使用孔和Hel308解旋酶表征目标多核苷酸的酶方法

使用孔和Hel308解旋酶表征目标多核苷酸的酶方法
【专利摘要】本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和Hel308解旋酶或能结合目标多核苷酸内部核苷酸的分子马达。所述解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动。
【专利说明】使用孔和Hel308解旋酶表征目标多核苷酸的酶方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和Hel308解旋酶或能结合目标多核苷酸内部核苷酸的分子马达。所述解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动。
【背景技术】
[0002]当前，需要适用于各种应用的快速且便宜的多核苷酸(即DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是由于它们依赖于扩增技术产生大量的多核苷酸并需要大量的专业荧光化学品进行信号检测。
[0003]跨膜孔(纳米孔)具有极大潜力作为聚合物和许多小分子的直接的，电生物传感器。特别是最近的聚焦点是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
[0004]穿过纳米孔施加电势时，当分析物诸如核苷酸短暂停留在桶内一段时间将会有电流的变化。核苷酸的纳米孔检测给出已知标记和时间的电流变化。在“链测序(StrandSequencing)”方法中，使单个多核苷酸链穿过所述孔并获得对各核苷酸的鉴定。链测序可涉及使用核苷酸调控蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的运动。

【发明内容】

[0005]本发明人已经 证明Hel308解旋酶能够控制多核苷酸穿过孔的运动尤其当在施加电势诸如电压时。所述解旋酶能使目标多核苷酸以可控和逐步的方式逆着或顺着由所施加的电压引起的电场进行运动。令人惊奇地，所述解旋酶能在高的盐浓度下起作用，这对于表征多核苷酸，尤其是使用链测序的方法确定多核苷酸的序列，是有利的。这将在下文进一步详细描述。
[0006]相应的，本发明提供一种表征目标多核苷酸的方法，包括:
[0007](a)将所述目标多核苷酸与跨膜孔和Hel308解旋酶接触，使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔运动，并使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用；以及
[0008](b)在一次或多次相互作用中测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
[0009]本发明还提供了:
[0010]-一种用于表征目标多核苷酸的传感器的形成方法,包括在孔和Hel308解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器；
[0011]-ΗΘ1308解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用；
[0012]-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)Hel308解旋酶；以及
[0013]-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，包括多个孔和多个Hel308解旋酶。
[0014]本发明人还证明了分子马达能结合目标多核苷酸的内部核苷酸并能控制目标多核苷酸穿过孔的运动尤其当在该孔施加电势诸如电压时。所述分子马达能使目标多核苷酸以可控和逐步的方式逆着或顺着由所施加的电压引起的电场运动。令人惊奇的是，在本发明方法中使用分子马达时，可以控制目标多核苷酸整条链穿过纳米孔的运动。这对于多核苷酸的表征，尤其是使用链测序的方法确定多核苷酸的序列，是有利的。
[0015]因此，本发明还提供一种表征目标多核苷酸的方法，包括:
[0016](a)将所述目标多核苷酸与跨膜孔和能结合该目标多核苷酸的内部核苷酸的分子马达接触，使得所述分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动，并使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用；以及
[0017](b)在一次或多次相互作用中测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1。a)使用解旋酶控制DNA穿过纳米孔的运动的例示图。I)将ssDNA底物(a)与含有胆固醇标签(c)的退火引物(b)添加到双分子层(d)的顺侧。胆固醇标签结合到所述双分子层上，在双分子层上富集所述底物。2)添 加到顺式隔间(compartment)的解旋酶Ce)连接到DNA上。在二价金属离子和NTP底物的存在下，所述解旋酶沿着所述DNA运动。3)在施加的电压下，通过DNA上的前导区部分纳米孔(f)捕获所述DNA底物。在施加的电势的力的作用下，所述DNA被牵拉穿过所述孔直到连接在DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触，防止进一步的不受控的DNA移位。在该过程中dsDNA部分(诸如引物)被去除。所述解旋酶沿着所述DNA以3’到5’的方向运动，以逆着所施加的电场将螺旋状(threaded)DNA牵拉出所述孔。4)解旋酶将所述DNA牵拉出所述纳米孔，将其供回到所述顺式隔间。穿过所述纳米孔的DNA的最后部分为所述5’ -前导区。5)当所述解旋酶将所述DNA移出所述纳米孔后，其释放回所述顺式隔间中。b)实施例中使用的DNA底物的设计(a=具有50T前导区(b)的400mer DNA链，C=引物，d=胆固醇标签)。
