专利名称：丙型肝炎病毒ns3解旋酶atp结合位点单克隆抗体识别表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位，其为丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP结合位点单克隆抗体识别表位，及使用该细胞表位刺激得到的抗丙型肝炎NS3蛋白的单克隆抗体，还涉及该细胞表位的应用和由该细胞表位刺激产生的抗体的应用。
背景技术：
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，对患者的健康和 生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约I. 7亿人感染了 HCV，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。仅中国就有大约4，000万名HCV感染者，感染率约为3. 2%，是HCV感染的高发区。大多数HCV感染者没有症状或症状轻微，易于形成慢性感染，20 35%的慢性感染者将最终发展成肝硬化，其中每年又有大约I 4%的人发展为肝癌。丙型肝炎目前尚无有效疫苗，也无有效的治愈方法。迄今最有效的抗HCV的治疗仅限于干扰素与利巴韦林联合使用，效果在不同基因型之间有很大差异，持续疗效约为40%，然而这两种药物副作用大和费用昂贵，限制了广泛应用。随着临床上蛋白酶和逆转录酶抑制剂在治疗HIV中的应用及取得的良好疗效，近年来以在病毒基因组复制和多聚蛋白前体加工成熟中起着关键作用的酶类(如丝氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA聚合酶)为靶标，寻找特异有效的治疗药物已经成为HCV防治研究的重要方向。此外，目前HCV的主要诊断方法是用放射免疫诊断(RIA)或酶联免疫试验(ELISA)检测血清中HCV抗体，但是抗体检测一般存在7 10周的窗口期，威胁着用血安全。检测HCV核酸可有效缩短窗口期，但因其操作复杂，容易污染且价格昂贵，使之不能广泛应用。血清学检测中，除了抗体检测，还有抗原检测，可以缩短窗口期。早期诊断是控制HCV发生和传播的重要手段。因此，获得有效抗体，研究抗原检测试剂成为目前HCV诊断研究的重要方向。HCV属于黄病毒科，肝病毒属，单股正链RNA病毒。HCV的基因组大小约为9600bp，包括一个大的开放阅读框(ORF)和两侧的5’、3’非编码区(NCRs)。翻译结束后，前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白，根据功能的不同命名为(3132、口7、吧2、吧3、吧4六、吧48、吧5六和吧58。其中HCV NS3蛋白全长631个氨基酸(aa)，分子量约为70kD，其N端的189个aa具有丝氨酸蛋白酶活性，C端的442个aa具有核苷三磷酸酶(NTPase)和RNA解旋酶的活性。C端解旋酶分为三个区域，区域I和区域2是主要的功能区，并且序列保守性较高。其中，区域I中的Walker A (GSGKSTK)在HCV所有亚型中高度保守，为ATP结合位点，并在解旋酶活性启动中起到重要作用。NS3解旋酶的活性与RNA的复制是分不开的，在HCV前体蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用。由于HCV NS3蛋白的多功能性和它在病毒基因组复制及蛋白前体加工成熟中的重要性，它已经成为抗HCV感染的理想靶位。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位，也为丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP结合位点单克隆抗体识别表位。本发明的另一个目的在于提供上述B细胞表位的应用。本发明的另一个目的在于提供抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体，其能识别 上述丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位。本发明的再一个目的在于提供抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体的应用。为解决以上问题，本发明采用的技术方案为
丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位，具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK (SEQ IDN0:1)。上述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位在制备诊断、预防或治疗丙型肝炎试剂或药物中的应用。一种抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体，其重链为IgGl、轻链为K链，该单克隆抗体能与权利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位特异性结合。上述的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤
