用于检测煤地质微生物古菌物种的DNAMarker及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种煤地质环境微生物菌群的变性梯度凝胶电泳(dgge)分子检测中煤地质环境古菌专用的物种dnamarker，属于微生物分子生态学领域。

背景技术：

煤地质环境微生物是指煤层产出水样或煤样中检测到的微生物或上述两样经富集培养后检测到的微生物，主要分为细菌和古菌两大类。煤地质环境中的古菌主要指产甲烷古菌。产甲烷古菌分布十分广泛，从土壤到湖泊沉积物，从陆地到海洋，从零下低温环境到100℃以上的高温环境，遍布地球大部分的缺氧环境，它们在地球碳素循环中扮演着重要角色，据统计，在所有ch4排放源中，约69％的ch4来源于产甲烷古菌的新陈代谢活动。在煤层以及煤层产出水中检测到的产甲烷古菌，它们主要参与降解煤产甲烷的过程中，产生的ch4称为生物成因煤层气。目前，生物成因煤层气具体的生成过程及机理还不是十分清楚，但唯一确定的是产甲烷的最后一步，即由产甲烷古菌将co2+h2、乙酸和一些甲基化物质转化为ch4，且ch4是它们唯一的代谢产物。根据产甲烷古菌利用底物类别的不同，可以将产甲烷古菌分为3个营养类型：甲基营养型、氢营养型及乙酸营养型。甲基营养型产甲烷古菌的特征菌属主要有methanomethylovorans、methanolobus等；氢营养型产甲烷古菌的特征菌属主要有methanothermobacter、methanolinea和methanoculleus等；乙酸营养型产甲烷古菌的特征菌属主要为methanosaeta。而常见的methanosarcina可以利用co2+h2、乙酸以及部分甲基化物质产生ch4。研究煤层气相关产甲烷古菌的多样性及其活性与功能对煤层气再生和揭示生物降解煤具有重要意义。

在以往的几十年，国内外学者主要基于16srrna的未培微生物研究技术来分析煤层气相关微生物的多样性，常见于克隆文库、末端限制性片段长度多样性(terminal-restrictionfragmentlengthpolymorphism，t-rflp)、高通量测序、变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，dgge)等分析。各项分析技术都有其特有的局限性。其中，克隆文库建库库容量有限，往往不能准确地反应原始样品中微生物的多样性。t-rflp可能会对微生物的多样性造成过多估计，准确性较差。高通量测序虽然准确性高，但针对微生物多样性分析的周期较长，耗时又耗钱，成本较高。

dgge技术在微生物多样性的研究应用中表现出了其可靠性、精确性、高效性等优点，但是，对微生物多样性的分析过程中仍需依赖于dgge条带的克隆及测序分析，需要一定的实验周期，因而不能够快速直观地对dgge条带所属的种属地位进行表征。在生命科学研究领域，dnamarker常作为一种分子标记运用在分子生物学的各种电泳过程中，以便直观地对样品进行分析。一般的dnamarker是由分子量不同的dna片段混合组成，常应用在分子生物学实验中。这种dnamarker的使用主要是通过其大小粗略估算样品dna分子量的大小，如dl2000、100bp、lambdadna/hindiii等。在微生物多样性分析方面，dnamarker可以作为个体特异性的遗传标记。因此，需要一种dnamarker能够应用在微生物菌群pcr-dgge的快速检测中。但是截至目前为止，还没有有关煤地质环境微生物菌群pcr-dgge检测中dnamarker的研究报道。综上所述，获得煤地质环境微生物菌群分子检测的dnamarker对应用pcr-dgge检测煤地质环境微生物菌群多样性及其研究微生物降解煤产生煤层气的机制具有重要意义。

技术实现要素：

为实现高效快速且又经济有效地应用pcr-dgge技术检测煤地质环境微生物菌群的多样性，本发明公开了一种煤地质微生物pcr-dgge检测中古菌物种dnamarker及制备方法和应用。