[0019]图2是解旋酶能以可控方式移动DNA穿过纳米孔，随着DNA穿过纳米孔的运动产生逐步变化的电流。解旋酶-DNA事件(在上部分图以小箭头标明)的例子(180mV，400mMKCl, Hepes ρΗ8.0, 0.15nM400mer DNA, 10nM Hel308Mbu, ImM DTT, ImM ATP, ImM MgCl2)。上部)，获得Hel308400mer DNA事件的电流(y轴，pA) vs.时间(x轴，s)的分图。所述开孔(open-pore)电流为~180pA (标为A)。DNA在施加的电势(+180mV)的力的作用下被所述纳米孔捕获。具有酶连接的DNA产生长的模块(block)(在该条件下，在~60pA)，随着酶移动DNA穿过所述孔,该模块显示出逐步变化的电流。中部)该中间的分图(middle sect1n)是DNA事件(I)中的一个的放大图，显示DNA-酶的捕获，随着DNA被牵拉出所述孔时电流的逐步变化，并在出所述纳米孔之前以特征性的长PolyT水平结尾。下部)，随着DNA移动穿过所述纳米孔电流逐步变化的放大图。
[0020]图3是解旋酶控制的DNA运动产生与DNA穿过所述纳米孔时一致的电流变化模式(图3a和3b中，y轴=电流(pA)，x轴时间(s))。来自四个典型DNA事件的最后~80的电流变化例子以PolyT水平而结尾。这四个例子(两个在3a中，两个在3b中)表明观察到一致的电流变化模式。
[0021]图4是提高的盐浓度提高了孔电流并产生更大的DNA分辨范围(范围=覆盖DNA电流变化的最小电流到最大电流)。在400mM，1M,和2M KCl下，解旋酶-DNA事件的例子示于图 4 和图 4c (图 4a 至 4c 中，180mV, Hepes ρΗ8.0, 0.15nM400mer DNA SEQ ID NOs: 59 和60，10nM Hel308Mbu, ImM DTT, ImM ATP, ImMMgCl2)。上部的轨迹(traces)显示了以 polyT水平结尾的完整事件(通过A用1-开口标出)，下面的轨迹显示了每个事件的最后10秒的急速上升部分，具有150pA的恒定j轴电流大小。盐浓度由400mM KCl提高到2M KCl导致开口电流提高了~350%((1-开口由~180pA到~850pA))，以及分辨范围提高了~200%(~25pA到~75pA)。图4d是DNA分辨范围随盐浓度变化的图(y轴=范围(pA)，x轴=盐(mM))。
[0022]图5是解旋酶(a)以至少两种操作模式控制DNA的移动。所述解旋酶沿着DNA以3’_5’的方向移动，但在纳米孔(c)中的DNA的方向(依赖于DNA的哪一端被捕获)意味着所述酶可以用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔(图5b )，或者顺着施加的电场移进所述纳米孔(图5a)。图5b)，当DNA的5’端被捕获时，解旋酶逆着通过电压施加的电场的方向工作，将DNA牵拉出所述纳米孔直到DNA被释放回所述顺室。右边是He 1308逆着施加的电场沿着5’端向下运动得到的DNA-解旋酶事件的实例。图5a)，当DNA在3’向下被所述纳米孔捕获时，所述酶将DNA顺着电场的方向移进所述纳米孔，直到其完全穿过所述孔移位，并释放在所述双分子层的反侧。右边是来自Hel308沿3’顺着施加的电场向下运动得到的DNA-解旋酶事件的实例(y轴=电流(pA), x轴=时间(S))。电流的轨迹在DNA的5’向下或3’向下的方向之间变化。 [0023]图6是检测酶活性的荧光分析。a)使用常规的荧光底物检测解旋酶(a)用于置换杂交的dsDNA的能力。I)所述荧光底物链(终浓度10nM)具有3’ ssDNA突出部分，以及杂交的dsDNA的40个碱基部分。主链上部(b) (The major upper strand)在5’末端具有羧基突光素碱基(c),并且所述杂交的互补链(d)在3’末端具有黑洞淬灭剂(black-holequencher (BHQ-1))碱基(e)。当杂交时，来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括，与荧光底物的较短链(d)互补的I μΜ的捕获链(f)。2)，在ATP(ImM)和MgCl2(5mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(10nM)连接到所述荧光底物的3’尾部，沿着所述主链移动，并如图所示置换所述互补链。3)，再次地(once)具有BHQ-1的互补链完全取代主链荧光上的荧光素。4)，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火与丢失荧光。b)含有400mM到2M不同浓度的KCl(x轴，mM)的缓冲液(1mM Hepes pH8.0, ImM ATP, 5mM MgCl2, 10nM 荧光底物 DNA, I μ M 捕获 DNA)的初始活性(y轴，相对活性)速率的图。
[0024]图7显示了解旋酶控制的DNA事件的实例，使用了不同的He 1308解旋酶(图7a_7c中，y 轴=电流(pA), X 轴=时间(min), 180mV, Hepes pH8.0, 0.15nM400mer DNA SEQ ID NO: 59和 SEQ ID NO: 60，10nM Hel308, ImM DTT, ImM ATP, ImM MgCl2): He 1308Mhu (a), He 1308Mok (b)和Hel308Mma(c)。这些DNA事件代表了典型的DNA穿过MspA纳米孔的受控运动(WpolyT水平结尾)的实例。
[0025]图8是测试解旋酶内部连接活性的荧光分析。A)使用常规的荧光底物分析解旋酶连接到缺少天然3’末端的DNA的能力，使得它们能随后置换杂交的dsDNA。所述荧光底物链(终浓度50nM)具有3’ ssDNA突出部分，以及杂交的dsDNA的40个碱基部分。主链上部(a)用4个连续的非DNA起源的三甘醇间隔物(称为“间隔9”基团，标记为b)修饰，在3’端或者在内部，在突出部分和dsDNA的连接处(作为阴性对照)进行修饰。进一步的，所述主链在5’端具有羧基荧光素碱基(C)，并且所述杂交的互补链(d)在3’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基(e)。当杂交时，来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括，与荧光底物的较短链(d)互补的捕获链(ΙμΜ,?.)。B)，在ATP(ImM)和MgCl2(ImM)存在下，添加到含3’末端的“间隔9”基团的所述底物中的Hel308解旋酶同源物(20nM)能连接到所述荧光底物的ssDNA突出部分，沿着所述主链移动，并置换所述互补链。C)，再次地，具有BHQ-1的互补链完全取代主链荧光上的荧光素。D)过量的捕获链优先退火到互补链DNA以防止初始底物重新退火与丢失荧光。
