罗布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆与应用的制作方法

专利名称：罗布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆、重组、耐盐性功能分析及其转基因耐盐碱棉花的选育，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
在我国耕地中，盐碱地分布广泛，另外，还有未被开发利用的盐碱荒地。由于灌溉地排水不良和海水入侵，耕地中次生盐碱地面积逐年扩大，仅黄淮海平原各种类型的盐碱地占耕地盐碱地的50％以上。对盐碱地的土壤进行改良耗资巨大，成本昂贵。选育耐盐碱作物品种，不仅经济有效的提高盐碱地作物产量，扩大作物种植面积，而且，可改良盐碱地、改善生态环境，这对实现我国资源节约型农业发展战略、降低农业成本、改善农业生态环境，具有十分重要意义。
盐胁迫可导致非盐生植物的原初危害是渗透胁迫和离子毒害，植物则通过两种途径减轻盐胁迫造成的危害，一是通过渗透调节基因(如甜菜碱脱氢酶基因)积累渗透调节物质，降低渗透胁迫；二是通过细胞膜离子通道基因(如Na+/H+反向转运蛋白基因)维持细胞内外离子的平衡，减轻离子的毒害。目前，耐盐碱植物基因工程主要集中在这两个方面，通过转基因技术，获得了耐盐碱转基因植物，但是，这些转基因耐盐植物耐盐性提高是有限的，一方面是由于这些基因来自非盐生植物，其耐盐性功能低于盐生植物；另一方面，植物的耐盐是多基因参与的生物化学代谢过程，而目前应用的基因仅参与其中的一步生物化学代谢过程，因此，从盐生植物中克隆参与多种代谢途径的基因，转化非盐生的农作物，可进一步提高农作物的耐盐性。所以，本发明的目的就是从盐生植物-罗布麻中克隆参与多种代谢途径的基因，转化棉花，以提高转基因棉花的耐盐性。
罗布麻是我国特有的盐生植物，广泛分布于我国的西北内陆和滨海盐碱地，它可以在1％-1.5％的盐碱地正常生长，其耐盐性远远高于非盐生的农作物。在盐胁迫条件下，发明人利用抑制差减杂交技术，从罗布麻叶片中分离得到了一个盐诱导过量表达DNA解旋酶基因的中间片段，然后进行3′和5′末端快速扩增获得编码罗布麻DNA解旋酶全长cDNA，将其命名为APDH1。DNA解旋酶的作用是打开DNA的双螺旋结构，它参与DNA复制、修复、重组和转录等重要的过程，是一个参与多种代谢途径的基因。目前的研究表明，盐胁迫可影响DNA复制、修复、重组和转录，提高DNA解旋酶活性是盐生细菌(Briolat，V.& Reysset，G.，2002，J.Bacteriol.184，2333-2343.)和抗盐酵母(Liu & H.Y.Nefsky，等，2002，J.Biol.Chem.277，2637-2643.)适应盐胁迫的反应机制。因此，发明人进一步构建正义表达载体，转化棉花，结果获得的转基因棉花可以在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮，而非转基因棉花则不能出苗或者在生长过程中死亡。

发明内容本发明从盐生植物罗布麻中克隆得到编码DNA解旋酶基因APDH1的全长cDNA，然后构建正义表达载体，通过花粉管通道转基因技术转化棉花，结果获得的转基因棉花可以在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮。
该基因的全长cDNA为1621bp，它包含一个1218bp的开放阅读框，编码起始于序列的77位，终止于1294位，编码405个氨基酸，将此氨基酸序列与国际基因库中其它植物编码DNA解旋酶基因的氨基酸序列相比较表明，罗布麻DNA解旋酶与拟南芥、水稻、烟草和菜豆氨基酸的同源性分别为91％、89％、88％和86％，这说明利用抑制差减杂交技术、3′和5′末端快速扩增技术获得了编码罗布麻DNA解旋酶基因。该基因的序列如下序列表(1)SEQ.ID.NO 1的信息(a)序列特征*长度1621碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源罗布麻(f)序列描述SEQ.ID.NO 11 attcttgtgc gaaaaccttt cttatccacc ttatctatat ctctccatcc tcaacattat61 agctcggtca acaagcatgg ccacaactac ttcggggccg gctaatcgta ggggaaccgt121aatcgacgat aagctggtct ttgaaacgac cgaaggagtc gaggccatta cctccttcaa181tggcatgggc ataaaagagg atttactccg tggtatctat gcttacggat tcgaaaagcc241ttccgctata caacagcgag cggtaatgcc tatcatacag ggtcgagatg taattgcaca301agctcaaagt ggtacgggta agaccagcat gattgccctt acagtatgcc aggtagttga361tacttcggtg cgtgaagtcc aagcattaat actgtcacct actagagagc tggcgactca421gacagaaaag gtaattctgg caattggtga tcatataaat attcaagctc atgcatgcat481aggtggcaat tctgtcggtg aagatatacg gaaactagag catggtgtac acgtcgtcag541tggaactcca ggccgtgtgt gtgacatgat taaaaggcga agtttgcgaa ctcgagcaat