本发明是通过以下方法实现的：

用于检测煤地质微生物古菌物种的dnamarker，该dnamarker由8条dna片段a-h组成，dna片段a的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，dna片段b的核苷酸序列如seq.id.no.2所示，dna片段c的核苷酸序列如seq.id.no.3所示，dna片段d的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，dna片段e的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，dna片段f的核苷酸序列如seq.id.no.6所示，dna片段g的核苷酸序列如seq.id.no.7所示，dna片段h的核苷酸序列如seq.id.no.8所示。

本发明用于检测煤地质微生物古菌物种的dnamarker制备方法，包括以下步骤：

(1)提取煤地质环境样品中微生物基因组dna，以提取的微生物基因组dna为模板，第一次pcr扩增古菌16srdnav3-v4区序列，将第一次pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目标dna片段；

(2)以回收的目标dna片段为模板进行第二次pcr扩增，将第二次pcr扩增产物进行dgge分析，从dgge胶上切下的dna片段为古菌16srdnav3-v4区dna片段；

(3)以步骤(2)dgge胶上切下的古菌16srdnav3-v4区dna片段为模板经第三次pcr扩增，回收第三次pcr扩增产物；

(4)将步骤(3)的第三次pcr扩增产物克隆到t载体上获得连接产物；

(5)将经步骤(4)获得的连接产物转入宿主菌，筛选阳性重组子；

(6)以阳性重组子作为模板进行第四次pcr扩增；

(7)将步骤(6)第四次pcr扩增产物再次进行dgge分析，验证条带位置，条带位置正确的dna片段作为煤地质微生物古菌物种dnamarker组成中的dna片段a；

(8)重复步骤(1)至(7)，制备煤地质微生物古菌物种dnamarker组成中的dna片段b-h；

(9)步骤(7)和(8)的组合构成煤地质微生物古菌物种的dnamarker。

优选地，本发明步骤(6)中第四次pcr扩增中所使用的模板浓度为16～21ng/μl。

优选地，本发明所述步骤(2)中的从dgge胶上切下的dna片段用30μl去离子水在4℃条件下浸泡过夜，取浸泡液作为步骤(3)的模板。

优选地，本发明所述步骤(4)中t载体为北京全式金生物技术有限公司的载体。

优选地，本发明所述步骤(5)中宿主菌为大肠杆菌dh5α。

优选地，本发明所述步骤(1)中第一次pcr扩增和步骤(3)中第三次pcr扩增时用到的引物为0357f/0691r；所述步骤(2)中第二次pcr扩增时用到的引物为0357f-gc/0691r；所述步骤(4)中第四次pcr扩增时用到的引物为0357f-gc/0691r-a和0357f-gc/0691r-g。

优选地，本发明所述引物0357f/0691r、0357f-gc/0691r、0357f-gc/0691r-a和0357f-gc/0691r-g的序列为：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

0691r-a：ggattacaagatttcac；

0691r-g：ggattacaggatttcac。

本发明用于检测煤地质微生物古菌物种的dnamarker的应用，将物种dnamarker与6×dna上样缓冲液以体积比5∶1混合，用于煤地质微生物pcr-dgge古菌物种的检测。

本发明提到的pcr-dgge检测中的dnamarker并非dna片段大小的尺度，而是通过其物种特异性序列(16srdna的可变区v3-v4区)来精准表征样品dna所属的菌属地位，marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，仅限于在变性梯度凝胶电泳中使用。本发明应用于pcr-dgge检测中的dnamarker具有条带锐利、条带亮度均一、marker组成条带数不受限制、种属特异性等优点。此外，本发明公开的dnamarker克隆在了载体上，可以通过培养大肠杆菌得到大量质粒，然后通过pcr法获得，生产重复性高、稳定性好。此种marker的使用可以加速实验进程，减短实验耗时，尤其是样品量较大的实验。

