一种基于SSR标记的无花果种质资源亲缘鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学dna标记技术与应用领域，特别涉及一种基于ssr标记的无花果种质资源亲缘鉴定方法。
背景技术：
：无花果(学名：ficuscarical.)，别称映日果、奶浆果、蜜果、树地瓜、天仙果、明目果、菩提圣果，是一种开花植物，隶属于桑科榕属，主要生长于一些热带和温带的地方，属亚热带落叶小乔木。无花果有较强的耐盐性，耐瘠薄，根系发达、管理简单，其果营养丰富，具有提高免疫功能的作用，经常食用能增强抗病能力。近年来无花果在我国栽培面积迅速扩大。我国无花果栽培品种除了早期引进的新疆早黄、新疆晚黄、青皮、布兰瑞克及紫果等品种外，自20世纪80代以来从美国、日本等国等国相继引入了一些果大、品质优、产量高的无花果新品种，极大地丰富了我国无花果的品种资源。并开展了育种研究，陆续培育了10几个新品种。但目前我国对无花果种质资源遗传多样性和系谱关系方面的研究还极其缺乏。这对无花果资源的保护利用都是十分不利的。为了更好的多我国目前的无花果资源进行评价利用，对其进行遗传多样性和亲缘关系分析是必要的基础工作。分子标记是研究植物遗传多样性的有力工具，具有准确性高、重复性好、不受环境条件干扰等优点，ssr是一种应用十分广泛的分子标记，被广泛应用在植物亲缘关系分析、遗传多样性分析、连锁图谱建立、分子鉴定等方面，具有操作简单，准确性高等特点。技术实现要素：发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于ssr标记的无花果种质资源亲缘鉴定方法。本发明提供了基于ssr标记的无花果资源分析的稳定体系，多态性高的引物。技术方案：本发明提供了一种基于ssr标记的无花果种质资源亲缘鉴定方法，其包括以下步骤：1)提取不同品种的无花果的基因组dna；2)ssr引物的筛选；3)利用ssr引物对不同品种的无花果的基因组dna进行pcr；4)对pcr产物进行毛细管电泳；5)对电泳结果进行多态性分析得出遗传多样性，经过聚类分析得出无花果种质资源亲缘关系。其中，上述步骤2)中筛选得到15对ssr引物对，所述引物对序列如seqidno：1～30。其中，上述步骤3)的pcr反应体系为：1×pcr缓冲溶液，2mmol/ldntps，0.4mmol/l引物，dna模板40ng，1utaq。其中，上述步骤3)的pcr反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火复性35s，72℃延伸40s，共35个循环；最终72℃延伸3min。其中，上述步骤4)的毛细管电泳中甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μl加入上样板中，再加入1μl稀释10倍的pcr产物。本
发明内容还包括用于无花果种质资源亲缘鉴定的ssr标记的引物对，所述引物对序列如seqidno：1～30。有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明的ssr反应体系的产物检测图谱清晰(可见图2和图3)，此图谱很准确地反映出此检测技术的可靠性和稳定性。本发明的15个ssr标记在30个无花果品种资源中表现多态性，可重复(表4)，说明是稳定可靠的标记，可以用来进行无花果品种资源的遗传多样性和亲缘关系分析。ssr标记是以pcr为基础的分子标记技术，扩增片段的大小往往差别很小，以琼脂糖和聚丙烯酰胺为代表的检测技术未能有效分开，而利用毛细管电泳图谱技术直接测定出片段大小，是非常准确和有效的检测技术。附图说明图1为无花果品种的聚类图；图2引物fcup069-6的扩增产物的毛细管电泳图谱，图中显示扩增得到两个等位位点；图3引物fcup044-6-22的扩增产物的毛细管电泳图谱，图中显示扩增得到两个等位位点。由于本发明的电泳图有15*30＝450张，由于电泳图相差不大，因此选择了具有代表性的电泳图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例11、试验材料：本试验共搜集30份无花果品种资源参见表1表1供试的无花果品种2、dna提取2015年春季取(30个供试品种无花果幼嫩叶片作为材料)，采用天根dna提取试剂盒提取总dna用于ssr荧光标记分析。