[0026]图9显不了 He 1308-介导的dsDNA转换(turnover)的相对速率，在400mMNaCl, 1mM Hepes, pH8.0, ImM ATP, ImM MgCl2, 50nM 荧光底物 DNA, I μ M 捕获 DNA 中比较3’ -未修饰的DNA和3’ - “间隔9”DNA(y轴=3’ - “间隔9”的相对活性(天然3’的重量 ％)，X 轴=a (Mbu), b (Csy), c (Tga), d (Mma), e (Mhu), f (Min), g (Mig), h (Mmaz), i (Mac), j (Μok), k (Mth), I (Mba), m (Mzh))。
[0027]图10是使用解旋酶控制DNA穿过实施例5中所使用的纳米孔进行运动的示意图。A)具有退火引物(SEQ ID N069)(标记的y)的DNA底物(SEQ ID NO:67 (标记的w)和SEQID NO:68 (标记的X))被添加到所述双分子层顺侧，所述引物具有连接的胆固醇标签。胆固醇标签结合到所述双分子层，使得底物在所述双分子层表面富集。添加到所述顺式隔间的解旋酶(标记的I)连接到SEQ ID N067的4bp前导区。B)在施加的电压下，所述DNA底物经DNA上的5’前导区被所述纳米孔捕获，脱去SEQ ID N069。C)在施加的电场的力的作用下，DNA被牵拉进所述孔，直到所结合的解旋酶(I)接触所述孔的顶部并防止进一步的不受控的移位。在该过程中，所述反义链SEQID N068从所述DNA链上脱离。D)在二价金属离子和NTP底物存在下，在所述孔顶部的所述解旋酶(I)沿着所述DNA移动并控制DNA穿过所述孔的移位。所述解旋酶沿着所述DNA以3’到5’的方向移动，逆着施加的电场的方向将螺旋状DNA从所述孔牵拉出。顺侧(在此情况下为3’)上暴露的单链DNA可以被另外的解旋酶(2-4个)连接，在末端核苷酸或是在内部核苷酸连接。E)如果在所述孔(I)的解旋酶从DNA脱离，所述DNA在电场作用下被牵拉到所述孔中直到下一个在DNA上的解旋酶(2)到达所述孔。在所述孔处的解旋酶将所述DNA牵拉出所述纳米孔，将其供回到所述顺式隔间。DNA最后穿过所述纳米孔的部分是5’-前导区。F)当解旋酶将DNA移出所述纳米孔时，其释放回所述顺式隔间。箭头指示了 DNA运动的方向。
[0028]图11显示了在每个解旋酶事件中，随着Hel308解旋酶同源物Mbu控制DNA链穿过所述MspA孔的移位(X-轴)，在900mer的纳米孔中DNA区域的位置(y_轴)变化的数据图(y轴=在900mer中的位置，x轴=指数)。A-C显示了大约从DNA链的开头到DNA链的结尾(通过polyT前导区结束(exiting via polyT leader))整条DNA链的典型移位事件的实例，而事件D是不完全的DNA移位的实例，其中酶的脱离意味着DNA不曾使该酶到达该DNA链的末端。滑动(例如，由虚线圆圈强调的大的滑动)表明序列由于酶的脱离，落回到链上之前的点。当酶脱离时，DNA将在电场力的作用下被牵拉回纳米孔，直到另一个酶进一步沿着所述链接触所述孔，然后继续进行解旋酶的运动。
[0029]图12显示了随着Hel308解旋酶同源物Tga控制DNA链穿过所述MspA孔进行移位,900mer的位置变化的数据图(y轴=在900mer中的位置，x轴=指数)。事件A-D显示了整个DNA链的移位。
[0030] 图13显示了用于比较Hel308Mbu解旋酶(SEQ ID NO: 10)和Hel308Mok解旋酶(SEQID NO:29)的酶进行性(p1cessivity)的荧光分析图。使用常规的荧光底物分析解旋酶置换杂交的dsDNA的能力。所述荧光底物(终浓度50nM)具有3’端ssDNA突出部分，以及80(al)部分和杂交dsDNA的33个碱基对(a2)部分(分图A，SEQ ID NO: 70)。主链底部“模板”链(I)与临近其3’端突出部分的80nt的“阻断”链(“blocker”strand) (SEQ ID NO:71)杂交，并且与33nt荧光探针(3，SEQ ID NO: 72)杂交，所述探针的5’端和3’端分别标记有羧基荧光素(FAM) (4)和黑洞淬灭剂(BHQ-1) (5)碱基。当杂交时，FAM远离所述BHQ-1，所述底物基本上是带荧光的。在ATP(ImM)和MgCl2(1mM)存在下(APT和MgCl2的添加分别用7和8标注)，解旋酶(6，20nM)连接到所述底物的3’突出部分(SEQ ID NO: 70)，沿着下游(lower)的链移动，并开始置换80nt的阻断链(SEQ ID NO:71)，如分图B所示。在前进过程中，解旋酶也替换了荧光探针(分图C，SEQ ID NO:72，其5’端用羧基荧光素(FAM)标记，在其3’端用黑洞淬灭剂(BHQ-1)标记)。所述荧光探针设计为使得其一旦被替换，5’端和3’端能自身互补并由此形成运动学上稳定的发卡结构，防止探针与模板链重新退火(分图D)。在形成发卡产物后，FAM到达临近BHQ-1的位置并且其荧光被淬灭。因此一个能替换80mer的阻断链(SEQ ID NO: 71)和荧光链(SEQ ID NO: 72，其5’端用羧基荧光素(FAM)标记，在其3’端用黑洞淬灭剂(BHQ-1)标记)的进行性酶(processive enzyme),能随着时间导致荧光的减弱。然而，所述酶具有小于80nt的进行性时，其不能替换荧光链(SEQ ID NO: 72，其5’端用羧基荧光素(FAM)标记，在其3’端用黑洞淬灭剂(BHQ-1)标记)，因此，所述阻断链(SEQ ID NO:71)将与所述主链底部重新退火(分图E)。