附图说明

图1为本发明使用的以山西沁水盆地高阶煤层产出水样为菌源的不同富集培养方式获得的培养样品基因组dna提取结果0.7％琼脂糖凝胶电泳图，

图中为不同培养方式的前期取样样品，m为lambdadna/hindiii；

图2为本发明使用高阶煤层产出水样的富集培养液基因组dna进行pcr扩增古菌16srdnav3-v4区的结果1.5％琼脂糖凝胶电泳图，

图中m为100bp；

图3为本发明使用高阶煤层产出水样富集培养液基因组dna进行pcr扩增古菌16srdnav3-v4区扩增产物的dgge图谱，

dgge的电泳条件为预电泳200v，5min，然后85v，12h，胶浓度为8％，变性范围为40％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国bio-rad公司生产的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

图4为本发明筛选阳性克隆子菌落pcr结果1.5％琼脂糖凝胶电泳图，

图中k1为空白对照，k2为克隆片段，kl为以蓝斑为模板的阳性对照；

图5为本发明筛到的阳性克隆子质粒提取结果0.7％琼脂糖凝胶电泳图；

图6为本发明筛选部分dnamarker组成条带的dgge图谱，

图中c、e、f、i、k分别为dnamarker的组成条带，dgge的电泳条件为预电泳200v，5min，然后85v，12h，胶浓度为8％，变性范围为40％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国bio-rad公司生产的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

图7为本发明制备的煤地质微生物pcr-dgge检测中古菌物种dnamarker(命名为cbmarc1)的dgge电泳图谱，以及各序列菌属相似性比对结果，

图中8个条带分别标记为a、b、c、d、e、f、g、h。dgge的电泳条件为预电泳200v，5min，然后85v，12h，胶浓度为8％，变性范围为40％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国bio-rad公司生产的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

图8为应用本发明制备的古菌物种dnamarker(cbmarc1)对高阶煤层产出水与褐煤的富集培养样品进行检测的dgge电泳图谱，

图中cbmarc1为本发明制备的用于检测煤地质古菌物种的dnamarker，其他泳道样品为高阶煤层产出水与褐煤富集培养不同时间段的取样样品，

dgge的电泳条件为预电泳200v，5min，然后85v，12h。胶浓度为8％，变性范围为40％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国bio-rad公司生产的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)。

具体实施方式

实施例1

1.提取不同富集培养方式的前期富集培养液中的基因组dna，选用2套引物进行pcr扩增；

1.1基因组dna提取步骤见专利文献cn2016103727233，基因组dna0.7％琼脂糖凝胶验证图谱如附图1所示；

1.2第一次pcr扩增，得到的pcr扩增产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用，pcr反应在ptc-200,bio-rad，usapcr仪上运行；

1.2.1pcr反应体系：

1.2.2pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34个循环，72℃10min，10℃forever，

1.2.3引物序列如下：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

1.3上述纯化回收的dna片段再次进行pcr扩增，即第二次pcr扩增。pcr扩增产物1.5％琼脂糖凝胶验证图谱如附图2所示。得到的pcr扩增产物于-20℃条件下保存备用，pcr反应在ptc-200,bio-rad，usapcr仪上运行；

1.3.1pcr反应体系：

1.3.2pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34个循环，72℃10min，10℃forever，

1.3.3引物序列如下：

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

2.dgge分析：

2.1选择聚丙烯酰胺凝胶胶浓度为8％，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各18ml，分别加入50μl的temed及40μl的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，夏天室温凝固，冬天可放在37℃培养箱里凝固，若室温凝固，凝胶时间至少3h；

2.2待胶凝固完全之后，拔掉梳子，将整个板子安装在dgge支架上，将安装有板子的dgge支架放入电泳槽中，清洗胶孔，接通电源，待电泳液温度上升至60℃时，200v预电泳5min，用50微升微量进样器快速上样，pcr扩增产物上样量为45-50μl，于60℃、85v条件下电泳12h；