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根据上述技术，从盐生植物罗布麻中克隆得到编码DNA解旋酶基因APDH1，将该基因导入棉花中，过量表达提高了转基因棉花的耐盐性。如果利用该基因转化小麦、玉米等其它非盐生农作物，将提高这些农作物的耐盐性，具有重要的经济效益和生态效益，因此该基因应用前景广阔。


图1盐胁迫诱导罗布麻DNA解旋酶基因APDH1表达量的变化。每个加样孔为20ugRNA，与32P标记的APDH1基因3′端片段进行杂交，溴化乙啶染色的rRNA作为总RNA上样标准。A，800mM的氯化钠处理；B，蒸馏水处理；1，3，根；2，4，叶片。
图2在0.5％盐碱地进行筛选耐盐碱转基因植株。获得8株耐盐碱植株，杂草多为盐地碱蓬。
图3在0.45％盐碱地常规地膜覆盖条件下种植的山农NO.3和山农丰抗棉6号，下方对照山农丰抗棉6号没有出苗。
图4在0.45％盐碱地水压碱条件下种植的山农NO.3和山农丰抗棉6号。左行山农NO.3；右行山农丰抗棉6号。
具体实施方式
实施例1罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆1.罗布麻幼苗的处理和总RNA的提取将利用沙培6周的罗布麻幼苗的处理，分别放入800mM的氯化钠水溶液和蒸馏水处理2天，利用RNA easy Plant mini Kit(Promoga公司产品)试剂盒，分别提取盐胁迫处理和蒸馏水处理罗布麻幼苗叶片的总RNA。
2.抑制差减文库的构建和筛选使用Clontech SMART PCR cDNA synthesis kit合成cDNA，以盐胁迫处理幼苗叶片cDNA为tester，蒸馏水处理幼苗叶片cDNA作为driver，按照Clontech PCR-Select complementary DNA subtraction试剂盒提供的方法，构建罗布麻盐胁迫抑制差减cDNA文库，对从差减文库中筛选的阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较，获得一系列盐诱导表达的cDNA序列。
3.基因的克隆利用BLAST软件，对一系列盐诱导表达的cDNA序列进行同源性比较，其中有一序列为DNA解旋酶基因的中间片段。然后，利用Clontech公司的SMARTRACE cDNAAmplication试剂盒，按照使用说明进行3′和5′序列的分离，结果获得全长罗布麻DNA解旋酶基因序列4.序列的测定本工作上海生工生物工程技术服务公司进行。
实施例2罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的序列如下(1)SEQ.ID.NO 1的信息(a)序列特征*长度1621碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源罗布麻(f)序列描述SEQ.ID.NO 11 attcttgtgc gaaaaccttt cttatccacc ttatctatat ctctccatcc tcaacattat61 agctcggtca acaagcatgg ccacaactac ttcggggccg gctaatcgta ggggaaccgt121 aatcgacgat aagctggtct ttgaaacgac cgaaggagtc gaggccatta cctccttcaa181 tggcatgggc ataaaagagg atttactccg tggtatctat gcttacggat tcgaaaagcc241 ttccgctata caacagcgag cggtaatgcc tatcatacag ggtcgagatg taattgcaca301 agctcaaagt ggtacgggta agaccagcat gattgccctt acagtatgcc aggtagttga361 tacttcggtg cgtgaagtcc aagcattaat actgtcacct actagagagc tggcgactca421 gacagaaaag gtaattctgg caattggtga tcatataaat attcaagctc atgcatgcat481 aggtggcaat tctgtcggtg aagatatacg gaaactagag catggtgtac acgtcgtcag541 tggaactcca ggccgtgtgt gtgacatgat taaaaggcga agtttgcgaa ctcgagcaat601 caagttactt attctcgatg aaagtgatga aatgttaggc agaggtttca aagatcagat661 atatgatgtc tacagatatc tgcctccgga cctacaggta tgcttgatat cagctaccct721 