[0031]图14显示了用于对照目的的其他常用荧光底物。用于阴性对照的底物与图3中使用的相同，但缺少3’突出部分(分图A，(SEQ ID N0:71 (标记为1)，72 (标记为2)(其5’端用羧基荧光素(FAM) (3)标记，在其3’端用黑洞淬灭剂(BHQ-1) (4)标记)和73 (标记为5，由80bp部分(al)和33bp部分(a2)组成)))。类似于图3中描述的底物，但缺少80个碱基对部分(SEQID NO:72 (标记为2)(其5’端用羧基荧光素(FAM) (3)标记，在其3’端用黑洞淬灭剂(BHQ-1) (4)标记)和74 (标记为6，由28bp部分(a3)组成))的底物用作活性(但不一定是进行性的)解旋酶的阳性对照(分图B)。
[0032]图15显示了检测Hel308Mbu解旋酶(SEQ ID NO: 10，空圆圈)和Hel308Mok解旋酶(SEQ ID NO: 29，黑三角)相对于如图13所示的底物在缓冲液(400mM NaCl, 1mM HepesρΗ8.0, ImM ATP, 1mM MgCl2, 50nM 荧光底物 DNA (SEQ ID NO:70, 71 和 72 (在其 5’端标记羧基荧光素(FAM)，在其3’端标记黑洞淬灭剂(BHQ-1))中的进行性，得到的时间依赖性荧光变化图。相比于He 1308Mbu (SEQ ID NO:1 O)，He 1308Mok显示出荧光的减弱，表明这些复合体的进行性提闻。
[0033]图16显示了检测Hel308Mbu解旋酶(SEQ ID NO: 10，空圆圈)和Hel308Mok解旋酶(SEQ ID NO:29,黑三角)相对于缓冲液(400mM NaCl, 1mM Hepes ρΗ8.0, ImM ATP, 1mMMgCl2, 50nM荧光底物DNA(SEQ ID NO: 72 (用羧基荧光素(FAM)在其5’端标记，在其3’端标记黑洞淬灭剂(BHQ-1))和SEQ ID NO:74)中阳性对照的底物(如图14中分图B所示，SEQID NO:72 (用羧基荧光素(FAM)在其5’端标记，在其3’端标记黑洞淬灭剂(BHQ-1))和74)的进行性，得到的时间依赖性荧光变化图。该阳性对照表明两个解旋酶都实际均具有活性，如两个样本中减弱的荧光所表示的。
[0034]序列表的说明[0035]SEQ ID NO:1显示了密码子优化的、编码MS-Bl突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并含有下列突变:D90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0036]SEQ ID NO: 2显示了 MspA单体的MS-Bl突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并含有下列突变:D90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0037]SEQ ID N0:3 显示了编码 α -溶血素-El11Ν/Κ147Ν( a -HL-NN; Stoddart 等人，PNAS，2009;106(19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。
[0038]SEQ ID NO:4显示了 a -HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO: 5 到 SEQ ID NO: 7 显示了 MspB, C 和 D 的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO: 8显示了 He 1308模序(motif)的氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO: 9显示了延长的He 1308模序的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO: 10到SEQ ID NO:58显示了 Hel308解旋酶和表5中的模序的氨基酸序列。
[0043]SEQ ID NO: 59到SEQ ID NO: 74显示了实施例中使用的序列。
[0044]SEQ ID NO:75显示了 57页之前的比对中的Hel308Dth的序列。
[0045]SEQ ID NO :76显示了 57页之前的比对中的Hel308Mmar的序列。
[0046]SEQ ID NO:77显示了 57页之前的比对中的Hel308Nth的序列。
[0047]SEQ ID NO:78显示了 57页之前的比对中的共有序列。
【具体实施方式】
[0048]可以理解公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的需求进行调整。也可以理解本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的【具体实施方式】，不意为对本发明的限制。
[0049]另外，如在说明书和随附的权利要求书中使用的，单数形式的“一个”，“该”，“所述”包括复数，除非本文另有明确说明。因此，例如，涉及“一个孔”时包括两个或多个这样的孔，涉及“一个解旋酶”时包括包括两个或多个这样的解旋酶，涉及“一个多核苷酸”时包括两个或多个多这样的核苷酸，等。
[0050]所有在本文中引用的出版物，专利和专利申请，无论前文或后文，均以全文参考的方式纳入本文中。
[0051]本发明的He 1308方法
[0052]本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括将所述目标多核苷酸与跨膜孔和Hel308解旋酶接触，使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动，并使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用。然后使用现有技术已知的标准方法测定目标多核苷酸的一个或多个特征。步骤(a)和(b)优选在对该孔施加电势时实施。如下面进一步详细描述的，施加的电势典型的在所述孔和解旋酶之间形成复合体。施加的电势可以是电压电势。替换的，施加的电势可以是化学电势。其一个例子是在整个脂膜中使用盐梯度。Holden 等人,J Am Chem Soc.2007Julll; 129 (27):8650-5 中公开了盐梯度。