2.3电泳完毕后，将胶放入3×gelred染液中染色30min左右，拍照，dgge图谱如附图3所示；

2.4将8条特异性目的条带切下，放入无菌的ep管中，编号；

2.5用去离子水洗涤胶条，并将胶条弄碎成小段，加入30μl去离子水浸泡，4℃过夜；

2.6使用不含gc夹的引物再次进行pcr扩增，即第三次pcr扩增。得到的pcr产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用；

2.6.1pcr反应体系：

2.6.2pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34个循环，72℃10min，10℃forever，

2.6.3引物序列如下：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

3.ta克隆转化，上述纯化回收的dna片段的ta连接方法按北京全式金生物技术有限公司的cloningkit进行；

3.1克隆反应体系：pcr产物：0.5～4μl；cloningvector：1μl。轻轻混合，25℃反应10min，反应结束后，将pcr管置于冰上，将连接产物加入50μl的dh5α刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入250μl的lb培养基，200rpm、37℃培养1h。在此期间，取8μl的500mmiptg和40μl的20mg/mlx-gal混合，均匀地涂布在amp⁺抗性的lb固体平板上，使iptg和x-gal充分吸收。4000rpm离心菌液1min，弃掉部分上清，悬浮菌体，涂布在准备好的平板上，37℃恒温培养12h左右；

3.1.1使用的lb培养基配方(1l):胰蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取物5g，琼脂粉15g。使用的感受态细胞为dh5α；

3.2使用菌落pcr的方法鉴定阳性克隆；

3.2.1挑取白色单克隆菌落于amp⁺抗性的lb固体平板上备份菌种后，放入盛有10μl去离子水的ep管中，沸水浴煮样5min；

3.2.2取2μl沸水浴煮过的样液作模板进行pcr扩增，设阳性对照(以蓝色单克隆菌落为模板)及空白对照(以去离子水为模板)；

3.2.2.1pcr反应体系：

3.2.2.2pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，72℃10min，10℃forever，

3.2.2.3引物序列如下：

m13r：caggaaacagctatgacc

m13f：tgtaaaacgacggccagt

3.2.3pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶验证大小，片段大小在500-600bp之间的克隆子视为阳性克隆，pcr产物1.5％琼脂糖凝胶验证图谱如附图4所示。

4.提取阳性克隆子质粒，每个克隆片段选3个阳性克隆子的质粒送出测序，测序结果提交至ncbi，在线比对确定序列的菌属地位；

4.1挑取确定的阳性克隆接种于5ml的lb液体培养基(接种前加入5μl50mg/ml的amp)中，37℃，200rmp培养12～14h，用生工的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒，溶于50μl的去离子水中，-20℃保存备用，其中，提取质粒的0.7％琼脂糖凝胶验证图谱如附图5所示；

4.1.1使用的lb液体培养基配方(1l):胰蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取物5g。

4.2每个克隆片段选取3个阳性克隆子的质粒送至上海华大基因科技有限公司进行测序；

4.3测序结果提交至ncbi，在线比对确定序列的菌属地位；

5.再次进行dgge分析，验证条带在dgge胶片上的位置；

5.1酶标仪测提取质粒的浓度，用去离子水稀释质粒浓度至20ng/μl左右，以稀释质粒为模板进行pcr扩增，即第四次pcr扩增；

5.1.1pcr反应体系：

5.1.2pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34个循环，72℃10min，10℃forever，

5.1.3引物序列如下：

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r-a：ggattacaagatttcac；

0691r-g：ggattacaggatttcac。

5.2pcr扩增产物用于dgge上样分析，dgge电泳过程参照具体实施方案1中2.1、2.2、2.3进行，dgge图谱上条带电泳行为与模板条带电泳行为一致者则选作dnamarker的组成条带，验证的dgge图谱如附图6所示。

