添加铁改善细胞培养的制作方法

添加铁改善细胞培养的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在细胞培养物中增加细胞密度、存活性和/或效价的方法等，包括将含铁组合物添加至细胞培养物中的步骤。
【专利说明】添加铁改善细胞培养
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年10月21日申请的美国临时申请61/550，058的权益，其全文并入本文参考。
[0003]背景
[0004]哺乳动物细胞培养中的常见问题是培养结束时细胞死亡，其可由多种攻击导致，例如营养物耗竭、抑制物建立和/或氧化应激等等。通常并且特别对于利用哺乳动物培养系统的人们而言感兴趣的是表达药物学相关蛋白质产物、在细胞培养过程中保持细胞存活性和/或延迟细胞死亡。已采用了一些方法以增加细胞培养物的存活性，例如应用培养基添加剂和过表达抗凋亡基因。见例如Arden, et al.“Chemical caspase inhibitorsenhance cell culture viabilities and protein titer，，Biotechnol Prog.2007Mar_Apr;23(2):506-511;Mastrangelo, et al.“Antiapoptosis chemicals prolong productivelifetimes of mammalian cells upon Sindbis virus vector infection，，BiotechnolBioeng.1999Nov5;65 (3):298-305;Balcarcel, et al.uRapamycin Reduces HybridomaCell Death and Enhances Monoclonal Antibody Production，，Biotechnology and Bioengineering, 2001Vol.76，1-10;Zanghi et al.“The growth factor inhibitorsuramin reduces apoptosis and cell aggregation in protein-free CHO cell batchcultures.Biotechno 1.Prog.2000, 16, 319-325; Simpson, et al.“Prevention ofhybridoma cell death by bcl_2during suboptimal culture conditions，，BiotechnolBioengl997, 54:1-16;Singh,et al.“Enhancement of survivability of mammaliancells by overexpression of the apoptosis suppressor gene bcl_2.，，BiotechnolBioeng.1996, 52:166-175;Mastrangelo,et al.“Overexpression of bcl-2famiIymembers enhances survival of mammalian cells in response to variousculture insults.，，Biotechnology and Bioengineering, 2000，Vol67, 555-564 ; Arden,et al.“Inhibiting the apoptosis` pathway using MDM2in mammalian cellcultures.，，Biotechnology and Bioengineering, 2007; Vol.97，601-614)。然而，在一些情况中，应用培养基添加剂可以延迟细胞周期进程，导致较低细胞密度，因此较低产率。一些培养基添加剂可保护细胞免于在生长期凋亡，但是在死亡期无效。另外，大多数培养基添加剂很昂贵，其对于大规模药物生产可能不实用。对于抗凋亡基因的过表达，基因转染是挑战，并且效果可能是依赖于不同个案的。
[0005]因此，需要改善细胞培养增加细胞存活性、密度和/或效价。
[0006]概述
[0007]本发明涵盖了出人意料的发现，即添加铁、特别是高浓度的铁到细胞培养基中可以显著改善培养物的细胞密度、存活性和/或效价，还有其他益处。因此，本发明提供了改善细胞培养的有效但不昂贵以及容易的解决办法。本发明在改善延长的细胞培养结束时的存活性中特别有用。
[0008]在一个方面，本发明提供了增加细胞培养物中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤:提供在细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程(例如生产细胞培养过程)，及在细胞培养过程中添加含铁组合物至所述细胞培养基，由此细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。
[0009]根据本发明，所述含铁组合物可以选自多种含铁化合物。在一些实施方案中，所述含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐(Fe-citrate)、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物(Fe-Chloride)、Fe-硝酸盐(Fe-nitrate)、Fe-EDTA、Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3 及其组合。
[0010]在一些实施方案中，本发明方法包括在整个细胞培养过程的时间点添加含铁组合物。在一些实施方案中，含铁组合物在第O天后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第I天或第I天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第3天或第3天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第6天或第6天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第9天或第9天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在细胞培养过程期间多个时间点添加。
[0011]在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度(例如在一或多次加入含铁组合物之后)范围在100 μ M和5mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度范围在300 μ M和ImM之间。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度是ImM。
[0012]本发明可以使用多种细胞类型。例如，在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系、人成视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾细胞系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠睾丸支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VER0-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞或者人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0013]在一些实施方案中，所述细胞培养过程是补料分批培养过程。在一些实施方案中，所述细胞培养过程是分批-再流加培养过程(batch-refeedculture process)。在一些实施方案中，所述细胞培养过程 是灌注培养过程。在一些实施方案中，所述细胞培养过程是大规模生产培养过程。在一些实施方案中，细胞培养基体积是至少大约500L。在一些实施方案中，细胞培养在摇瓶中进行。
[0014]在一些实施方案中，加入补充蛋白质以改善细胞培养密度、存活性和/或效价。在一些实施方案中，细胞培养基不含水解物。在一些实施方案中，细胞培养基含有水解物。
[0015]在一些实施方案中，细胞携带编码重组蛋白的基因。在一些实施方案中，所述重组蛋白是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体是抗IL-22抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗GDF8抗体。在一些实施方案中，所述抗体是Myo29抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单域抗体。在一些实施方案中，所述单域抗体是抗TNF纳米抗体(nanobody)。在一些实施方案中，所述重组蛋白是糖蛋白。在一些实施方案中，所述重组蛋白是治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白是抗体、生长因子、凝血因子、细胞因子、融合蛋白、药物物质、疫苗、酶或Small ModularlmmunoPharmaceutical?(SMIP) ?在一些实施方案中，本发明方法进一步包括纯化所述重组蛋白的步骤。
[0016]在另一方面，本发明提供了从根据本发明方法培养的细胞产生的重组蛋白。
[0017]在另一方面，本发明提供了通过在细胞培养过程开始后一或多个时间点添加含铁组合物而防止或延迟细胞培养物中细 胞死亡的方法。[0018]在另一方面，本发明提供了通过在细胞培养过程开始后一或多个时间点添加含铁组合物而抑制细胞培养物中凋亡的方法。
[0019]在一些实施方案中，所述含铁组合物在第O天后添加。在一些实施方案中，所述含铁组合物在第3天或第3天之后添加。在一些实施方案中，所述含铁组合物在第6天或第6天之后添加。在一些实施方案中，所述含铁组合物在第9天或第9天之后添加。
[0020]在一些实施方案中，铁以实现在细胞培养基中浓度范围为100 μ M和5mM之间的量添加。在一些实施方案中，铁以实现在细胞培养基中浓度范围为300 μ M和ImM之间的量添加。在一些实施方案中，铁以实现在细胞培养基中浓度为ImM的量添加。
[0021]在一些实施方案中，所述细胞培养物是补料分批培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是分批再流加培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是灌注培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是大规模生产培养物。在一些实施方案中，细胞培养物体积是至少大约500L。在一些实施方案中，所述细胞培养物在摇瓶中进行。
[0022]在一些实施方案中，所述含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其组合。
[0023]在另一方面，本发明提供了制备细胞培养基的试剂盒，其包含一或多种用于制备初始细胞培养基的试剂，以及单独的含铁组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含在细胞培养过程期间的一或多个时间点将所述单独的含铁组合物添加到所述初始细胞培养基中以例如增加细胞密度、存活性和/或效价的指导。
[0024]在一些实施方案中，所述单独的含铁组合物的量是实现在初始细胞培养基中铁浓度范围在100 μ M和5mM之间的量。在一些实施方案中，所述单独的含铁组合物的量是实现在至少500L的细胞培养物中铁浓度范围在100 μ M和5mM之间的量。
[0025]在一些实施方案中，所述单独的`组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其组合。