[0053]在一些情况下，在一次或多次相互作用过程中穿过所述孔的电流用于确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。
[0054]所述方法具有多个优势。首先，本发明人出乎意料的发现Hel308解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，使得本发明方法能够在高的盐浓度下实施。在链测序中，电荷载体，诸如盐，是产生导电溶液必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和异位目标多核苷酸并且当所述多核苷酸穿过所述孔时测定产生的序列依赖性电流变化。因为测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过10mM的盐浓度是理想的并且IM以上的盐浓度是优选的。本发明人出乎意料的发现Hel308解旋酶能在高达例如2M的盐浓度下有效发挥作用。
[0055]第二，当施加电压时，Hel308解旋酶能出乎意料的朝两个方向，即逆着或顺着由施加的电压产生的电场移动目标多核苷酸。因此，本发明的方法可以一种或两种优选方式实施。根据目标多核苷酸穿过所述孔的运动方向，即逆着或顺着所述电场，获得不同的信号。下面将对这进行详细描述。
[0056]第三，Hel308解旋酶通常一次移动所述目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。Hel308解旋酶由此可作为单碱基棘齿(ratchet)。当然，这对测序目标多核苷酸是有利的，因为使用所述孔可以鉴定基本上全部一如果不是全部的话一目标多核苷酸中的核苷酸。
[0057]第四，Hel308解旋酶能控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的运动。这意味着根据本发明可以表征多种不同的目标多核苷酸。
[0058]第五，Hel308 解旋酶表现出非常耐受施加的电压产生的电场。本发明人发现在“解链”状态下多核苷酸几乎不发生运动。这是非常重要的，因为这意味着，当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时，不会发生不希望的“向后”运动问题。
[0059]第六，Hel308解旋酶非常容易制备和操控。因此它们非常适合用于直接且便宜的测序方法。
[0060]本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸，诸如核酸，是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰，例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。
[0061]核苷酸通常含有碱基，糖和至少一个磷酸基团。核苷碱基通常是杂环的。核苷碱基包括但不局限于，嘌呤和嘧啶，更具体地，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不局限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸，二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接在核苷酸的5’或3’端。
[0062]核苷酸包括但不局限于，腺苷单磷酸(AMP)，鸟苷单磷酸(GMP)，胸苷单磷酸(TMP)，尿苷单磷酸(UMP)，胞嘧啶核苷单磷酸(CMP)，环状腺苷单磷酸(cAMP)，环状鸟苷单磷酸(cGMP)，脱氧腺苷单磷酸(dAMP)，脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)，脱氧胸苷单磷酸(dTMP)，脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP，TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 或 dCMP。
[0063]核苷酸可以是脱碱基的(即缺少核苷碱基)。
[0064]所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少多核苷酸的一部分优选是双链的。[0065]所述多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述目标多核苷酸可包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何人造核酸，诸如肽核酸(PM)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TM)，锁定核酸(LNA)，或其他具有核苷侧链的合成聚合物。
[0066]目标多核苷酸的整体或仅部分可以通过所述方法表征，所述目标多核苷酸可具有任何长度，例如，所述多核苷酸可以为至少10，至少50，至少100，至少150，至少200，至少250，至少300，至少400或至少500个核苷酸对的长度。
[0067]目标多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样本实施。替换的，对样本实施本发明可以是为了确认所识别的一个或多个目标多核苷酸，所述目标多核苷酸已知或期望存在于所述样本中。
[0068]所述样 本可以是生物样本。本发明可以针对由任何生物体或微生物体获得或提取的样本在体外实施。所述生物体或微生物体通常是古核的(archaean)，原核的或真核的并通常属于以下五界中的一个:植物界，动物界，真菌界，无核原生物界和原生生物界。本发明可以针对由任何生病毒获得或提取的样本在体外实施。所述样本优选为液体样本。所述样本通常包括患者的体液。所述样本可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，优选血液，血浆或血清。通常，所述样本是来自人的，但替换的，其可以是来自其他哺乳动物的，诸如商购可获得的家畜诸如马，牛，羊或猪，或可替换的，为宠物，如猫或狗。可替换的，源自植物的样本通常获得自经济作物，诸如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，大卖，燕麦，油菜，玉米，大豆，稻米，香蕉，苹果，西红柿，土豆，葡萄，烟草，黄豆，扁豆，甘蔗，可可豆，棉花。