1)将权利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位免疫动物；
2)取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞株；
3)以有限稀释法克隆化培养阳性杂交瘤细胞株，获得稳定分泌抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的阳性杂交瘤细胞；
4)将获得的阳性杂交瘤细胞注射到动物腹腔内，收集、纯化腹水,获得抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体。优选的，产生免疫反应的小鼠的血清间接ELISA效价不低于I :51200。上述的抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体在在制备诊断、预防或治疗丙型肝炎药物中的应用。本发明的有益效果是
本发明的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位，为新发现的一个NS3蛋白抗原表位，该表位处于NS3 C端解旋酶第一区域的ATP结合位点。本发明的单克隆抗体能特异性识别上述ATP结合位点，使解旋酶活性减弱或消失，进而影响HCV的复制。抗体与此位点相结合，有望达到治疗HCV的目的。本发明的单克隆抗体，对HCV NS3蛋白具有很好的特异性识别能力，可以用于HCV血清学抗原检测，替代现有的HCV检测产品。
图I是PCR扩增目的序列的电泳 图2是HCV NS3重组蛋白(1192aa 1459aa)表达电泳鉴定 图3是HCVNS3重组蛋白(1192aa 1459aa)纯化电泳鉴定 图4是纯化单克隆抗体HCV NS3-2E12蛋白电泳图；图5是Western-Blot试验检测单克隆抗体HCV NS3-2E12与感染HCV的huh7. 5. I细胞中天然蛋白的反应性结果 图6是间接免疫荧光试验检测单克隆抗体HCV NS3-2E12与感染HCV的Huh7. 5. I细胞反应性结果 图7是竞争抑制ELISA测定单克隆抗体株HCV NS3-2E12抗原表位结果图。
具体实施例方式下面结合具体的实验对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。参照文献，截短型HCV NS3 (1192aa 1459aa)属于免疫活性区域，定为所要表达 的目的蛋白。可采用基因工程方法制备HCV NS3蛋白，或直接购买纯化的HCV NS3蛋白。基因方法为采用PCR方法克隆出编码HCV NS3 (1192aa 1459aa)的DNA序列，然后将该序列插入到表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，然后转化到表达宿主菌，构建得到工程菌株，工程菌株经诱导表达，分离纯化得到HCV NS3重组蛋白。该具体方法为很多种，以下例举一具体实施例
HCV NS3重组蛋白表达载体的构建
以NS2-4A基因序列为模板扩增目的基因序列(编码HCV NS3 (1192aa 1459aa)的DNA 序列)，NS2-4A 为编码 NS2, NS3, NS4A 的全基因序列，序列见 GenBank accession No.JN870283o设计引物NS3-P1:5’ -CGGAATTCGCGGTGGACTTTATACCCGTTG-3’ (SEQ ID NO: 2) ；NS3-P2:5’ -CCCAAGCTTGGTGACACATGTGTTACAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，并在引物中引入相应的限制性酶切位点EcoRI，Hindm(下划线标示)。PCR扩增目的基因50 μ L体系包括dNTP 4yL,IOXEx-Taq Buffer 5 μ L，P1、P2 各 I μ L，模版 DNA3 μ L, Ex-Tap DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O35. 5 μ L。PCR 反应条件为95 °C预变性 2min，94 °C 45s, 58 °C 45s, 72 °C Imin,扩增 30个循环后，72 °C延伸IOmin。PCR结果在IOg/ L琼脂糖凝胶上电泳检测(见图1，由图I可知目的基因片段804bp)，并用胶回收试剂盒回收。将PCR产物与克隆载体pMD20-T连接并按照pMD20-T载体说明书进行，感受态的制备、转化与阳性克隆的鉴定均按《分子克隆(第三版)》操作。挑取PMD20-T/ HCV NS3阳性克隆交由英潍捷基(上海)贸易有限公司。测序成功后，用EcoR I / HindIII双酶切pMD20_T/ HCV NS3，回收小片段即为目的基因片断。与经过相应核酸内切酶双酶切的pET_32a质粒连接，连接产物转入大肠杆菌DH5 α，阳性克隆提取质粒经PCR扩增及EcoR I / HindIII双酶切鉴定后，交由英潍捷基(上海)贸易有限公司。测序正确，成功构建表达载体pET-32a-NS3。重组蛋白的制备