[0026]在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于补料分批培养的补充成分。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于分批再流加培养的补充成分。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于灌注培养的补充成分。在一些实施方案中，所述补充成分选自激素和/或其他生长因子、无机离子、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂质、葡萄糖或其他能量来源、及其组合。
[0027]在本申请中，“或者”的使用是指“和/或”，除非另有说明。如本申请所用，术语“包含”或其变化形式不意味着排除其它添加物、成分、整数或步骤。如本文所用，术语“大约(about)”和“大约(approximately)”等价使用。本申请中使用或未使用大约的任何数字是指覆盖本领域技术人员理解的任何正常波动。在一些实施方案中，术语“大约”是指数值范围在任一方向(大于或小于)落入所述参考数值的25%，20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%或更小范围的数值范围，除非另有说明或者另外根据上下文是明显的(除了当这种数字超过可能值的100%)。
[0028]本发明的其它特征、目的和优点在后面的详细描述、附图和权利要求书中显而易见。但是应理解所述详细描述、附图和权利要求书当指示本发明实施方案时，仅举例示出而不是限制。本发明范围内的各种变化及修饰对于本领域技术人员是明显的。
[0029]附图简述[0030]附图仅举例目的，不是限制。
[0031]图1.举例数据，证实3天后不同剂量的铁添加对摇瓶中CHO细胞生长的作用。细胞生长测量为在给定时间点活细胞密度(VCD)(活细胞总数XlO6细胞/ml)。
[0032]图2.举例数据，证实3天后不同剂量的铁添加对摇瓶中CHO细胞存活性的作用。存活性测量为在给定时间点培养物中(活细胞)/ (总细胞)百分比。
[0033]图3.举例数据，证实3天后不同剂量的铁添加对摇瓶中CHO细胞的第16天存活性的作用。存活性测量为在给定时间点培养物中(活细胞)/ (总细胞)百分比。
[0034]图4.举例数据，证实3天后不同剂量的铁添加对摇瓶中第16天的CHO细胞的抗体效价的作用。抗体效价测量为抗体克数/L培养基。抗体效价变化测量为在给定时间点[抗体]有铁/[抗体]无铁比率。
[0035]图5.举例数据，证实在添加ImM铁至细胞系2培养过程后第14天的细胞密度、存活性和效价相对于对照的改善。细胞密度测量为在给定时间点活细胞总数XlO6细胞/ml。细胞密度改善表示为细胞密度1?/细胞密度5?的比率。存活性测量为在给定时间点培养物中(活细胞)/ (总细胞)的百分比。存活性改善测量为％存活性存活性5￡?的比率。抗体效价测量为抗体克数/L培养基。抗体效价变化测量为在给定时间点[抗体]We/[抗体]无铁的比率。
[0036]图6.举例数据，证实3天后FeSO4或Fe-柠檬酸盐添加(600 μ Μ)对摇瓶中细胞系I补料分批培养物的第14天存活性和活细胞密度的作用。活细胞密度测量为在给定时间点活细胞总数XlO6细胞/ml。活细胞密度改善表示为细胞密度细胞密度^^的比率。
[0037]图7.举例数据，证实第6天FeSO4添加(ImM)对摇瓶中补料分批培养物中生长的产生纳米抗体的CHO细胞的细胞存活性的作用。
[0038]图8.举例数据，证实第6天FeSO4添加(ImM)对摇瓶中补料分批培养物中生长的产生纳米抗体的CHO细胞的效价的作用。
[0039]图9.举例数据，证实第6天FeSO4添加(ImM)对摇瓶中补料分批培养物中生长的产生纳米抗体的CHO细胞的总体产率的作用。
[0040]图10.举例数据，证实第6天FeSO4添加(ImM)对摇瓶中补料分批培养物中生长的产生纳米抗体的CHO细胞的乳酸产量的作用。
[0041]图11.举例数据，证实FeSO4或Fe-柠檬酸盐添加(600 μ M)对摇瓶中克隆2.8补料分批培养物的细胞密度的作用。
[0042]图12.举例数据，证实FeSO4或Fe-柠檬酸盐添加(600 μ Μ)对摇瓶中克隆2.8补料分批培养物的存活性的作用。
[0043]图13.举例数据，证实FeSO4或Fe-柠檬酸盐添加(600 μ Μ)对摇瓶中克隆2.8补料分批培养物的总体产率的作用。
[0044]图14.举例数据，证实不同剂量的第O天铁添加对摇瓶中细胞系I的第3天存活性的作用。存活性测量为在给定时间点培养物中(活细胞)/ (总细胞)百分比。
[0045]详细描述
[0046]本申请提供了通过在细胞培养过程一或多个时间点添加含铁组合物增加细胞密度、存活性和/或产物效价的方法和组合物等。本发明涵盖令人惊奇的发现，向细胞培养物中添加铁可以延迟和/或防止细胞培养结束时的细胞死亡。在一些实施方案中，向细胞培养物中添加铁可以抑制细胞培养物凋亡。
[0047]铁是用于哺乳动物生长的细胞培养基的重要成分。但是，在本发明之前，认为低铁水平可以在铁耗竭时抑制细胞生长，而高铁水平可由于毒性(例如氧化应激和自由基形成)而抑制细胞生长。因此，认为铁的有益和毒性性质之间的平衡对于哺乳动物培养是重要的。在本发明之前，常规培养基配制品使用低浓度铁以足够支持细胞生长而同时保持在低于毒性铁浓度水平。如实施例章节所述，本发明人出人意料地发现向细胞培养物中添加铁，包括被认为是高浓度的铁，导致细胞培养物的改善的细胞生长及延迟的细胞死亡，导致显著增加的细胞密度、存活性和效价等其他益处。这种作用不依赖于细胞系、规模、产物和铁来源。另外，产物品质不受高铁浓度影响。因此，本发明提供了新的成本效益的方法用于改善的细胞培养。
[0048]本发明各个方面在下面章节中详细描述。章节应用不意味着限制本发明。每个章节可以适用于本发明任何方面。本领域技术人员理解这些实施方案的各种修饰在所附权利要求书范围内。权利要求书及其等价物限定本发明范围，其不是也不应被限于某些实施方案的描述或者被其限制。
[0049]铁鉬合物
[0050]本发明可以使用许多种含铁组合物。在某些实施方案中，含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3及其组合。
[0051]本发明可以使用各种铁浓度。典型地，铁以大于“微量浓度”的浓度提供在培养基中。术语“微量浓度”在本文中是指可小于一般地或容易测量的水平的浓度。例如，化合物的微量水平可以是〈10_5，〈10_6，〈10_7或者〈101。在某些实施方案中，铁以在大约100μΜ和5mM之间的浓度提供在培养基中(例如大约100 μ M - 4.5mM、100μΜ - 3.0mM, 100 μ M-
2.5πιΜ、100μΜ - 1.0mMUOOyM- 1.0πιΜ、200μΜ - 2.0πιΜ、200μ M- 1.5πιΜ、200μΜ - 1.0mM,150 μ M - 4.5mM、150 μ M - 3.5mM、150 μ M - 2.5mM、150 μ M - 1.5mM、150 μ M - 1.0mM,200 μ M - 1.5mM、200 μ M - 1.0mM,200 μ M - 2.5mM、300 μ M - 2.5mM、300 μ M - 1.5mM、300μΜ-2.0mM)o在某些实施方案中，铁以如下浓度提供在培养基中:大约100μΜ、150 μ Μ、200 μ Μ、250 μ Μ、300 μ Μ、350 μ Μ、400 μ Μ、450 μ Μ、500 μ Μ、550 μ Μ、600 μ Μ、650 μ Μ、700 μ Μ、750 μ Μ、800 μ Μ、850 μ Μ、900 μ Μ、950 μ Μ、ImM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、
4.5mM或5mM，或者这些浓度内的任何范围。在某些实施方案中，铁以大约300 μ M和ImM之间的浓度提供在培养基中。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程中增加。
[0052]本发明还涵盖如下发现，即含铁组合物可以在细胞培养过程期间的任何时间点提供在培养基中。含铁组合物可以通过在一段时间的一或多个时间点添加所述组合物而被加入以在培养基中实现希望的铁浓度。在一些实施方案中，含铁组合物在细胞培养过程的第O天或第O天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第O天之后添加。在某些实施方案中，含铁组合物在细胞培养过程(例如生产细胞培养过程)的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 天或第 O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20天之后添加或者在上述时间点的任意组合时添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第3天或第3天之后添加。[0053]本领域技术人员能够基于他或她的实验设计的特定属性在这些本发明范围内选择精确的铁浓度及添加时间，所述属性包括待培养细胞的特征、被培养细胞产生的任何产物(例如抗体或重组蛋白)的特征、细胞生长的培养基中其它成分的存在与否以及生长条件。例如，静态培养中生长的细胞比振荡培养中生长的细胞可以或多或少地最佳利用铁(见例如 W094/02592)。
[0054]细胞培养基
[0055]本文所用术语“培养基”、“细胞培养基”是指含有滋养生长的哺乳动物细胞的营养物的溶液。典型地，这种溶液提供了细胞最低生长和/或存活所需的必需及非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。这种溶液也可以含有增强高于最低速率的生长和/或存活的补充成分，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸根)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低终浓度存在的无机化合物)、以高终浓度存在的无机化合物(例如铁)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量来源。在某些实施方案中，培养基被有利地配制成对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。在某些实施方案中，培养基是流加培养基(feed medium)，其在细胞培养开始后添加。
[0056]本发明可以使用许多种哺乳动物生长培养基。在某些实施方案中，细胞可以生长在多种化学成分确知的培养基(chemically defined media)中，其中培养基成分是已知及受控的。在某些实施方案中，细胞可以生长在复杂培养基中，其中不是所有培养基成分均是已知和/或受控的。
[0057]用于哺乳动物细胞培养的化学成分确知的生长培养基在几十年中已充分开发和公开。成分确知的培养基的所有成分均被很好鉴定，因此成分确知的培养基不含有复杂添加剂如血清或水解物。早期培养基配方被开发以允许细胞生长及维持存活性，很少或不考虑蛋白质生产。最近，培养基配方被开发，明确目的是支持高产重组蛋白生产细胞培养物。
[0058]复杂培养基不是所有成分均被很好鉴定，因此复杂培养基可含有添加剂如简单和/或复杂碳源、简单和/或复杂氮源和血清等。在一些实施方案中，适合于本发明的复杂培养基在本文所述成分确知的培养基的其它成分之外还含有添加剂如水解物。
[0059]在一些实施方案中，成分确知的培养基典型包括大概50种在水中已知浓度的化学实体。它们的大多数还含有一或多种良好鉴定的蛋白质如胰岛素、IGF-1、运铁蛋白或BSA，但是其它则需要无蛋白质成分，因此被称为无蛋白质的成分确知的培养基。培养基的典型化学成分落入5个大类:氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和无法精确分类的杂类(amiscellaneous category that defies neat categorization)。
[0060]细胞培养基可任选用补充成分补充。本文所用术语“补充成分”是指增强生长和/或存活大于最低速率的成分，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸根)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量来源。在某些实施方案中，补充成分可以添加到初始细胞培养物中。在某些实施方案中，补充成分可以在细胞培养开始后添加。