tccacatgaa attctcgaga tgacttccaa gtttatgact gaacctgtca agatcctagt781 gaaacgagat gaattgactc tggaggggat caagcagttc tttgtagccg tagagaagga841 agattggaag tttgatacac tctgtgacct ctatgacaca ctcacaataa cactggcggt901 gatattttgc aatacgaagc gtaaggtcga ctggttaagt gaaaaaatgc gaagcaacaa961 tttcacagtg tctgtaatgc acggagacat gccacagaag gagcgagatg ctattatgaa1021tgaatttcga tctggtgcaa cccgagtttt gattacaaca gatgtatggg caagagggct1081agatgttcaa caggtatcac ttgtaataaa ttatgaccta cctaataaca gagagctcta
1141catacatcgc ataggaaggt ctggtcgatt tggtcgtaag ggagtagcta ttaattttgt1201aaagtccgac gacatcaaga ttctgagaga tattgagcag tattactcta cgcagataga1261tgaaatgcct atgaatgttg ctgatctaat ttaaaaaagg ggcatgattt cggatgggtt1321ttttgtgata gtttagggtt tttggccttt ccttaggctt aaaagggccc ctttaagtct1381gtcagtctga tcgtactagc tttttaaggg ccctttccgt cgctgaatag tctagtcagt1441gtgtcagtca gtcgatcgta gctagtcagt catgtgttaa taaaggttta gtcgttgtta1501aacgtcgccc ggttatatgc taagtcatgt ctaaaccacc catttcccgg cgcgctagct1561agtcagctat agtcagtcat cgttaaaaca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1621a(2)SEQ.ID.NO 2的信息(a)序列特征*长度405氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述SEQ.ID.NO 21 MATTTSGPAN RRGTVIDDKL VFETTEGVEA ITSFNGMGIK EDLLRGIYAY GFEKPSAIQQ61 RAVMPIIQGR DVIAQAQSGT GKTSMIALTV CQVVDTSVRE VQALILSPTR ELATQTEKVI121LAIGDHINIQ AHACIGGNSV GEDIRKLEHG VHVVSGTPGR VCDMIKRRSL RTRAIKLLIL181DESDEMLGRG FKDQIYDVYR YLPPDLQVCL ISATLPHEIL EMTSKFMTEP VKILVKRDEL241TLEGIKQFFV AVEKEDWKFD TLCDLYDTLT ITLAVIFCNT KRKVDWLSEK MRSNNFTVSV301MHGDMPQKER DAIMNEFRSG ATRVLITTDV WARGLDVQQV SLVINYDLPN NRELYIHRIG361RSGRFGRKGV AINFVKSDDI KILRDIEQYY STQIDEMPMN VADLI实施例3表达载体的构建和转化1.基因分离根据已克隆罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的核苷酸序列，设计引物正向引物5’-CCTTTCTTATCCACCTTATC-3’反向引物5’-GCCAAAAACCCTAAACTATCAC-3’以盐胁迫叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链反应。
2.基因鉴定取2μl PCR产物与pGEM-T easy Vector进行连接，方法按照Promega产品的说明进行，连接产物的转化DH5α细菌(购自上海生工生物工程公司)，转化菌在含有氨苄青霉素和/IPTG/-Gal的LB固体培养基培养，37℃倒置培养12-20小时，有的菌落为白色，有的变为蓝色。选取白色菌落，提取质粒DNA，进行酶切和PCR鉴定。
3.表达载体构建用Xba I和Sal I两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下，与相同限制性内切酶酶切的pBI121载体进行连接，连接产物转化DH5α细菌，筛选方法如上述2描述的方法相同。
4.质粒提取扩大繁殖连接正确的转化DH5α细菌，利用碱裂解法提取大量质粒DNA，供转化。
5.遗传转化以山农丰抗棉6号为受体，参照“提高棉花花粉管通道导入基因转化率的方法”(专利申请号为200410036058.8，
发明者沈法富, 韩秀兰, 于元杰, 尹承佾 申请人:山东农业大学