[0069]所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选为液体样本。所述非生物样本的实例包括外科手术液体，水诸如饮用水，海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
[0070]通常在分析前对所述样本进行处理，例如，通过离心或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，诸如红血细胞。可以在获取所述样本后立即进行检测。通常也可以在分析前储存所述样本，优选在低于-70°C储存。
[0071 ] 跨膜孔是一种允许水合离子在施加的电势的驱动下从膜的一侧流向膜的另一侧的结构。
[0072]根据本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域已知的。所述膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有亲水性和亲脂性的两性分子诸如磷脂质形成的层。所述两性分子层可以是单层或双层。
[0073]所述膜优选是脂质双分子层。脂质双分子层是细胞膜的模型并被用作多种实验研究的优良平台。例如，脂质双分子层能被用于通过单通道记录在体外研究膜蛋白。替换的，脂质双分子层可以用作生物传感器以检测多种物质的存在。所述脂质双分子层可以是任何的脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不局限于，平面脂质双分子层，支撑双分子层或脂质体。所述脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层公开在国际申请N0.PCT/GB08/000563 (如W02008/102121所公开的)，国际申请N0.PCT/GB08/004127(如 W02009/077734 所公开的)和国际申请 N0.PCT/GB2006/001057 (如W02006/100484 所公开的)。
[0074]形成脂质双分子层的方法为本领域已知的，合适的方法公开在实施例中。脂质双分子层通常通过Montal 和 MuelIer (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，1972;69:3561-3566)的方法形成，其中脂质单分子层穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。
[0075]所述Montal&Mueller的方法非常受欢迎，因为其成本经济并是一种相对迅速的形成具有良好质量的适合蛋白质孔嵌入的脂质双分子层的方法。其他常规的用于形成脂质双分子层的方法包括脂质体双分子层的tip-dipping, painting bilayers和patch-clamping 方法。
[0076]在一个优选实施方式中，所述脂质双分子层如国际申请N0.PCT/GB08/004127(如W02009/077734所公开的)所述形成。
[0077]在另一个优选实施方式中，所述膜为固态层。固态层不来源于生物体。换句话，固态层不是由生物学环境获得或分离出的，所述生物学环境诸如生物体或细胞或是生物学可获得的结构的合成制得的产物(synthetically manufactured vers1n)。固态层可以通过有机或无机材料形成，所述有机或无机材料包括但不局限于微电子材料，绝缘材料诸如Si3N41Ai2O3,和S1，有机和无机聚合物诸如聚酰胺，塑料诸如Teflon?或弹性体诸如双组
分加成固化硅橡胶，和玻璃。所述固态层可以由单原子层形成，诸如石墨烯，或者只有几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层在国际申请N0.PCT/US2008/010637 (如W02009/035647所公开的)中公开。
[0078]所述方法通常使用以下的物质进行实施:(i)含有孔的人工双分子层，(ii)分离出的，天然存在的含有孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。所述方法优选使用人工脂质双分子层实施。所述双分子层除孔之外还可以含有其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。适合的设备和条件如下所述。本发明的方法通常在体外实施。
[0079]所述多核苷酸可以偶联到所述膜。这可使用任何已知方法完成。如果所述膜是两性分子层，诸如脂质双分子层(如上文详细所述的)，所述多核苷酸优选可以通过存在于所述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水锚(anchor)偶联到所述膜。所述疏水锚优选为脂质，脂肪酸，固醇，碳纳米管或氨基酸。
[0080]所述多核苷酸可以直接偶联到所述膜。所述多核苷酸优选通过连接体(linker)偶联到膜。优选的连接体包括但不局限于，聚合物诸如多核苷酸，聚乙二醇(PEG)和多肽。如果多核苷酸直接偶联到所述膜上，由于所述膜与所述解旋酶之间的距离，表征不能进行到所述多核苷酸的末端，将丢失一些数据。如果使用连接体，所述多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体，连接体可以在任何位置连接到所述多核苷酸。所述连接体优选在尾部聚合物连接到所述多核苷酸。