[0061]典型地，微量元素是指以微摩尔或更低水平包括的多种无机盐。例如，通常包括的微量元素是锌、硒 、铜及其它。在一些实施方案中，铁(亚铁或铁盐)可以以微摩尔浓度作为微量元素被包括在初始细胞培养基中。如以上讨论，本发明提供了方法，其包括在初始细胞培养基中存在的微量铁以外还添加铁，从而细胞培养基中的铁浓度大于微量(例如大于100 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、800 μ Μ、900 μ M 或 ImM)。锰作为二价阳离子(MnCl2或MnSO4)也经常包括在微量元素中，浓度范围为纳摩尔至微摩尔。许多不常见的微量元素通常以纳摩尔浓度加入。
[0062]细朐
[0063]本发明可以使用能进行细胞培养的任何宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物的。本发明可以使用的哺乳动物细胞的非限制性例子包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NS0/1，ECACC No:85110503);人成视网膜细胞(PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands);用 SV40 转化的猴肾 CVl 细胞系(C0S-7, ATCCCRL1651);人胚肾细胞系(293或者亚克隆而用于悬浮培养生长的293细胞，Graham etal.，J.Gen Virol., 36:59, 1977);幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL10);中华仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 77:4216，1980);小鼠睾丸支持细胞(TM4, Mather, Biol.Reprod.，23:243-251，1980);猴肾细胞(CVIATCC CCL70);非洲绿猴肾细胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL34) ;buffalo 大鼠肝细胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺细胞(W138, ATCCCCL75);人肝细胞(Hep G2, HB8065);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562, ATCC CCL51) ;TRI 细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sc1.，383:44-68，1982) ;MRC5 细胞；FS4 细胞；及人肝细胞瘤细胞系OfeP G2)。
[0064]另外，任何数目的商业及非商业可获得的杂交瘤细胞系可以用于本发明。本文所用术语“杂交瘤”是指得自永生化细胞与抗体产生细胞的融合的细胞或细胞后代。这种产生的杂交瘤是产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的个体细胞可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、猪、山羊和人。在某些实施方案中，杂交瘤是三瘤细胞系，当异源杂交(heterohybrid)骨髓瘤融合体(其是人细胞与小鼠骨髓瘤细胞系之间的融合产物)的后代随后与浆细胞融合而产生。在某些实施方案中，杂交瘤是产生抗体的任何永生化杂种细胞系，例如 quadromas (见例如 Milstein et al.，Nature, 537:3053，1983)。本领域技术人员理解杂交瘤细胞系可以具有不同的营养需求和/或可以需要不同的培养条件用于最佳生长，并且能够根据需要修改条件。
[0065]细胞培养方法
[0066]本文所用术语“培养物”及“细胞培养物”是指在适合细胞群存活和/或生长的条件下悬浮于培养基中的细胞群。如本领域技术人员了解的，在某些实施方案中，本文所用这些术语是指包含细胞群及细胞群所悬浮其中的培养基的组合。在某些实施方案中，细胞培养物的细胞包含哺乳动物细胞。
[0067]本发明可以使用适于希望过程(例如生产重组蛋白(例如抗体))的任何细胞培养方法。作为非限制性例子，细胞可以生长在分批或补料分批培养物中，其中在重组蛋白(例如抗体)足够表达后终止培养，之后表达的蛋白质(例如抗体)被收获。或者，作为另一个非限制性例子，细胞可以生长在分批-再流加或灌注培养物中，其中培养不终止，新的营养物和其它成分定期或连续加入到培养物中，在此期间定期或连续收获表达的重组蛋白(例如抗体)。其它合适的方法(例如spin-tube培养)是本领域已知的并且可以用于实施本发明。
[0068]在某些实施方案中，适用 于本发明的细胞培养是补料分批培养。本文所用术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的一个或多个时间将额外成分提供给培养物。这种提供的成分典型包含在培养过程期间已被耗竭的用于细胞的营养成分。另外或者替换地，这种额外成分可以包括本文所述补充成分。在某些实施方案中，额外成分提供在流加培养基中，如本文所述。补料分批培养典型地在某一点停止，收获细胞和/或培养基中的成分并任选纯化。
[0069]在某些实施方案中，适用于本发明的细胞培养是分批-再流加培养。本文所用术语“分批-再流加”是指培养细胞的方法，其中细胞的一部分(例如大约50%、大约55%、大约60%、大约65%、大约70%、大约75%、大约80%、大约85%、大约90%、大约95%或更多的细胞)在接种及生长特定时间(例如I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天等)之后从细胞培养物中移除。典型地，从分批-再流加移除的含细胞的培养基用等体积新鲜培养基置换。在某些实施方案中，额外成分提供在再流加培养基中，如本文所述。分批再流加培养典型是连续过程，其涉及培养容器(例如生物反应器)内细胞培养物的扩增及维持。
[0070]在某些实施方案中，适用于本发明的细胞培养是灌注培养。典型地，灌注培养涉及通过使用细胞保留系统通过连续引入新鲜培养基及移除用过的培养基而保持工作体积细胞培养基。在一些实施方案中，细胞可以用任何可获得的方法例如过滤、沉降、离心及其组合而保留在培养物中。在一些实施方案中，灌注培养物可以生长一段延长时间(例如2周、3周、4周、5周或更长)。[0071]细胞可以在技术人员选择的任何方便体积中生长。例如，细胞可以在体积为几毫升至几升的小规模反应容器中生长。或者，细胞可以在体积为大约至少I升至10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10，000、12，000升或更大或者在之间的任何体积的大规模商业
生物反应器中生长。
[0072]细胞培养物的温度主要基于细胞培养物保持存活的温度范围及产生高水平希望产物(例如重组蛋白或抗体)的温度范围而选择。例如，细胞系I在大约37°C生长良好并且可以产生高效价抗体。一般，大多数哺乳动物细胞在大约25°C至42°C的范围内生长良好并且可以产生希望产物(例如重组蛋白或抗体)，当然本发明方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在大约35°C至40°C的范围内生长良好并且可以产生希望产物(例如重组蛋白或抗体)。在某些实施方案中，细胞培养物在细胞培养过程的一或多个时间在20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45 °C 的温度生长。本领域技术人员能够根据细胞的特定需求及实施者特定生产需求选择合适温度生长细胞。根据实施者需求及细胞本身需求，细胞可以生长任何时间长度。
[0073]在培养过程中培养物可以进行一或多次温度转变。当转变培养物温度时，温度转变可以是相对渐变的。例如，可以花费几个小时或者几天完成温度变化。或者，温度转变可以是相对突然的。在培养过程中温度可以稳定升高或降低。或者，温度可以在培养过程中各个时间以离散的量升高或降低。随后的温度或温度范围可以低于或高于初始或先前温度或温度范围。本领域技术人员理解多个离散温度转变包含在本实施方案中。例如，温度可以转变一次(转变为更高或更低温度或温度范围)，细胞保持在这个温度或温度范围一段时间，之后温度可以再次转变至新的温度或温度范围，其可以是高于或低于先前的温度或温度范围的温度或温度范围。每次离散转变后的培养物温度可以是恒定的或者可以保持在一定温度范围内。
[0074]在某些实施方案中，确定细胞培养物的细胞密度、存活性和/或效价。本文所用术语“细胞密度”是指给定培养基体积中存在的细胞数目。本文使用术语“细胞存活性”是指培养物中细胞在给定培养条件集合或实验变化下生存的能力。本文所用术语也指在特定时间活细胞部分相对于该时间培养物中的活和死细胞总数的比例。本领域技术人员理解确定细胞存活性的许多方法涵盖在本发明中。例如，可以使用染料(例如台盼蓝)，其不穿过活细胞膜，但是可以穿过死细胞或正在死亡细胞的被破坏的膜，从而确定细胞存活性。可以确定处于各种培养条件(例如铁浓度或者培养时间)的培养物的细胞存活性并且互相比较以确定这种培养物的最佳生长条件。本文所用术语“效价”是指例如在给定量的培养基体积中由哺乳动物细胞培养物产生的重组表达的蛋白质或抗体的总量。效价典型表示为每毫升培养基蛋白质例如抗体的毫克单位。
[0075]在某些实施方案中，一旦通过实施者需求确定达到希望的细胞密度、存活性和/或效价，则终止分批和补料分批反应。作为非限制性例子，一旦细胞达到最大活细胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 99%,则可以终止培养。另外或者替代地，可以在代谢废物产物如乳酸和铵过量积累之前终止分批和补料分批反应。在一些实施方案中，一旦废物产物(如乳酸和/或铵)积累达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多g/L培养基，则可以终止分批和补料分批反应。
[0076]在某些情况中，在后续生产阶段给细胞培养物补充已被细胞耗竭或代谢的营养物或其它培养基成分是有益的。作为非限制性例子，可以有益的是给细胞培养物补充激素和/或其它生长因子、无机离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸根)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、水平高于微量浓度的无机化合物(例如铁)、氨基酸、脂质、或者葡萄糖或其它能量来源。这种补充成分可以一次全部加入到细胞培养物中，或者它们可以经一系列添加而提供给细胞培养物。
[0077]本领域技术人员能够调整具体细胞培养条件以优化细胞培养物的一些特征，包括但不限于生长速率、细胞存活性、细胞培养物的终细胞密度、有害代谢副产物如乳酸和铵的终浓度、希望产物(例如重组蛋白或抗体)的最终效价，或者这些的任何组合或者实施者认为重要的其它条件。
[0078]蛋白质表汰`
[0079]如上所述，在许多情况中，细胞被选择或工程化以产生高水平希望产物(例如重组蛋白或抗体)。通常，细胞经人工操作以产生高水平重组蛋白，例如通过导入编码感兴趣蛋白质的基因和/或通过导入调苄基因(内源的或导入的)表达的遗传控制元件。
[0080]某些蛋白质可能对细胞生长、细胞存活性或者其它一些细胞特征具有有害作用，最终以某一方式限制感兴趣蛋白质的产生。即使在工程化表达特异蛋白质的一种特定类型的细胞群中，差异也存在于该细胞群中，由此某些个体细胞生长更好，产生更多感兴趣蛋白质，或者产生具有更高活性水平(例如酶活性)的蛋白质。在某些实施方案中，细胞系由实施者凭经验选择用于在选择用于培养细胞的特定条件下的强壮生长。在一些实施方案中，基于细胞生长、最终细胞密度、细胞存活性百分比、表达蛋白质的效价或者这些的任何组合或实施者认为重要的其它条件，选择工程化表达特定蛋白质的个体细胞用于大规模生产。
