专利名称：结小果实的四倍体西瓜的制作方法
技术领域：
本发明涉及西瓜育种领域，具体而言，涉及用于产生三倍体种子和植物的四倍体西瓜，所述三倍体种子和植物用于生产大小实质上小的无籽西瓜。
背景技术：
西瓜是重要的园艺作物，占世界蔬菜作物面积的2％。在1997年，全世界种植了6,024,000英亩西瓜，而美国种植了187,000英亩西瓜。亚洲是至今最重要的西瓜生产区，占世界面积的72％和世界产量的77％(FAO产量年鉴51，1998)。若使用1995-1997年美国的平均价格，则年世界西瓜价值估计超过76亿美元。1999年，在超过174,000英亩收获地上，美国西瓜作物超过4100万英担，而且农场价值超过2.66亿美元，占美国新鲜蔬菜工业收获地的9.2％、产量的10.0％、和价值的3.5％(USDA农业统计2001)。因为加利福尼亚州种植了高比例的三倍体无籽西瓜，所以加利福尼亚州是西瓜农场通口值的主要州，2000年超过7200万美元。在市场上，无籽西瓜的售价远远高于有籽西瓜的平均价格。三倍体无籽西瓜的产量也高于二倍体有籽西瓜。
三倍体无籽西瓜是真正的F1杂种，以四倍体西瓜作为雌性亲本，以二倍体西瓜作为雄性亲本(Kihara，H，1951，Triploid Watermelons(三倍体西瓜)，Proceedings of American Society forHorticultural Science，58217-230)。常规的西瓜即有籽二倍体西瓜在它们的体细胞中具有22条染色体(2N＝2X＝22)。四倍体西瓜在它们的体细胞中具有44条染色体(2N＝4X＝44)。当四倍体植物的雌花接受正常二倍体植物的雄花的异花授粉时，四倍体植物的果实中结出的种子是三倍体种子。三倍体种子产生三倍体植物。在将三倍体植物与正常二倍体植物一起种植在同一块地里时，三倍体植物结的果实是无籽的。三倍体西瓜中的无籽状况是因为每个体细胞中存在三套同源染色体而非通常的两套。具有三套同源染色体的细胞称为三倍体，并以3X表示。三倍体无籽西瓜在它们的体细胞中具有33条染色体(2N＝3X＝33)。三倍体合子不能生成能存活的正常配子(花粉和卵细胞)，因此三倍体果实不结籽。通常，无籽西瓜含有小型可食用白色胚珠，与未成熟黄瓜中的相似。
自1980年代晚期，三倍体无籽西瓜就已经在美国进行商业种植。自其商业引进后，无籽西瓜在美国的普及得到了扩大。2001年加利福尼亚州生产的大部分西瓜是三倍体无籽西瓜。三倍体品种的产量高于二倍体有籽品种，因为每株结果数更多且收获期更长。三倍体无籽西瓜获得了溢价，因为果肉品质高且确实无籽。
本发明满足了在维持高标准的果实滋味和质地的同时结无籽小果实的三倍体西瓜的需要。然而，果实的尺寸减小后，果皮的比例增大了，为可食用果肉只剩下很少空间。因此，培育结无籽小果实但果肉含量高的西瓜也是本发明的一个目标。本发明还解决了对四倍体西瓜植物的需要，它可以用作生产这些无籽小果实的三倍体西瓜的亲本。
发明概述因此，本发明提供了新的且独特的四倍体西瓜。本发明的四倍体西瓜优选是四倍体自交系，特别适于作为三倍体杂种西瓜的亲本。本发明的四倍体西瓜结小果实，且果皮很薄。本发明四倍体西瓜的果实优选具有高含量的可溶性固体。重要的是，本发明的四倍体西瓜能够在与二倍体西瓜杂交后将这些期望特征遗传给它们的三倍体后代。因此，本发明还公开了结小果实的三倍体西瓜，果实实质上无籽且果皮很薄。这些无籽西瓜果实具有下面的优点，即与同等大小的西瓜相比，具有更多的可食用果肉，且味道和质地(texture)卓越，因此对消费者特别有吸引力。
在一个优选实施方案中，本发明的四倍体西瓜所结果实重量为大约1.5kg至大约2.5kg，优选大约1.5kg至大约2kg，优选大约2kg。在另一个优选实施方案中，本发明的四倍体西瓜果皮厚度为大约4mm至大约10mm，优选大约4mm至大约7mm。在另一个优选实施方案中，本发明的四倍体西瓜具有卓越的座果。在另一个优选实施方案中，本发明的四倍体西瓜具有高含糖量。在另一个优选实施方案中，依照本发明的四倍体西瓜植物所结种子重量为大约20g至大约35g每1000粒，优选大约23g至大约33g每1000粒，优选大约31g每1000粒，在另一个优选实施方案中是大约25g每1000粒。在另一个优选实施方案中，依照本发明的四倍体西瓜植物每个果实结籽可达大约150粒，优选每个果实结籽大约50粒至大约150粒，优选每个果实结籽大约70粒至大约150粒，更优选每个果实结籽大约80粒至大约150粒。在另一个优选实施方案中，所述植物每株结果大约3-4个。在另一个优选实施方案中，所述植物的果实含有大约12％至大约14％的可溶性固体，优选大约13％。在另一个优选实施方案中，所述植物的果实在开花后大约24天至大约27天成熟。