3、ssr引物筛选从现有与无花果相关ssr引物中搜集49对，依据引物多态性，筛选无花果引物15对用于本研究，用荧光标记物fam对正向引物进行标记。15对引物参见表2；说明：49对引物是从已经发表的无花果相关的ssr引物中选择的。对选取的49对引物根据其pcr扩增产物的多态性，进一步筛选多态性高，重复率高的引物15对，作为本试验的引物。表2引物及其序列4、利用ssr引物对30个品种的无花果的基因组dna进行pcr4.1反应体系的建立和优化ssr荧光引物pcr反应体系(共25μl)：1×pcr缓冲溶液，2mmol·l-1dntps，0.4mmol·l-1引物，dna模板40ng，1utaq。94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃(退火温度在54℃上下波动，具体见表3)复性35s，72℃延伸40s，共35个循环；最终72℃延伸3min。说明：每个样品的pcr反应体积均为25μl，作为扩增模板的dna样品体积1μl。表3引物退火温度引物名称退火温度fcup038-659℃fcup044-655℃fcup045-657℃fcup066-756℃fcup069-655℃lmfc1754℃lmfc1954℃lmfc2756℃lmfc2856℃lmfc3056℃lmfc3748℃lmfc3848℃mfc258℃mfc748℃mfc857℃5、毛细管电泳方法将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μl加入上样板中，再加入1μl稀释10倍的pcr产物。然后使用3730xl测序仪进行毛细管电泳(电泳图结果参见图2～3)。6、数据处理与数据分析6.1利用genemarker中的fragment(plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。按照convert1.31软件要求的格式录入到excel中，然后用convert1.31软件转化成popgene软件所要求格式。使用popgene1.32软件进行统计分析。计算等位基因数(a)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)和shannon信息指数(i)。采用upgma法进行聚类分析。6.2ssr标记的多态性分析从49对无花果ssr引物中15对谱带清晰、多态性高的引物。利用选出的15对无花果引物对30个无花果品种材料进行扩增，扩增产物经过毛细管电泳检测。共检测出79个等位变异，每对引物检测出2-10个等位变异，平均5.27个，每个引物所扩增的均为多态性等位基因。15个位点扩增的片段长度在133～326bp之间；各位点pic值0.3328-0.8757，平均为0.5303；观测杂合度(ho)0.1667～0.8667，平均为0.4768；期望杂合度(he)0.3328～0.8757，平均为0.5929；各位点的shannon信息指数(i),0.6049～2.1273，平均为1.1360。结果表明，本试验所搜集的无花果资源具有较丰富的遗传多样性。表415对ssr引物扩增产物分析6.3聚类分析经过聚类分析30份无花果品种资源在遗传相似系数0.67处，可以分为两个类群，类群i和类群ii，在类群i中，只有3个无花果品种，分别是华丽、以色列和新疆早黄；其他27个无花果品种聚为类群ii。在类群ii中，在遗传相似系数0.76处又可分为a、b、c三个亚类，其中a亚类包括布兰瑞克、白热那亚、香蕉、紫色波尔多等19个无花果品种，其中布兰瑞克和白热那亚被聚在一起；香蕉、紫色波尔多、加州黑、玛斯义陶芬、亚当、罗伊尔、杜鲁等品种被聚在一起，其中香蕉和紫色波尔多，加州黑和不详，罗伊尔和杜鲁，分别被聚在一起，表现出更紧密的亲缘关系；b1011、波姬红、白马赛、d110、美丽亚、金傲芬、a1213、丰产黄、国王、丽莎等品种被聚在一起，其中b1011和波姬红，d110和美丽亚，国王和丽莎，分别被聚在一起，表现出更紧密的亲缘关系；在b亚类中只有哈代一个品种；在c亚类中，包括中国紫果、青皮、紫宝、格莱斯、日本紫果、白蜜、紫涛芬等品种，其中青皮和紫宝，格莱斯和日本紫果，分别被聚在一起，表现出更紧密的亲缘关系(参见图1)。当前第1页12