[0081]在宿主细胞中可表达的任何蛋白质均可以根据本发明生产。本文所用术语“宿主细胞”是指根据本发明被操作以生产本文所述感兴趣蛋白质的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。蛋白质可以从宿主细胞内源的基因表达，或者从导入到宿主细胞中的异源基因表达。蛋白质可以是天然发生的，或者可以具有人工工程化或选择的序列。
[0082]可以根据本发明被希望地表达的蛋白质经常基于感兴趣或有用的生物学或化学活性选择。例如，本发明可以用于表达任何药物学或商业相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。在一些实施方案中，培养细胞表达的蛋白质选自抗体或其片段、纳米抗体、单域抗体、糖蛋白、治疗性蛋白、生长因子、凝血因子、细胞因子、融合蛋白、药物物质、疫苗、酶或者Small Modular ImmunoPharmaceuticals?(SMIPs)。可以根据本发明生产的蛋白质列表仅仅是举例性的，不意味着是限制性引用。本领域技术人员理解可以根据本发明表达任何蛋白质，并且能够基于他或她的特定需求选择要生产的特定蛋白质。
[0083]抗体
[0084]鉴于目前大量抗体作为药物或其它商业制剂在使用或研究，根据本发明生产抗体是特别感兴趣的。抗体是具有特异性结合特定抗原的能力的蛋白质。可以在宿主细胞中表达的任何抗体均可以根据本发明生产。在一些实施方案中，待表达抗体是单克隆抗体。
[0085]在一些实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合抗体。嵌合抗体含有衍生自一种以上生物体的氨基酸片段。嵌合抗体分子可包括例如来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合结构域和人恒定区。各种制备嵌合抗体的方法已被描述。见例如 Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 6851 (1985) ; Takeda etal., Nature314, 452 (1985), Cabilly et al.,美国专利 4，816，567; Boss et al.,美国专利4，816，397; Tanaguchi et al.,欧洲专利公开EP171496;欧洲专利公开0173494，英国专利 GB2177096B。
[0086]在一些实施方案中 ，所述单克隆抗体是人抗体，例如通过使用核糖体展示或噬菌体展示文库(见例如Winter et al.,美国专利6，291，159和Kawasaki,美国专利5，658，754)或者使用异种(xenographic)物种衍生,其中天然抗体基因被失活并且用人抗体基因功能性置换，同时完整留下天然免疫系统的其它成分(见例如Kucherlapati etal.,美国专利 6，657，103)。
[0087]在一些实施方案中，所述单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是嵌合抗体，其中大部分氨基酸残基衍生自人抗体，由此当输送给人对象时使任何潜在免疫反应最小化。在人源化抗体中，互补决定区的氨基酸残基被至少部分用来自非人物种的残基置换，赋予希望的抗原特异性或亲和性。这种改变的免疫球蛋白分子可以通过任何几种现有技术中已知的技术制备(例如Teng et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,80, 7308-7312(1983);Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983);Olsson etal.，Meth.Enzymo1.，92，3-16 (1982))，优选根据 PCT 公开 W092/06193 或 EP0239400 的教导制备，所有文献并入本文参考。人源化抗体可以通过例如Scotgen Limited, 2HollyRoad, Twickenham, Middlesex, Great Britain 商业化产生。作为进一步参考，参见 Joneset al., Nature321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-329(1988);和Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)，所有文献并入本文参考。
[0088]在一些实施方案中，上述单克隆、嵌合或人源化抗体可以含有不是天然存在于自然界任何物种的任何抗体中的氨基酸残基。这些外来残基可以用于例如赋予单克隆、嵌合或人源化抗体新的或修饰的特异性、亲和性或效应物功能。在一些实施方案中，上述抗体可以缀合于用于系统性药物治疗的药物，如毒素、低分子量细胞毒性药物、生物学应答修饰剂和放射性核素(见例如Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrierconiugates, US20040082764A1)。
[0089]在一些实施方案中，本发明用于产生特异性结合淀粉样前体蛋白的Αβ片段或者淀粉样斑的其它成分的抗体，可用于对抗特征为阿尔茨海默病的淀粉样斑在脑中的积累(见例如美国临时申请60/636，684)。在一些实施方案中，本发明用于产生特异性结合HER2/neu受体的抗体。在一些实施方案中，本发明用于产生抗⑶20抗体。在一些实施方案中，本发明用于产生抗 TNF a、CD52、CD25、VEGF、EGFR、CDlla、CD33、CD3、IL-22, alpha-4整联蛋白和/或IgE的抗体。
[0090]在另一实施方案中，本发明的抗体针对在增生性疾病如癌症中的靶细胞和/或组织上表达的细胞表面抗原。在一个实施方案中，所述抗体是IgGl抗Lewis Y抗体。LewisY 是碳水化合物抗原，具有结构Fuc^l — 2GalBl -^4[Fuc4l^-3]GlcNacBI^3R' (Abeet al.(1983) J.Biol.Chem.，25811793-11797)。Lewis Y抗原在 60%_90% 的人上皮肿瘤(包括乳腺、结肠、肺和前列腺的肿瘤)表面上表达，其中至少40%过表达此抗原，在正常组织中有限表达。
[0091]为了靶向Ley及有效靶向肿瘤，理想需要具有对抗原的绝对特异性的抗体。因此，优选地，本发明的抗Lewis Y抗体不与I型结构(即血型的乳糖系列(Lea和Leb))交叉反应，及优选地不结合其它2型表位(即新乳糖结构)如Lex和H型2结构。优选的抗 Lewis Y 抗体的例子称为 hu3S193 (见美国专利 6，310，185; 6，518，415; 5，874，060，全文并入本文)。通过来自3S193的CDR移植产生人源化抗体hu3S193(Attia，M.A.，etal.1787-1800), 3S193是针对腺癌细胞产生的小鼠单克隆抗体，具有对于Ley的非常强的特异性(Kitamura，K.，12957-12961)。Hu3S193不仅保留了 3S193对Ley的特异性，而且获得了介导补体依赖性细胞毒性(以下称为CDC)和抗体依赖性细胞毒性(以下称为ADCC)的能力(Attia，M.A.，et al.1787-1800)。这个抗体靶向裸鼠中表达Ley的异种移植物，这由使用hu3S193的生物分布研究证实，所述hu3S193用1251、IllIn或18F及其它需要螯合剂的放射标记如 lllIn、99mTc 或 90Y 标记(Clark, et al.4804-4811)。
[0092]在一些实施方案中，所述抗体是称为Myo29、Myo28和Myo22的人抗⑶F_8抗体及其衍生的抗体和抗原结合片段之一。这些抗体能以高亲和性结合成熟⑶F-8，体外和体内抑制⑶F-8活性，例如通过抑制ActRIIB结合和报道基因测定所证实，以及可抑制与骨骼肌质量和骨密度的负调节相关的GDF-8活性。见例如Veldman，et al,美国专利申请20040142382。
[0093]受体
[0094]已显示作为药物和商业物质有效的另一类多肽包括受体。受体是典型的跨膜糖蛋白，通过识别胞外信号传导配体而起作用。受体典型具有蛋白激酶结构域及配体识别结构域，其当结合配体时通过磷酸化靶胞内分子而起始信号传导途径，导致细胞内的发育或代谢变化。在一个实施方案中，感兴趣受体被修饰以除去跨膜和/或胞内结构域，任选可附着Ig结构域而代替其。在优选的实施方案中，根据本发明生产的受体是受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包 括对于多种功能多种细胞类型关键的受体(见例如Yardenand Ullrich, Ann.Rev.Biochem.57:433-478,1988;Ullrich and SchlessingerjCell61:243-254, 1990,并入本文参考)。RTK的非限制性例子包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族成员、表皮生长因子受体(EGF)家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、具有免疫球蛋白和EGF同源结构域-1的酪氨酸激酶(TIE-1)和TIE-2受体(Sato etal.，Nature376 (6535): 70-74 (1995)，并入本文参考)及c-Met受体，其中一些已提示直接或间接促进血管发生(Mustonen and Alitalo, J.Cell Biol.129:895-898，1995) JTK 的其它非限制性例子包括胎肝激酶I (FLK-1)(有时称为含激酶插入结构域受体(KDR) (Termanet al.，0ncogene6:1677-83，1991)或者血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR-2))，fms 样酪氨酸激酶-1 (Flt-1) (DeVries et al.Science255; 989-991，1992; Shibuya etal.,0ncogene5:519-524, 1990)，有时称为血管内皮细胞生长因子受体I (VEGFR-1)，神经毡蛋白-1，内皮糖蛋白，内皮唾液酸蛋白和Axl。本领域技术人员将认识到可以根据本发明优选表达的其它受体。
[0095]在一些实施方案中，呈肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1;EP417，563，1991年3月20日公开；TNFR-2，EP417，014，1991年3月20日公开)形式的肿瘤坏死因子抑制物根据本发明表达(综述见 Naismith and Sprang, J Inf lamm.47 (1-2): 1-7 (1995-96),并入本文参考)。根据一个实施方案，肿瘤坏死因子抑制物包含可溶性TNF受体及优选地TNFR-1g。在一些实施方案中，本发明优选的TNF抑制物是TNFRI和TNFRII的可溶形式，以及可溶性TNF结合蛋白，在另一实施方案中，TNFR-1g融合物是TNFR:Fe，该术语本文用来指〃依坦西普(etanercept)",其是两个分子的p75TNF_a受体胞外部分的二聚体,每个分子由人IgGl的235个氨基酸Fe部分组成。
[0096]生长因子及其它信号传导分子
[0097]已显示作为药物和商业物质有效的另一类多肽包括生长因子及其它信号传导分子。生长因子包括由细胞分泌的糖蛋白，其结合和激活其它细胞上的受体，起始受体细胞中的代谢或发育变化。在一个实施方案中，感兴趣蛋白质是ActRIIB融合多肽，包含ActRIIB受体的胞外结构域和抗体的Fe部分(见例如Wolfman, et al., ActRIIB fusionpolypeptides and uses therefor, US2004/0223966A1 )0 在另一个实施方案中，所述生长因子可以是修饰的 GDF-8 前妝(见例如 Wolfman, et al., Modified and stabilized GDFpropeptides and uses the reof, US2003/0104406A1) ? 或者，感兴趣蛋白质可以是含有促卵泡素抑制素结构域的蛋白质(见例如Hill, et al., GASPl:a follistatin domaincontaining protein,US2003/0162714A1, Hill, et al., GASPl:a follistatin domaincontaining protein,US2005/0106154A1, Hill, et al., Follistatin domain containingproteins.US2003/0180306A1)。