[0081]所述偶联可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，暂时性的偶联是优选的。如果一个稳定偶联的分子直接连接在多核苷酸的5’或3’端，由于所述双分子层与所述解旋酶的活性位点之间的距离，表征不能进行到所述多核苷酸的末端，将丢失一些数据。如果所述偶联是暂时性的，则当偶联的末端随机的变为相对于双分子层是自由的状态时，所述多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定或暂时性的连接的化学基团在下面更详细的描述。所述多核苷酸可以使用所述胆固醇或脂肪酰链暂时性地与两性分子层或脂质双分子层偶联。可以使用任何具有6-30个碳原子长度的脂肪酰链，诸如十六烷酸。
[0082]在优选实施方式中，将多核苷酸偶联到脂质双分子层上。多核苷酸与合成的脂质双分子层的偶联可以预先用多种不同的共享策略(tethering strategies)实施。这些策略综合在下面的表1中。
[0083]表1
[0084]
【权利要求】
1.一种表征目标多核苷酸的方法，包括: (a)将目标多核苷酸与跨膜孔和Hel308解旋酶接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的运动以及所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔的相互作用；以及 (b)在一次或多次相互作用中测定所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述目标多核苷酸的长度，(?)所述目标多核苷酸的相似性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(iv)所述目标多核苷酸的模序以及(V)所述目标多核苷酸是否被修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述目标多核苷酸经甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质，或用一个或多个标记物，标签或间隔物进行修饰。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述电测量为电流测量，阻抗测量，隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括: (a)将目标多核苷酸与跨膜孔和Hel308解旋酶接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔 的运动，以及使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用；和 (b)测定在一次或多次相互作用过程中穿过所述孔的电流，以测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述方法进一步包括跨所述孔施加电压到以形成所述孔和解旋酶的复合体的步骤。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中至少所述多核苷酸的一部分为双链。
9.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述孔为跨膜蛋白孔或固态孔。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔选自溶血素，杀白细胞素，耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷酯酶A,奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述跨膜蛋白为(a)由SEQIDN0:2所示的8个相同单体形成的跨膜蛋白，或(b) (a)中跨膜蛋白的变体，基于氨基酸相似性，该变体中7个亚基中的一个或多个相比于SEQ ID NO:2的整个序列具有至少50%的同源性并保留有孔活性。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述跨膜蛋白为(a)SEQIDN0:4所示的7个相同单体形成的α-溶血素，或(b)所述α-溶血素的变体，基于氨基酸相似性，该变体中7个亚基中的一个或多个相比于SEQ ID NO:4的整个序列具有至少50%的同源性并保留有孔活性。
13.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述Hel308解旋酶包括氨基酸模序Q-X1-X2-G-R-A-G-R(SEQ ID NO: 8)，其中Xl为C，M或L且X2为任意氨基酸残基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中X2为A,F，M, C，V，L，I，S，T或P。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述Hel308解旋酶为表4或5所示的解旋酶或其变体中的一个。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述Hel308解旋酶包括(a)SEQ ID序号:10，I3，16，19，22，25，28，29，32，33，34，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47, 48，49，50，51，52，53，54，55和58中任一个所示的序列，或(b) (a)中序列的变体，基于氨基酸相似性，该变体相比于整个长度的(a)中序列具有至少40%的同源性并保留解旋酶活性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Hel308解旋酶包括(a)SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:33所示的序列，或(b) (a)中序列的变体，基于氨基酸相似性，该变体相比于SEQID NO: 10或SEQ ID NO:33的整个序列具有至少40%的同源性并保留有解旋酶活性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述Hel308解旋酶包括，基于氨基酸相似性，相比于SEQ ID NO: 10的残基20到211或20到727具有至少70%的同源性的序列。