6.制作煤地质微生物pcr-dgge检测中古菌物种的dnamarker；

6.1以质粒为模板进行pcr扩增，各质粒模板量控制在16-21ng/μl范围内，扩增体系、条件、所用引物参照具体实施方案1中步骤5.1.1、5.1.2、5.1.3。

6.2取各质粒的pcr扩增产物20μl进行等体积混合，混合后的pcr产物于真空冷冻干燥机中进行浓缩，待pcr产物体积浓缩至30μl左右与6×dnaloadingbuffer以体积比5：1混合均匀，即获得dnamarker，制备好的dnamarker用于dgge上样分析，dgge电泳过程参照具体实施方案1中的步骤2.1、2.2、2.3，dgge图谱如附图7所示；

7.结合每条dnamarker条带所代表的菌属地位，对制备的pcr-dgge检测中dnamarker进行命名，本发明专利制备的dnamarker命名为cbmarc1。

实施例2

1.提取山西沁水盆地高阶煤层产出水样与云南昭通褐煤的前中期富集培养液中的基因组dna，选用2套引物进行pcr扩增，基因组提取及pcr扩增参照具体实施方案1中的1.1、1.2、1.3。

2.dgge分析：

2.1选择聚丙烯酰胺凝胶胶浓度为8％，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各18ml，分别加入50μl的temed及40μl的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，夏天室温凝固，冬天可放在37℃培养箱里凝固，若室温凝固，凝胶时间至少3h；

2.2待胶凝固完全之后，拔掉梳子，将整个板子安装在dgge支架上，将安装有板子的dgge支架放入电泳槽中，清洗胶孔，接通电源，待电泳液温度上升至60℃时，200v预电泳5min，用50微升微量进样器快速上样，上样样品为后期产出水富集培养样的古菌v3-v4区pcr扩增产物及具体实施方案1中制备的古菌dnamarker。产出水富集培养样的古菌v3-v4区pcr扩增产物上样量为45-50μl，古菌dnamarker上样量为30μl。于60℃、85v条件下电泳12h；

2.3电泳完毕后，将胶放入3×gelred染液中染色30min左右，拍照，dgge图谱如附图8所示；

2.4结果分析：如附图8中所示，本专利发明制备的dnamarker部分组成条带与样品所含的部分条带一一对应，初步认为样品中与marker对应的条带为marker组成条带相对应的菌属。即山西沁水盆地高阶煤层产出水样与云南昭通褐煤的前中期富集培养样液中古菌的菌群结构包含本专利发明制备marker所对应的部分菌属。

3.样品条带序列分析：

3.1将富集培养样品中与制备的古菌dnamarker位于同一位置的条带切下，放入无菌的ep管中，编号；

3.2用去离子水洗涤胶条，并将胶条弄碎成小段，加入30μl去离子水浸泡，4℃过夜；

3.3使用不含gc夹的引物再次进行pcr扩增，pcr扩增反应体系、条件及引物参照具体实施方案1中的2.6.1、2.6.2及2.6.3。得到的pcr产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化回收，回收的dna片段送至上海华大基因科技有限公司进行测序；

3.4测序结果提交至ncbi，在线比对确定序列的菌属地位，经比对分析与marker位于同一位置的条带所属菌属地位与对应的marker相同，且菌属相似性均大于97％。证明了山西沁水盆地高阶煤层产出水样与云南昭通褐煤的前中期富集培养样液中古菌的菌群结构包含了本专利发明制备marker所对应的部分菌属。即富集培养的前期样品中主要优势古菌菌属为methanocelleus。在富集培养的中期，主要优势古菌菌属为methanosarina与methanocelleus。

sequencelisting

<110>山西大学

<120>用于检测煤地质微生物古菌物种的dnamarker及制备方法和应用

<130>.

