提取试剂盒对样品中的rna进行抽提与纯化；

(2)向提取的总rna中加入单链dna探针和过量的核酸外切酶i，在反应缓冲液中进行孵育，实现mir-21与单链dna探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶i将多余的单链dna探针消除；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对mir-21进行扩增反应，扩增反应的温度为60-70℃，扩增反应的时间为30min；通过荧光信号检测mir-21的表达。

步骤(2)中，所述单链dna探针的序列如seqidno.1所示。

步骤(2)中，所述反应缓冲液中含有：1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反应缓冲液、20个单位的rna酶抑制剂、10毫摩尔每升的氯化钠以及10毫摩尔每升的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液。

步骤(3)中，所述上游引物和下游引物的序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。

为了验证本发明技术方案的可行性，我们使用mir-21作为靶microrna模型进行了原理验证。在使用核酸外切酶i(exoi)消化后进行解旋酶辅助的扩增反应(hda)，并以sybrgold作为指示剂进行实时定量检测。从图2a中可以看出，mir-21存在时，荧光强度快速增大并在10分钟内达到平台期(曲线2)；没有mir-21时，未检测到明显的荧光信号(曲线1)，这是因为没有mir-21存在时，所有的单链探针都被核酸外切酶i(exoi)完全消化为单个的核苷酸而无法启动后续的扩增反应。我们进一步使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行了分析验证，结果如图2b所示：在mir-21存在时，可以看到解旋酶辅助的扩增反应(hda)产物的特征条带(泳道2)，没有mir-21时，特征条带消失(泳道1)，说明解旋酶辅助的扩增反应(hda)未发生，因而没有相应产物的存在。以上结果证明单链dna探针可以与靶microrna特异性结合并因此免受核酸外切酶i(exoi)的消化，从而进一步引发解旋酶辅助的扩增反应(hda)，产生放大的荧光信号。因此本技术方案完全可行。

为了评估本发明技术方案检测microrna的灵敏度，我们将poi值作为不同浓度microrna定量的依据(poi值是指实时定量荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)，使用不同浓度的mir-21作为靶microrna模型进行了实时定量分析。从图3a可以看出，不同浓度的mir-21所对应的poi值也不相同，随着浓度的升高，poi值顺次减小。同时，如图3b所示，以δpoi值(在相同条件下，有靶microrna的实验组和无靶microrna的对照组poi值的差值为δpoi值)对mir-21浓度的对数作图，在100飞摩尔每升到10纳摩尔每升的浓度范围内显示出了良好的线性关系，经过计算可以得出检出限为12.8飞摩尔每升(或640仄摩尔)，高出以往技术4个数量级之多，这足以说明本技术方案的检测灵敏度之高。

为了评估本技术方案检测某种特定microrna时的特异性，我们使用mir-21作为靶microrna，mir-141及let-7a作为非靶microrna对照进行了特异性实验。我们首先使用2％的琼脂糖凝胶电泳对mir-21、mir-141、let-7a分别存在时核酸外切酶i(exoi)的消化产物进行了验证，结果如图4a所示：当mir-21存在时，其与单链dna探针的杂交保护dna探针免受消化，结合强度与此前相比也没有明显变化(泳道1)；当mir-141存在时，相比未酶切的对照组(泳道3)，酶切后结合强度有所下降(泳道4)；类似的，当let-7a存在时，酶切后的结合强度(泳道6)比未酶切的对照组(泳道5)下降了很多。此后，我们又进行了实时定量验证，结果与琼脂糖凝胶电泳一致，结果如图4b所示：mir-21存在时的δpoi值分别为mir-141和let-7a存在时的4.07倍、9.89倍。由此可以看出，本技术方案具有很高的特异性，能够较好地区分靶microrna与非靶microrna，可以应用于复杂样品的检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

细胞内总rna的提取：人类子宫颈癌细胞(hela)的培养基为含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)，放在37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。待细胞生长到对数生长期时，使用德国凯杰生物公司的总rna小提试剂盒(货号74104)对细胞中的总rna进行抽提与纯化，提取与纯化操作严格按照试剂盒所附的说明书进行。所得总rna在使用紫外可见分光光度计测定浓度后用于癌细胞中microrna的定量检测。

核酸外切酶i(exoi)消化：首先配制19微升的反应缓冲液，其中含有1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(dtt)、1×核酸外切酶i(exoi)反应缓冲液、20个单位的rna酶抑制剂、10毫摩尔每升的氯化钠以及10毫摩尔每升的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液。接下来，将待测的microrna样品与最终浓度为1微摩尔每升的单链dna探针加入此反应缓冲液中并在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却至室温以实现靶microrna与单链dna探针的特异性结合；此后，在上述体系中加入1微升浓度为20单位每微升的核酸外切酶i(exoi)，于37℃孵育20分钟以消化多余的单链dna探针，最后在90℃水浴中停留10分钟以使核酸外切酶i(exoi)失活而终止消化反应。

解旋酶辅助的扩增反应(hda)及实时荧光定量测定：按照说明书将美国neb公司的isoampii通用恒温解旋酶辅助扩增试剂盒(货号h0110s)中的试剂与5微升核酸外切酶i(exoi)的消化产物配制成50微升反应混合液，除核酸外切酶i(exoi)的消化产物外，混合液中还含有5微升10×退火缓冲液ii、2微升100毫摩尔每升的硫酸镁、4微升500毫摩尔每升的氯化钠、3.5微升脱氧核糖核苷三磷酸溶液(包含等量的脱氧腺苷三磷酸、脱氧胸腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸)、1微升10微摩尔每升的上游引物和1微升10微摩尔每升的下游引物、1×sybrgold以及3.5微升酶混液(包含完成核酸扩增所需的dna聚合酶及解旋酶等)；将此反应混合液置于65℃的实时荧光定量系统中进行解旋酶辅助的扩增反应(hda)，每隔30秒读取一次荧光强度。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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<110>山东师范大学

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