[0098]哺乳动物生长因子及其它信号传导分子的非限制性例子包括细胞因子；表皮生长因子(EGF);血小板衍生生长因子(TOGF);成纤维细胞生长因子(FGF)如aFGF和bFGF ;转化生长因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β，包括 TGF-β 1、TGF_ β 2、TGF_ β 3、TGF_ β 4 或 TGF-β 5;胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-1UIGF-1和IGF-1 I) ;des (1-3)-1GF-1 (HfIGF-1),胰岛素样生长因子结合蛋白；⑶蛋白如⑶_3、⑶-4、⑶-8和⑶-19;红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP);干扰素如干扰素-α、干扰素、干扰素-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(IL)，例如IL-1至IL-1O; IL-1O超家族细胞因子(例如IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26);肿瘤坏死因子(TNF) α和β ;胰岛素A链；胰岛素 B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C ;心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(受激活调节正常 T 细胞表达和分泌因子(regulated on activation normally T-cell expressed andsecreted));人巨曬细胞炎性蛋白(ΜΙΡ_1_α ) ；mullerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白_4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6 (NT-3, NT-4, NT-5或NT-6)，或者神经生长因子如NGF-β。本领域技术人员了解可以根据本发明表达的其它生长因子或信号传导分子。
[0099]G蛋白偶联受体
[0100]已显示作为药物和/或商业物质有效的另一类多肽包括生长因子及其它信号传导分子。G蛋白偶联受体(GPCR)是具有7个跨膜结构域的蛋白质。在配体结合GPCR后，信号在细胞内转导，导致细胞的生物学或生理学性质变化。
[0101 ] GPCR与G蛋白及效应物(由G蛋白调节的胞内酶和通道)一起是调节信号传导系统的成分，其连接胞内第二信使的状态与胞外输入。这些基因及基因产物是潜在的疾病致病因子。
[0102]视紫质基因和V血管加压素受体基因中的特异性缺陷已示出导致多种形式的常染色体显性及常染色体隐性遗传色素性视网膜炎、肾性尿崩症。这些受体对于中枢神经系统和周围生理学过程均非常关键重要。GPCR蛋白超家族现含有250种以上类型的旁系同源物(paralogues)，代表由基因重复(或其它过程)产生的变体的受体，与来自不同物种的相同受体的直系同源物相反。该超家族可以分为5个家族:家族I，由视紫质和β 2-肾上腺素能受体代表的受体，目前由200个以上独特成员代表；家族II，最近鉴定的甲状旁腺激素/降钙素/分泌素受体家族；家族III，哺乳动物中的亲代谢性谷氨酸受体家族；家族IV，cAMP受体家族，在盘基网柄菌(D.discoideum)的趋化性和发育中是重要的；家族V，真菌交配信息素受体如STE2。
`[0103]GPCR包括针对生物胺、炎症的脂质介导物、肽激素及感觉信号介导物的受体。当受体结合其胞外配体时，GPCR变成激活的。由配体-受体相互作用导致的GPCR中的构象变化影响G蛋白与GPCR胞内结构域的结合亲和性。这使得GTP以增强的亲和性结合G蛋白。
[0104]GTP对G蛋白的激活导致G蛋白α亚基与腺苷酸环化酶或其它第二信使分子产生者相互作用。这种相互作用调节腺苷酸环化酶的活性及因此第二信使分子cAMP的产生。cAMP调节其它胞内蛋白质的磷酸化及激活。或者，其它第二信使分子如cGMP或eicosinoids的细胞水平可以通过GPCR的活性上调或下调。G蛋白α亚基通过GTPase水解GTP而失活，α β和Y亚基重新缔合。异源三聚体G蛋白然后从腺苷酸环化酶或其它第二信使分子产生者解离。GPCR活性也可以通过胞内和胞外结构域或环的磷酸化而调节。
[0105]谷氨酸受体组成一组在神经传递中重要的GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神经递质，据信在神经元可塑性、识别、记忆、学习及一些神经性障碍如癫痫症、中风、神经变性中具有重要作用(Watson, S.and S.Arkinstall (1994)The G-Protein Linked ReceptorFacts Book, Academic Press, San Diego CA, pp.130-132)。谷氨酸的这些作用由两类受体介导，称为离子型及促代谢型。离子型受体含有固有阳离子通道并且介导谷氨酸的快速兴奋作用。促代谢型受体是调节性的，通过抑制钙依赖性钾传导及抑制和增强离子型受体的兴奋性传递而增加神经元的膜兴奋性。促代谢型受体基于激动剂药理学及信号转导途径分为5个亚型，广泛分布于脑组织中。
[0106]血管活性肠多肽(VIP)家族是一组相关多肽，它们的作用也由GPCR介导。这个家族的关键成员是VIP本身、分泌素及生长激素释放因子(GRF)。VIP具有广谱生理学作用，包括松弛平滑肌、刺激或抑制多种组织中的分泌、调节多种免疫细胞活性及在CNS中的多种兴奋性和抑制性活性。分泌素刺激胰腺和小肠中酶和离子的分泌，也少量存在于脑中。GRF是重要的神经内分泌物质，调节生长激素从垂体前叶的合成和释放(Watson, S.and
S.Arkinstall supra, pp.278-283)。
[0107]在配体结合GPCR之后，构象变化传递给G蛋白，其导致α亚基将结合的GDP交换为GTP分子并且与β Y亚基解离。α -亚基的GTP结合形式典型功能为效应子调节部分，导致产生第二信使如环状AMP (例如通过激活腺苷酸环化酶)、二酰基甘油或者磷酸肌醇。在人类中已知超过20种不同类型的α-亚基，其与较小集合的β和Y亚基缔合。哺乳动物G蛋白的例子包括Gi, Go, Gq, Gs和Gt。G蛋白在Lodish H.et al.Molecular CellBiology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995)中充分描述，其内容并入本文参考。
[0108]GPCR是药物作用和开发的主要靶。事实上，受体已导致一半以上目前已知的药物(Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516), GPCR 代表治疗性介入最重要的祀，30% 临床处方药拮抗或激动 GPCR(Milligan，G.and Rees, S.，(1999) TIPS.20:118-124)。这证实这些受体具有作为治疗祀的已建立证明的历史。
[0109]一般，本发明实施者会选择他们感兴趣的多肽，知道其精确氨基酸序列。根据本发明待表达的任何给定蛋白质具有其自己的特质特性，可影响培养细胞的细胞密度或存活性，并且可以以低于在相同培养条件下生长的另一种多肽或蛋白质的水平表达。本领域技术人员能合适修饰本发明的步骤和组合物以优化细胞生长和/或任何给定表达的多肽或蛋白质的产生。
[0110]酶
[0111]已显示作为药物和/或商业物质有效的另一类蛋白质包括酶。酶可以是蛋白质，其酶活性可以被产生它们的细胞培养条件影响。因此，根据本发明生产具有希望酶活性的酶也是特别感兴趣的。本领域技术人员将认识到许多已知的酶可以被培养细胞表达。
[0112]酶的非限制性例子包括糖酶如淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戍聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚苷酶(naringanase)、果胶酶和支链淀粉酶；蛋白酶如酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶(例如氨基肽酶和羧基肽酶)、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、胃前酯酶(pregastric esterase)、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亚氨基酰化酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶和青霉素酰化酶；异构酶如葡萄糖异构酶；氧化还原酶，如氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羟基类固醇脱氢酶或过氧化物酶；裂合酶如乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、延胡索酸酶或组氨酸酶；转移酶，如环糊精糖基转移酶；连接酶；几丁质酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、漆酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、果胶水解酶(pectinolytic enzyme)、多酹氧化酶、核糖核酸酶和转谷氨酰胺酶。
[0113]一般，本发明实施者会选择感兴趣蛋白质，知道其精确氨基酸序列。根据本发明待表达的任何给定蛋白质可具有其自己的特定特性，可影响培养细胞的细胞密度或存活性，可以以低于在相同培养条件下生长的另一种蛋白质的水平表达，及根据精确培养条件和进行的步骤可以具有不同生物学活性。本领域技术人员根据本发明教导能合适修饰用于生产特定蛋白质的步骤和组合物以优化细胞生长和任何给定表达的蛋白质的产生和/或活性。
[0114]将用于表达蛋白质的基因导入宿主细胞
[0115]一般，导入细胞中的核酸分子编码希望根据本发明表达的蛋白质。或者，核酸分子可编码诱导细胞表达希望蛋白质的基因产物。例如，导入的遗传材料可以编码转录因子，激活内源或异源蛋白质的转录。或者或另外，导入的核酸分子可增加细胞表达的蛋白质的翻译或稳定性。
[0116]本领域已知适合将核酸导入哺乳动物宿主细胞以实现感兴趣蛋白质表达的方法。见例如 Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981;Mantei et al., Nature,281:40-46, 1979;Levinson et al.EP117, 060;EP117, 058，其均并入本文参考。对于哺乳动物细胞，将遗传材料导入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham and van derErb (Virology, 52:456-457, 1978)的憐酸钙沉淀法或者Hawley-Nelson (Focusl5:73，1993)的lipofectamine?(Gibco BRL)方法。哺乳动物宿主细胞系统转化的一般方面已由Axel在1983年8月16日颁发的美国专利号4，399，216中描述。对于将遗传材料导入哺乳动物细胞的各种技术见 Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methodsin Enzymology, 185:527-537, 1990 和 Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988。