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>327

<212>dna

<213>methanobacterium

<400>1

ccctacggggcgcagcaggcgcgaaacctccgcaatgcgagcaatcgcgacggggggacc60

ccaagtgccactcttaacggggtggcttttcttaagtgtaaaaagcttttggaataaggg120

ctgggcaagaccggtgccagccgccgcggtaacaccggcagctctagtggtagccatttt180

tattgggcctaaagcgttcgtagccggtttgataagtctctggtgaaatcctatagctta240

actgtgggacttgctggagatactattagacttgaggtcgggagaggttagcggtactcc300

cagggtaggggtgaaatcctgtaatcc327

<210>2

<211>327

<212>dna

<213>methanosarcina

<400>2

ccctacggggcgcagcaggcgcgaaaactttacaatgcgggaaaccgtgataaggggaca60

ccgagtgccagcatcatatgctggctgtccggatgtgtaaaatacatccgttagcaaggg120

ccgggcaagaccggtgccagccgccgcggtaacaccggcggcccgagtggtgatcgtgat180

tattgggtctaaagggtccgtagccggtttggtcagtcctccgggaaatctgatagctta240

actattaggctttcgggggatactgccagacttggaaccgggagaggtaagaggtactac300

aggggtaggagtgaaatcttgtaatcc327

<210>3

<211>327

<212>dna

<213>methanosarina

<400>3

ggattacaagatttcactcctacccctgtagtacctcttacctctcccggttccaagtct60

ggcagtatcccccgaaagcctaatagttgagctatcagatttcccggaggactgaccaaa120

ccggctacggaccctttagacccaataatcacgatcaccactcgggccgccggtgttacc180

gcggcggctggcaccggtcttgcccggcccttgctaacggatgtattttacacatccgga240

cagccagcatatgatgctggcactcggtgtccccttatcacggtttcccgcattgtaaag300

ttttcgcgcctgctgcgccccgtaggg327

<210>4

<211>327

<212>dna

<213>methanosarcina

<400>4

ggattacaagatttcactcctacccctgtagtacctcttacctctcccggttccaagcct60

ggcagtatcccccgaaagcctaacagttaagctatcagatttcccggaggactgaccaaa120

ccggctacggaccctttagacccaataataacggtcaccactcgggccgccggtgttacc180

gcggcggctggcaccggtcttgcccggcccttgctaacagatgtagtttacacatctgga240

cagccagcatatgatgctggcactcggtgttcccttatcacggtttcccgcattgtaaag300

ttttcgcgcctgctgcgccccgtaggg327

<210>5

<211>323

<212>dna

<213>methanocelleus

<400>5

ccctacggggcgcagcaggcgcgaaaactttacaatgcgggcaaccgtgataagggaacc60

tcgagtgcctgtacatgcaggctgtctgggtgtctaaaacacacccaaagaaagggccgg120

gcaagaccggtgccagccgccgcggtaataccggcggctcgagtggtggccacttttatt180

gggcttaaagcgttcgtagctgggttgttaagtctcttgggaaatctgacggctcaaccg240

tcaggcgtctaagggatactggcaatcttggaaccgggagaggtgaggggtacttcgggg300

gtaggagtgaaatcctgtaatcc323

<210>6

<211>323

<212>dna

<213>methanospirillum

<400>6

ggattacaggatttcactcctaccccggcagtacctctcacctctcccggtccctagaaa60

tgcagtttcccctgaacgcccaccagttgagctggcggatttctcaagagacttgcatat120

caagctacggaccctttaagcccagtaatagtggccaccactcgagccgccggtattacc180

gcggcggctggcaccggtcttgcccggccctttcttcaccagttatttacactggcggac240

agccagcctgtgctggcactcggggtttccttatcacggttgcccgcatggtaaagtttt300

cgcgcctgctgcgccccgtaggg323

<210>7

<211>346

<212>dna

<213>methanomethylovorans

<400>7

ccctacggggcgcagcaggcgcgacggggcgcagcaggcgcgaaaactttacaatgcggg60

aaaccgcgataaggggacaccgagtgccagcatcctatgttggctgtccatatgtataaa120

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