将表达载体pET-32a-NS3质粒转化感受态BL21。将重组菌摇至对数生长期后，以终浓度ImM IPTG加入诱导目的蛋白表达。诱导后超声破碎，经电泳鉴定上清中含有目的蛋白，见图2，图中，M marker ；I :诱导如全囷；2 :诱导后全囷；3 :超声后上清；4 :超声后沉淀。Ni-NTA偶联的金属螯合亲和层析吸附柱吸附、纯化HCV NS3重组蛋白。300mM咪唑浓度的洗脱液(50mM PB缓冲液，500mM NaCl，200mM咪唑，pH7. 4)洗脱目的蛋白纯度达80%以上。洗脱的蛋白溶液用50mM PB缓冲液(pH7. 4)进行透析去除咪唑后，将蛋白浓缩并测定蛋白浓度，蛋白纯化电泳鉴定图见图3，图中，I :超声后上清；2 :流穿蛋白；3 :50mM咪唑浓度的洗脱；4 =IOOmM咪唑浓度的洗脱；5 200mM咪唑浓度的洗脱；6 300mM咪唑浓度的洗脱；7 500mM咪唑浓度的洗脱；M :marker,由图可见纯化后的重组蛋白为单一蛋白。制备HCV NS3的单克隆抗体
I.小鼠免疫
1)选择6周龄的纯系雌性BALB/c小鼠，用纯化的重组HCVNS3蛋白作为免疫抗原免疫小鼠，将NS3蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)乳化后，背部皮下多点注射；
2)初次免疫2周后将纯化的NS3与等体积的弗氏不完全佐剂(IFA)乳化后，背部皮下多点注射；
3)2周后，小鼠尾部取血，离心获得血清，将血清倍比稀释采用间接ELISA方法测效 价，效价需不低于I :51200 ；
4)融合前三天，腹腔注射重组HCVNS3蛋白；
三次免疫抗原的量分别为100 μ g/鼠、50 μ g/鼠、100 μ g/鼠。2.细胞融合
断颈处死上述免疫好的BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按5:1在50% PEG1450融合剂下进行融合，融合后以HAT选择培养基铺板置于37°C 5%C02培养。3.阳性克隆筛选及克隆
利用纯化的重组HCV NS3蛋白以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大培养后，用有限稀释法进行细胞克隆，经过三次克隆获得I株能稳定传代并分泌抗HCVNS3蛋白的特异性单克隆抗体细胞株HCV NS3-2E12。4.诱生腹水及抗体的纯化
12周龄，雌性BALB\c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡，500 μ L/只，一周后腹腔注射杂交瘤细胞(5Χ IO5Cell/鼠),7天左右开始抽取腹水。通过protein_G亲和层析柱纯化腹水,用超滤方法脱盐浓缩抗体。SDS-PAGE鉴定纯化后的单抗。取纯化后的抗体按1:1加入2XSDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min, 12000rpm离心lmin,取上清10 μ I进行分离胶12%,浓缩胶5%的SDS-PAGE电泳分离，结果见图4，图中，M marker ；1 HCV NS3-2E12单抗，由图可知，HCV NS3-2E12单抗分成了两条带，可见HCV NS3-2E12单抗由重链和轻链组成。单克隆抗体的鉴定
I.单克隆抗体的亚类鉴定
参照HyCult Biotechnol公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞HCV NS3-2E12进行鉴定，经鉴定HCV NS3-2E12单克隆抗体重链为IgGl，轻链为κ链。2. Western-Blot 鉴定
将感染HCV的Huh7. 5. I细胞超声破碎后离心。取离心后上清按I: I加入2XSDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min, 12000rpm离心lmin,取上清10 μ I进行分离胶10%,浓缩胶5%的SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脱脂奶粉TBST封闭2h ;—抗为纯化后的抗体(浓度lug/ml)孵育lh，TBST洗膜三次，每次IOmin ;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG & IgM作为二抗孵育lh，TBST洗膜后发光显影。试验中以布鲁氏杆菌BP26的一株单抗作为阴性对照。试验结果见图5，图中I : HCV NS3-2E12与感染HCV的Huh7. 5. I细胞中天然蛋白作用结果；2 :布鲁氏杆菌BP26的单抗与感染HCV的Huh7. 5. I细胞中天然蛋白作用结果，由图显示HCV NS3-2E12与天然蛋白在约为67KDa处有一明显条带，而阴性对照布鲁氏杆菌BP26的单抗不与蛋白反应。3.间接免疫荧光检测鉴定