[0117]在一些实施方案中，核酸可以以裸核酸分子形式导入。例如，导入细胞的核酸分子可以仅由编码蛋白质及必需的遗传控制元件的核酸组成。或者，编码蛋白质的核酸(包括必需的调节元件)可以包含在`质粒载体中。用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质的合适载体的非限制性代表例子包括pCDNAl ;pCD,见Okayama, et al.Mol.CellBiol.5:1136-1142, 1985;pMClneo Poly-A,见 Thomas, et al.Cell51:503-512, 1987;杆状病毒载体如 pAC373 或 pAC610;CDM8,见 Seed, B.Nature329:840，1987;及 pMT2PC,见Kaufman, et a 1.EMBO J.6:187-195，1987，其均全文并入本文参考。在一些实施方案中，待导入细胞中的核酸分子包含在病毒载体中。例如，编码蛋白质的核酸可以插入病毒基因组(或部分病毒基因组)中。指导蛋白质表达的调节元件可以包括在插入病毒基因组中的核酸中(即连接于插入病毒基因组的基因)或者可以由病毒基因组本身提供。
[0118]裸DNA可以通过形成含有DNA和磷酸钙的沉淀而导入细胞中。或者，裸DNA也可以通过如下方式导入细胞:形成DNA与DEAE-葡聚糖的混合物及将混合物与细胞保温或者将细胞与DNA —起在合适缓冲液中保温并且将细胞进行高压电脉冲(例如通过电穿孔)。将裸DNA导入细胞的另一个方法是将DNA与含有阳离子脂质的脂质体悬液混合。DNA/脂质体复合物然后与细胞保温。裸DNA也可以通过例如显微注射直接注射进细胞。
[0119]或者，裸DNA也可以通过将DNA与偶联于细胞表面受体的配体的阳离子如聚赖氨酸复合而导入细胞(见例如 Wu, G.and Wu, C.H.J.Biol.Chem.263:14621，1988;ffilson etal.J.Biol.Chem.267:963-967，1992;及美国专利5，166，320，其均全文并入本文参考)。DNA-配体复合物与受体的结合促进DNA通过受体介导的内吞而摄入。
[0120]使用含有特定核酸序列例如编码蛋白质的cDNA的病毒载体是将核酸序列导入细胞的常用方法。用病毒载体感染细胞具有优点，即大量细胞接受核酸，可以省略选择已接受核酸的细胞的需要。另外，例如通过病毒载体中含有的cDNA编码在病毒载体中的分子通常在摄入病毒载体核酸的细胞中有效表达。
[0121]缺陷型逆转录病毒被良好鉴定用于基因治疗目的的基因转移(综述见Miller，A.D.Blood76:271, 1990)。可以构建重组逆转录病毒，将编码感兴趣蛋白质的核酸插入逆转录病毒基因组。另外，部分逆转录病毒基因组可以被除去以使逆转录病毒复制缺陷。这种复制缺陷的逆转录病毒然后包装成病毒粒，病毒粒可以用于通过使用辅助病毒经标准技术感染靶细胞。
[0122]腺病毒基因组可以被操作，从而其编码及表达感兴趣蛋白质但是其在正常裂解性病毒生命周期中的复制能力被失活。见例如Berkner et al.BioTechniques6:616, 1988;Rosenfeld et al.Science252:431-434，1991;及 Rosenfeld etal.Cell68:143-155, 1992。衍生自腺病毒毒株Ad5型dl324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂细胞成为有效的基因输送运载体及可以用于感染许多种细胞类型，包括呼吸道表皮(Rosenfeld et al., 1992,如前述)，内皮细胞(Lemarchand et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6482-6486, 1992),月干细胞(Herz and Gerard, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2812-2816, 1993)及肌肉细胞(Quantin et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:2581-2584, 1992)。另外，导入的腺病毒DNA (及其中含有的外来DNA)不整合进宿主细胞基因组中，而是保持附加型的，从而避免在导入的DNA整合进宿主基因组的情况中(例如逆转录病毒DNA)由于插入诱变而可能发生的潜在问题。另外，腺病毒基因组携带外来DNA的能力相对于其它基因输送载体更大(高达8kb) (Berkner et al.如前述；Haj-Ahmandand Graham, J.Virol.57:267, 1986)。目前使用的大多数复制缺陷型腺病毒载体被缺失了病毒El和E3基因的全部或部分，但是保留多达80%的腺病毒遗传材料。
[0123]腺相关病毒(AAV)是天然发生的缺陷型病毒，其需要另一种病毒如腺病毒或疱疫病毒作为辅助病毒而进行有效复制及生命周期(综述见Muzyczka et al.Curr.Topicsin Micro, and Immunol.，158:97-129，1992)。其也是少数几个可以将其DNA整合进非分裂细胞并且展现高频率稳定整合的病毒之一(见例如Flotte et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356, 1992;Samulski et al., J.Virol.63:3822-3828,1989;和McLaughlin et al.，J.Virol.62:1963-1973，1989)。含有少至 300 个碱基对的 AAV 的载体可以被包装并且可以整合。外源DNA的空间限于大约4.5kb。可以使用如Tratschinet al.(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260，1985)所述的 AAV 载体将 DNA 导入细胞中。许多种核酸已使用AAV载体导入不同细胞类型中(见例如Hermonat et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6466-6470，1984;Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081,1985;Wondisford et al., Mol.Endocrinol.2:32-39,1988;Tratschin et al.,J.Virol.51:611-619，1984;及 Flotte et al.，J.Biol.Chem.268:3781-3790，1993)。
[0124]当用于将核酸分子导入细胞群的方法导致大比例细胞的修饰及蛋白质由细胞有效表达时，修饰的细胞群可以无需进一步分离或群体内个体细胞的亚克隆而使用。即，细胞群可能足够产生了蛋白质，从而无需进一步细胞分离，细胞群可以立即用于接种细胞培养物用于生产蛋白质。或者，从有效产生蛋白质的一些细胞或单个细胞分离及扩增均质细胞群可能是希望的。
[0125]代替将编码感兴趣蛋白质的核酸分子导入细胞，导入的核酸可以编码另一种多肽或蛋白质，其诱导或增加由细胞内源产生的蛋白质的表达水平。例如，细胞可能表达特定蛋白质，但是可能在不额外处理时就不能表达。类似地，细胞可表达的感兴趣蛋白质的量对于希望目的不够。因此，刺激感兴趣蛋白质表达的物质可以用于诱导或增加细胞对该蛋白质的表达。例如，导入的核酸分子可编码转录因子，其激活或上调感兴趣蛋白质的转录。这种转录因子的表达随即导致感兴趣蛋白质的表达或更强表达。
[0126]在某些实施方案中，指导蛋白质表达的核酸稳定导入宿主细胞中。在某些实施方案中，指导蛋白质表达的核酸瞬时导入宿主细胞中。本领域技术人员基于他或她的实验需求能选择将核酸稳定或瞬时导入细胞。
[0127]编码感兴趣蛋白质的基因可以任选与一或多个调苄基因控制元件连接。在某些实施方案中，基因控制元件指导蛋白质组成型表达。在某些实施方案中，可以使用提供编码感兴趣蛋白质的基因的诱导型表达的基因控制元件。诱导型基因控制元件(例如诱导型启动子)的使用使得可以调节细胞中蛋白质的产生。潜在有用的用于真核细胞中的诱导型基因控制元件的非限制性例子包括激素调节元件(见例如Mader, S.and White, J.H.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5603-5607, 1993)、合成配体调节元件(见例如 Spencer, D.M.et al.，Science262:1019-1024, 1993)和电离辐射调节元件(见例如 Manome, Y.et al.，Biochemistry32:10607-10613，1993;DattajR.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10149-10153, 1992)。本领域已知的额外细胞特异性或其它调节系统可以用于本发明。
[0128]根据本发明的教导，本领域技术人员能选择及任选合适修改导入基因的方法，使得细胞表达感兴趣蛋白质。
[0129]表达的蛋白质的分离
`[0130]一般，典型希望分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质。在某些实施方案中，表达的蛋白质分泌到培养基中，因此作为纯化过程第一步，细胞及其它固体可以通过如离心或过滤除去。
[0131]或者，表达的蛋白质可以结合于宿主细胞表面。例如，可以除去培养基，裂解表达蛋白质的宿主细胞作为纯化过程的第一步。哺乳动物宿主细胞的裂解可以用本领域技术人员熟知的任何手段进行，包括用玻璃珠物理破坏或者暴露于高pH条件。
[0132]表达的蛋白质可以通过标准方法分离及纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和性、大小排阻和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、离心或差异可溶性、乙醇沉淀和/或通过纯化蛋白质的任何其它可利用技术(见例如Scopes, Protein PurificationPrinciples and Practice2nd Edition,Springer-Verlagj New York, 1987;Higgins, S.J.and Hames，B.D.(eds.), Protein Expression: A Practical Approach, OxfordUniv Press, 1999 ;和 Deutscher，M.P.，Simon, M.1.，Abelsonj J.N.(eds.)，Guideto Protein Purification: Methods in Enzymology(Methods in EnzymologySeriesjVol.182)，Academic Press, 1997，其均并入本文参考)。特别对于免疫亲和性层析，蛋白质可以通过其与包含抗体的亲和柱结合而分离，所述抗体针对该蛋白质而产生并且固定于固定支持物上。或者，亲和性标记如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶可以通过标准重组技术附着于蛋白质以使得容易通过合适亲和柱而纯化。蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂或抑肽酶可以在任何阶段或全部阶段被加入以降低或消除纯化过程中的蛋白质降解。当细胞必须被裂解以分离和纯化表达的蛋白质时，蛋白酶抑制剂是特别有利的。
[0133]本领域技术人员理解精确纯化技术根据待纯化蛋白质的特征、表达蛋白质的细胞的特征和/或细胞生长的培养基组成而变化。
[0134]药物配制[0135]在本发明某些优选实施方案中，产生的多肽或蛋白质具有药物学活性，用于制备药物。上述本发明组合物可以给予对象或者可以先配制以用于通过任何可利用途径输送，包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、口服、鼻、经支气管、眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。本发明药物组合物典型包括表达自哺乳动物细胞系的纯化的多肽或蛋白质、输送剂(即阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、表面活性剂等，如上述)及药物学可接受载体。本文所用“药物学可接受载体”包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与给药相容。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