19.根据前述任一权利要 求所述的方法，其中所述Hel308解旋酶能结合到所述目标多核苷酸的内部核苷酸。
20.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施，所述盐可选的为KCl。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述盐浓度为至少1.0M。
22.—种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法,包括在孔和Hel308解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过(a)使所述孔和所述解旋酶在所述目标多核苷酸的存在下接触以及(a)跨所述孔施加电势而形成。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述电势是电压电势或化学电势。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过将所述孔共价连接到所述解旋酶而形成。
26.Hel308解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用。
27.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)Hel308解旋酶。
28.一种用于表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个Hel308解旋酶。
29.根据权利要求28所述的分析装置，其中所述分析装置包括: 传感器设备，能支撑多个孔，并能可操作的使用所述孔和解旋酶进行多核苷酸的表征； 至少一个存储器，存储用于进行表征的材料； 流体系统，配置为从至少一个存储器可控地向所述传感器设备提供材料；以及多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置为选择性地从所述容器向所述传感器设备提供样本。
30.一种用于表征目标多核苷酸的方法,包括: (a)将目标多核苷酸与跨膜孔和能与所述目标多核苷酸的内部核苷酸结合的分子马达接触，使得所述分子马达控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的运动，以及使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用；以及 (b)在一次或多次相互作用过程中测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述分子马达为解旋酶或Hel308解旋酶。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述方法如权利要求2-21中任一项所定义的。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸包括至少5000个核苷酸。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述分子马达包括(a)SEQID序号:22，33或52所示的序列或(b) (a)中序列的变体，基于氨基酸相似性，该变体相比于SEQID序号:22，33或52的整个序列具有至少70%的同源性并保留有解旋酶活性。
35.一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和能与所述目标多核苷酸的内部核苷酸结合的分子马达之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器。
36.能与目标多核苷酸内部核苷酸结合的分子马达在控制所述目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用。
37.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)能与目标多核苷酸内部核苷酸结合的分子马达。
38.一种用于表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个能与目标多核苷酸内部核苷酸结合的分子马达。
39.一种表征目标多核苷酸的方法,包括: (a)将目标多核苷酸与 跨膜孔和能耐受至少0.3M的盐浓度的解旋酶接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的运动以及使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用；以及 (b)在一次或多次相互作用中测定所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施。
40.一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法,包括在孔和能耐受至少0.3M的盐浓度的解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征所述目标多核苷酸的传感器。
41.能耐受至少0.3M的盐浓度的解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用。
42.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)能耐受至少0.3M的盐浓度的解旋酶。
43.一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个能耐受至少.0.3M的盐浓度的解旋酶。
【文档编号】C12Q1/68GK104039979SQ201280051782
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2011年10月21日
【发明者】露丝·莫伊西, 安德鲁·约翰·赫伦 申请人:牛津纳米孔技术公司