将感染HCV的Huh7. 5. I细胞以IXioVml的密度接种到96孔板中。三天后，去除培养基，并用100%预冷的甲醇固定细胞，-20°C 20min ;弃甲醇后，每孔加IOOyL IFBufferdXPBS, 1%BSA, 2. 5Mm EDTA)室温孵育 Ih ;弃 IF Buffer，一抗为纯化后的抗体(浓度3ug/ml)4°孵育过夜，PBS洗三次；加荧光素标记二抗(lug/ml)37°孵育lh，PBS洗三次。突光显微镜下检测突光。实验中以布鲁氏杆菌BP26的一株单抗作为阴性对照。实验结果见图6，图中，I : HCV NS3-2E12与感染HCV的Huh7. 5. I细胞作用结果；2 :布鲁氏杆菌BP26的单抗与感染HCV的Huh7. 5. I细胞作用，结果显示HCV NS3-2E12与感染HCV的Huh7. 5. I细胞作用，荧光显微镜下可见到红色的荧光，主要分布在胞浆内。而阴性对照布鲁 氏杆菌BP26的单抗不与感染HCV的Huh7. 5. I细胞作用，荧光显微镜下无可见荧光。设计多肽初步筛选HCV NS3-2E12抗原表位
根据pET-32a-NS3测序结果，设计并合成了 29条重叠肽，长度16个氨基酸，每两条多肽之间重叠7个氨基酸(包括所有<8个氨基酸残基的表位)(表I)。每条多肽以终浓度5 μ g/ml，每孔100 μ I包被过夜；洗涤液PBST洗涤4次后，以PBS+4%BSA,每孔200 μ I,37°C封闭一小时；洗涤液洗涤4次后，以50 μ I各单克隆抗体株细胞上清+50 μ I抗体稀释液(PBST+1%BSA)为一抗37°C孵育45min ;洗涤液洗涤6次后，1:10000抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗鼠IgG&IgM为二抗，每孔100μ 1，37°C孵育30min ;洗涤液洗涤6次后，加入TMB-H2O2,每孔100 μ I避光显色IOmin,每孔50 μ I 2Μ H2SO4终止反应。测量450nm波长下每孔的光密度(0D)。以小鼠免疫HCVNS3重组蛋白后血清作为阳性对照，阴性对照为小鼠免疫前血清。以待测孔0D450nm彡2. I倍阴性对照0D450nm判为阳性。经过测定单抗HCVNS3-2E12仅与多肽P05反应。
权利要求
1.丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位，具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK(SEQID NO:I)。
2.权利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位在制备诊断、预防或治疗丙型肝炎试剂或药物中的应用。
3.一种抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体，其重链为IgGl、轻链为K链，该单克隆抗体能与权利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位特异性结合。
4.权利要求3所述的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤 1)将权利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B细胞表位免疫动物； 2)取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞株； 3)以有限稀释法克隆化培养阳性杂交瘤细胞株，获得稳定分泌抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的阳性杂交瘤细胞； 4)将获得的阳性杂交瘤细胞注射到动物腹腔内，收集、纯化腹水，获得抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于产生免疫反应的小鼠的血清间接ELISA效价不低于I :51200。
6.权利要求3或4所述的抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的单克隆抗体在在制备诊断、预防或治疗丙型肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP结合位点单克隆抗体识别表位，所述表位具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK(SEQ ID NO:1)。本发明还公开了识别上述表位的单克隆抗体，及上述表位与单克隆抗体的应用。本发明的丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP结合位点单克隆抗体识别表位，为新发现的一个NS3蛋白抗原表位，该表位处于NS3C端解旋酶第一区域的ATP结合位点。本发明的单克隆抗体能特异性识别上述ATP结合位点，使解旋酶活性减弱或消失，进而影响HCV的复制抗体与此位点相结合，有望达到治疗HCV的目的。
文档编号A61K39/42GK102766195SQ201210242409
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者李婷婷, 王文敬, 边奕鑫, 黎诚耀 申请人:南方医科大学