[0136]药物组合物被配制为与其给予途径相容。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列成分:用于注射的无菌稀释剂如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或硫酸盐；及用于调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。PH可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制备物可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂小瓶中。
[0137]适合注射使用的药物组合物典型包括无菌水溶液(当可溶于水时)或者分散液及用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。为静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、细菌抑制水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，组合物应是无菌的并且应该是能容易注射程度的流动的。优选的药物配制物在生产及储存条件下是稳定的，必须抗微生物如细菌和真菌污染作用而保存。一般，相关载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、乙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物。可以通过使用涂层如卵磷脂、在分散液情况中通过保持所需颗粒大小及通过使用表面活性剂而保持合适流动性。防止微生物作用可以通过各种抗细菌及抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或者氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶而实现。
[0138]无菌注射溶液可以通过将需要量的纯化的多肽或蛋白质与上述一种成分或成分组合根据需要掺入合适溶剂中制备，随后过滤灭菌。通常，通过将表达自哺乳动物细胞系的纯化的多肽或蛋白质掺入含有基础分散介质和上述所需其它成分的无菌运载体中而制备分散液。在制备无菌注射溶液的无菌粉末情况中，优选制备方法是真空干燥及冻干，其产生来自先前无菌过滤溶液的活性成分加任何额外希望成分的粉末。
[0139]口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗给予，纯化的多肽或蛋白质可以掺入赋形剂并且以片剂、锭剂或胶囊剂例如明胶胶囊形式使用。口服组合物也可以用液体载体制备用作漱口水。药物学相容粘合剂和/或佐剂材料可以包括作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何下述成分或者类似性质的化合物:粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes ;助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者芳香剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味芳香剂。用于口服输送的配制物可以有利地掺入物质改善胃肠道内稳定性和/或增强吸收。
[0140]对于吸入给予，包含表达自哺乳动物细胞系的纯化的多肽或蛋白质及输送剂的本发明组合物优选以气溶胶喷雾形式从含有合适推进剂例如气体如二氧化碳的加压容器或分配器或雾化器输送。本发明特别包括用鼻喷雾器、吸入器或者其它直接输送至上和/或下气道而输送所述组合物。针对流感病毒的DNA疫苗的鼻内给予已示出诱导⑶8T细胞应答，表明当以这种途径输送时呼吸道中至少一些细胞可以摄入DNA，本发明的输送剂能增强细胞摄入。根据本发明某些实施方案，包含表达自哺乳动物细胞系的纯化的多肽或蛋白质及输送剂的组合物配制为大的多孔颗粒用于气溶胶给予。
[0141]全身给予也可以通过经粘膜或经皮装置进行。对于经粘膜或经皮给予，适于待渗透的屏障的渗透剂用于配制物中。这种渗透剂通常是本领域已知的，包括例如用于经粘膜给予的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给予可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于经皮给予，纯化的多肽或蛋白质及输送剂被配制成本领域通常已知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。
[0142]组合物也可以制备成栓剂形式(例如与常规栓剂基如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠剂用于直肠输送。
[0143]在一个实施方案中，组合物与载体一起制备，所述载体保护多肽或蛋白质抗机体的快速清除，如控制释放配制物，包括移植物及微囊输送系统。可以使用生物降解生物相容聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类(polyorthoesters)及聚乳酸。制备这种配制物的方法是本领域技术人员已知的。材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.商业化获得。脂质体悬浮液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药物学可接受载体。这些可以根据本领域技术人员已知方法制备，例如如美国专利4，522，811所述。
[0144]有利的是配制口服或肠胃外组合物，呈易于给予和剂量均匀性的剂量单位形式。剂量单位形式在本文是指物理分离单位，适于作为单元剂量给予待治疗对象；每个单位含有计算产生希望的治疗效果的预定数量的活性多肽或蛋白质，与所需的药物学载体结合。
[0145]根据本发明表达的多肽或者蛋白质可以以各种间隔在不同时间期间根据需要给予，例如每周一次，大约1-10周、2-8周、大约3-7周、大约4、5或6周等。本领域技术人员理解某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或失调的严重性、先前治疗、对象的一般健康和/或年龄以及存在的其它疾病。通常，用本文所述多肽或蛋白质治疗 对象可以包括单次治疗，或者在许多情况中可以包括一系列治疗。另外应理解合适剂量可依赖于多肽或蛋白质的效力并且可以任选地针对特定受体而调整，例如通过给予增加剂量直至实现预选择的希望应答。应理解针对任何特定动物对象的具体剂量水平可以依赖于各种因素，包括采用的具体多肽或蛋白质的活性、对象的年龄、体重、一般健康、性别及饮食、给予时间、给予途径、分泌速率、任何药物组合及待调节的表达或活性程度。
[0146]本发明包括本发明组合物用于治疗非人动物的用途。因此，给药剂量和方法可以根据兽药学和医学已知原则进行选择。可以在例如Adams, R.(ed.), VeterinaryPharmacology and Therapeutics, 81 edition, 1wa StateUniversityPress; ISBN:0813817439; 2001 中找到指导。
[0147]本发明的药物组合物可以包括在容器、包装或者分配器中，与给药指导在一起。
[0148]试剂盒
[0149]本发明还提供了包括用于制备细胞培养基的成分的试剂盒，包括本文所述的含铁组合物。这种试剂盒可以特别用于增加细胞培养物的细胞密度、存活性和/或效价。
[0150]在一些实施方案中，本发明的这种试剂盒包括用于制备初始细胞培养基的一或多种试剂。这种试剂盒可以包括用于补充成分确知的细胞培养基的一或多种试剂(例如激素和/或其它生长因子；无机离子如钠、氯、钙、镁和磷酸根；缓冲剂；维生素；核苷或核苷酸；微量元素；氨基酸；脂质；或者葡萄糖或其它能量来源)。本发明的试剂盒可以包括单独的含铁组合物(例如FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA,Fe (NO3) 3、FeCl2或者FeCl3X在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括单独的含铁组合物，其实现在本文所述细胞培养基中的合适浓度(例如范围在100μΜ和5mM之间)。本发明试剂盒还可以含有在本文所述细胞培养过程期间一或多个时间点将所述单独的铁组合物添加至初始细胞培养基的指导(例如用户手册)。
[0151]本发明试剂盒的成分可以提供在各个容器中，多个这种容器可以提供在一个共同外壳之中。
[0152]本发明通过下述非 限制性实施例更详细描述。实施例的提供仅用于举例，不应被解释为限制本发明范围。
实施例
[0153]实施例1:在第3天后向补料分批培养物中添加Fe
[0154]本实验证实在第3天后在生产治疗性蛋白的细胞的补料分批培养期间添加Fe导致细胞密度、存活性和效价显著增加。
[0155]CHO细胞、即细胞系I使用补料分批培养过程在化学成分确知的富集培养基(chemically defined enriched medium)中培养。在第3天后将高浓度Fe (例如100 μ M-5mM)加入到细胞培养物中以实现不同Fe浓度(例如0mM、0.1mM、1.0mM,2.0mM或5.0mM)。在这个实验中，使用柠檬酸铁，细胞在摇瓶中培养。在整个细胞培养过程的不同时间点进行细胞的细胞密度、存活性和效价分析。
[0156]活细胞密度使用数字成像识别方法用CEDEX确定。在第3天后添加不同剂量Fe对举例细胞系I的细胞生长的作用示于图1。如图1可见，与在铁不存在下生长的细胞相比，在第3天后添加Fe增加了活细胞密度。
[0157]细胞存活性通过台盼蓝排除法经CEDEX确定。在第3天后添加不同剂量Fe对举例细胞系I的细胞存活性的作用示于图2。如图2所示，与在铁不存在下生长的细胞相比，在第3天后添加Fe增加了细胞存活性。
[0158]另外，确定了 Fe添加对晚期细胞培养物的细胞存活性的作用。具体地，在第16天确定在铁存在或不存在下生长的细胞的细胞存活性。如图3所示，添加Fe增加了第16天的细胞存活性。
[0159]还确定了在第3天后添加不同剂量Fe对抗体效价的作用。在第16天通过蛋白A亲和性HPLC方法确定了在各种浓度铁存在或不存在下生长的细胞的抗体效价。如图4所示，添加Fe增加了第16天的抗体效价。
[0160]还观测到最佳3天后Fe添加浓度很可能是0.在第3天后任一天添加Fe均是有效的。将Fe分配到多个补料可以比一次性添加更好。
[0161]在第2个举例细胞系即细胞系2上进行了类似实验，举例结果示于图5。如图5所示，添加Fe改善了细胞密度、存活性及效价，特别是在晚期。
[0162]除了 Fe-柠檬酸盐，也测试了其它铁复合物如FeSO4或Fe-运铁蛋白的作用。图6总结了举例结果，示出在第3天后添加FeSO4或Fe-柠檬酸盐对补料分批培养物的细胞系I第14天的活细胞密度及存活性的作用。
[0163]在摇瓶及生物反应器中进行了类似实验，效果是相同的。这个效果对于不同产物(如不同的单克隆抗体)均观测到。
[0164]因此，添加Fe的有益效果不依赖于细胞系、细胞培养规模、Fe来源及产物。还确定了产物质量不受高Fe浓度影响。
[0165]实施例2:在第6天添加Fe
[0166]表达纳米抗体的CHO细胞在摇瓶中通过补料分批培养生长。细胞最初在7%C02温箱中在37°C培养0-4天，在第4天后转到31°C。在第6天加入FeSO4以实现细胞培养基中铁浓度为ImM。如实施例1所述，在细胞培养过程的不同时间点进行细胞的细胞密度、存活性、效价、乳酸水平和Qp分析。举例结果示于图7-10。如图7-10所示，添加Fe显示在细胞培养期间的显著益处，包括存活性改善(例如如图7所示在第15天96%对70%)、效价改善(例如如图8所示在第15天3.2g/L对1.5g/L)、Qp改善(例如如图9所示20 μ g/e6/天对10 μ g/e6/天)以及乳酸水平降低(例如添加Fe的细胞培养物剩余乳酸接近0，而未添加Fe的对照培养物不是，其在第15天增至2.24g/L，如图10所示)。
[0167]实施例3:在第O天添加Fe
[0168]设计这个实验以测试在第O天添加高浓度Fe是否有有利效果。产生单克隆抗体的细胞系(克隆2.8)的细胞在具有7%C02的pH受控摇瓶中以~120rpm用轨道摇床培养。接种密度是1.5X106细胞/mL。细胞培养14天。基础培养基是补加氨基酸包括4mM谷氨酰胺的化学成分确知的基础培养基。补料培养基是化学成分确知的浓缩补料培养基。在第O天或第9天添加Fe-柠檬酸盐或者FeSO4以实现细胞培养基中铁浓度为600 μ Μ。如前述实施例所述，在细胞培养过程不同时间点将细胞进行细胞密度、存活性、效价及Qp分析。举例结果不于图11_13。
[0169]在第O天添加Fe-柠檬酸盐导致在细胞培养早期增加的细胞生长，而在第9天添加Fe显示在细胞培养晚期改良的细胞密度(图11)。但是，在第O天添加Fe-柠檬酸盐似乎对于在细胞培养结束时保持较高存活性没有帮助。例如，如图12所示，在第O天添加600 μ MFe-柠檬酸盐的细胞培养物第14天的存活性是大约75%，其与未添加Fe的对照培养物第14天的存活性74-80%相当。相反，在第9天添加Fe的细胞培养物的细胞存活性是85_90%。
[0170]另外，如图13所示，在第O天添加Fe-柠檬酸盐的细胞培养物的Qp低于培养物所有其他条件。
[0171]在一些情况中，当在细胞培养开始时添加Fe时，在高Fe浓度观测到毒性。例如，在第O天将Fe添加到细胞系1，对摇瓶中第3天的细胞存活性的举例作用示于图14。如图14可见，在高于100μ M的Fe浓度观测到毒性。与实施例1和2的结果相比，令人惊奇地在第O天之后添加的高浓度Fe不仅没有毒性，而且证实对细胞培养物的益处，包括细胞存活性和细胞生长。
[0172]等价物
[0173]本领域技术人员使用不超过常规的实验将认识到或者能够确定本文描述的本发明特异实施方案的许多等价物。本发明的范围不限于上述描述，而是在所附权利要求书中限定。
[0174]在权利要求书中，冠词“一个”和“所述”可以指一或多个，除非存在相反指示或者根据上下文很明显。在一组的一或多个成员之间包括“或者”的权利要求或描述被认为在给定产物或方法中存在、采用或者与给定产物或方法相关的一个、一个以上或所有的组成员，除非有相反指示或者根据上下文很明显。本发明包括这样的实施方案，其中在给定产物或方法中存在、采用一个组成员或者一个组成员与给定产物或方法相关。本发明包括这样的实施方案，其中在给定产物或方法中存在、采用一个以上或所有的组成员或者一个以上或所有的组成员与给定产物或方法相关。另外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和交换，其中来自一或多个权利要求的一或多个限制、元件、从句、描述性术语等被引入另一权利要求。例如，依赖于另一个权利要求的任何权利要求可以被修饰以包括在依赖于相同基础权利要求的任何其它权利要求中发现的一或多个限制。
[0175]当元件一列表呈现时例如以马库什形式，应理解也公开了元件的每个亚组，并且任意元件均可以从组中去除。应理解通常当发明或发明某些方面提及包含特定元件、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这种元件、特征等组成或者基本上由这种元件、特征等组成。为简明，这些实施方案在本文不特异以特定书面方式限定。注意术语“包含”是开放式的并允许包括额外元`件或步骤。
[0176]当给出范围时，端点是包括在内的。另外，应理解除非另外指出或者另外根据上下文及本领域技术人员理解很明显，在本发明不同的实施方案中表示为范围的值可以假定是所述范围内的任何特定值或子范围，至所述范围底限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚指出。
[0177]另外，应理解落入现有技术的本发明任何特定实施方案可以从一或多个权利要求中明确排除。因为这种实施方案被视为本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使排除未在本文明确描述。本发明组合物的任何特定实施方案(例如任何靶向部分、任何疾病、失调和/或病症、任何连接剂、任何给予方法、任何治疗应用等)可以从一或多个权利要求中排除，为了任何原因，与现有技术存在是否相关。
[0178]提供上述讨论的出版物及全文仅因为它们在本申请申请日之前公开。本文的任何内容不应解释为承认本发明不在这种现有技术公开内容之前。
[0179]并入参考
[0180]本申请引用的所有出版物和专利文件均以其全文并入本文参考，如同每个出版物或专利文件的内容均并入本文一般。
【权利要求】
1.增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤: (a)提供在细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程'及 (b)在细胞培养过程期间将含铁组合物添加至所述细胞培养基，从而在所述细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。
2.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程的第O天之后添加。
4.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程的第I天或第I天之后添加。
5.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程的第3天或第3天之后添加。
6.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程的第6天或第6天之后添加。
7.权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程期间的多个时间点添加。
8.权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度范围在100μΜ和5mM之间。`
9.权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度范围在300 μ M和ImM之间。
10.权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度是ImM0
11.权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系、人成视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾细胞系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠睾丸支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VER0-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞或者人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
13.权利要求12的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是补料分批培养过程。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是分批-再流加培养过程。
16.权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是灌注培养过程。
17.权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是大规模生产培养过程。
18.权利要求17的方法，其中所述细胞培养基的体积是至少大约500L。
19.权利要求1的方法，其中所述细胞培养基不含水解物。
20.权利要求1的方法，其中所述细胞培养基含有水解物。
21.权利要求1的方法，其中所述细胞携带编码重组蛋白的基因。
22.权利要求21的方法，其中所述重组蛋白是抗体或其片段。
23.权利要求22的方法，其中所述抗体是抗IL-22抗体。
24.权利要求22的方法，其中所述抗体是抗GDF-8抗体。
25.权利要求22的方法，其中所述抗体是Myo29。
26.权利要求22的方法，其中所述抗体是单域抗体。
27.权利要求26的方法，其中所述单域抗体是抗TNF纳米抗体。
28.权利要求21的方法，其中所述重组蛋白是糖蛋白。
29.权利要求21的方法，其中所述重组蛋白是治疗性蛋白。
30.权利要求29的方法，其中所述治疗性蛋白是生长因子、凝血因子、细胞因子、融合蛋白、药物物质、疫苗、酶或 Small Modular ImmunoPharmaceutical?(SMIP) ?
31.权利要求21-30任一项的方法，其中所述方法进一步包括纯化所述重组蛋白。
32.从根据权利要求21-31任一项的方法培养的细胞生产的重组蛋白。
33.防止或者延迟细胞培养物中细胞死亡的方法，所述方法包括在开始细胞培养过程后的一或多个时间点添加含铁组合物的步骤。
34.抑制细胞培养物中凋亡的方法，所述方法包括在开始细胞培养过程后的一或多个时间点添加含铁组合物的步骤。
35.权利要求33或34的方法，其中所述含铁组合物在第O天后添加。
36.权利要求33或34的方法，其中所述含铁组合物在第3天后添加。
37.权利要求33或34的方法，其中所述含铁组合物在第6天添加。
38.权利要求33或34的方法，其中铁是以实现在细胞培养基中的浓度范围在100μΜ和5mM之间的量添加。
39.权利要求33或34的方法，其中铁是以实现在细胞培养基中的浓度范围在300μ M和ImM之间的量添加。
40.权利要求33或34的方法，其中铁是以实现在细胞培养基中的浓度为ImM的量添加。
41.权利要求33或34的方法，其中所述细胞培养过程是补料分批培养过程。
42.权利要求33或34的方法，其中所述细胞培养是分批-再流加培养。
43.权利要求33或34的方法，其中所述细胞培养是灌注培养。
44.权利要求33或34的方法，其中所述细胞培养是大规模生产培养。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞培养物的体积是至少大约500L。
46.权利要求33或34的方法，其中所述含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3及其组合。
47.制备细胞培养基的试剂盒，包含: (a)用于制备初始细胞培养基的一或多种试剂'及 (b)单独的含铁组合物； (C)在细胞培养过程期间的一或多个时间点将所述单独的含铁组合物添加到所述初始细胞培养基中以增加细胞密度、存活性和/或效价的指导。
48.权利要求47的试剂盒，其中所述单独的组合物的量是实现初始细胞培养基中铁浓度范围在100μΜ和5mM之间的量。
49.权利要求47的试剂盒，其中所述单独的组合物的量是实现在至少500L的细胞培养物中铁浓度范围在100 μ M和5mM之间的量。
50.权利要求47的试剂盒，其中所述单独的组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3 及其组合。
51.权利要求47的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于补料分批培养的补充成分。
52.权利要求47的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于分批-再流加培养的补充成分。
53.权利要求47的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于灌注培养的补充成分。
54.权利要求51-53任一项的试剂盒，其中所述补充成分选自激素和/或其它生长因子、无机离子、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂质、葡萄糖或其它能量来源及其 组合。
【文档编号】C12N5/00GK103890166SQ201280051721
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月9日 优先权日:2011年10月21日
【发明者】W·王, Y-T·栾, D·德拉波, R·P·诺兰 申请人:辉瑞公司