在另一个优选实施方案中，本发明的四倍体西瓜包括一项或多项以下特征a)所结果实显著小于常规四倍体的果实，大约是常规四倍体大小的1/3，b)展示异常优越的座果能力，c)在温室设置中每株植物结果3-4个，d)按照由开花至果实成熟来测量，比常规四倍体早成熟7-10天，e)种子大小比常规四倍体的种子小得多，f)果皮是常规四倍体的大约1/2至1/3，g)种子产量显著优于由相同技术产生的大多数四倍体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及称为90-4194且包括上述特征的新的且独特的自交四倍体西瓜系。
在另一个优选实施方案中，在将本发明的四倍体西瓜作为亲本用于产生三倍体西瓜时，所述三倍体西瓜结无籽小果实，且果皮很薄。优选的是，无籽果实的重量为大约2kg至大约3kg。在另一个优选实施方案中，无籽果实的果皮厚度为大约4mm至大约13mm，优选大约7mm至大约11mm。
在另一个优选实施方案中，在将本发明的四倍体西瓜作为亲本用于产生三倍体西瓜时，所述三倍体西瓜包括一项或多项以下特征a)果实尺寸小，b)每株植物结果更多，c)果实含糖量更高，d)果皮薄，通常是常规三倍体厚度的1/2或1/3，e)三倍体果实比当前可获得的三倍体无籽西瓜果实早成熟大约7-10天，f)与当前可获得的三倍体无籽西瓜果实相比，本发明的三倍体更能耐受空心(hollow heart)，g)座果能力卓越，h)可溶性固体的含量超过大约11％，优选大约11％至大约13％。
本发明还包括本发明四倍体西瓜系的种子。本发明还包括本发明四倍体西瓜的花粉、胚珠、果实，以及使用本发明四倍体西瓜系产生杂种三倍体西瓜种子的方法。本发明还包括通过本发明的四倍体西瓜系与二倍体西瓜系的杂交产生的三倍体杂种西瓜种子，以及由这些种子获得的植物，包括它们的果实。
本发明还包括生产具有本发明四倍体西瓜系的所有遗传性状(genetics)的种子的方法、使用本发明四倍体西瓜系培育新的自交四倍体系的方法、以及使用二倍体西瓜系产生四倍体西瓜系的方法。
本发明还提供了通过本发明的四倍体西瓜植物与二倍体西瓜植物的杂交产生三倍体杂种西瓜种子的方法。优选的是，所述四倍体植物是雌性亲本。优选的是，所述二倍体植物是雄性亲本。
通过上述方法产生的三倍体杂种西瓜种子。
本发明还提供了生产三倍体杂种西瓜种子的方法，包括以下步骤a)在授粉距离内种植依照本发明的四倍体西瓜植物的种子和二倍体西瓜植物的种子；b)在种植所述四倍体西瓜植物的种子之前7-10天种植所述二倍体西瓜植物的种子；c)栽培由所述种子产生的西瓜植物直至所述植物开出第二朵雌花；d)就在所述雌花开放那天之前的下午覆盖所述四倍体西瓜植物的雌花；e)在所述雌花开放那天的早晨收集所述二倍体西瓜植物的雄花；f)用步骤e)中收集的所述雄花给所述雌花授粉；并g)收获由在步骤f)中授粉的所述雌花产生的种子。
本发明还提供了生产三倍体西瓜种子的方法，包括以下步骤a)在田地里种植依照本发明的四倍体西瓜植物的种子和二倍体西瓜植物的种子，种植模式是两行四倍体西瓜植物对一行二倍体西瓜植物；b)将所述四倍体西瓜植物剪成每株大约2-3个分枝；c)将所述四倍体西瓜植物上的几乎所有雄花和雄花蕾去雄；d)允许用所述二倍体西瓜植物的花粉给所述四倍体西瓜植物的雌花授粉；e)标记去雄阶段授粉的雌花；并f)由四倍体西瓜植物的标记果实收获种子。
本发明还提供了生产四倍体西瓜种子的方法，包括a)种植依照本发明的四倍体西瓜植物；b)容许所述四倍体西瓜植物的自花授粉；c)由步骤b)的植物获得果实；d)由所述果实取出四倍体西瓜种子。
优选的是，该方法还包括清洗并干燥所述种子。
本发明还提供了在西瓜植物育种计划中使用植物育种技术培育四倍体西瓜系的方法，它包括采用西瓜植物或其部分作为植物育种材料的来源，包括获得本发明西瓜植物或其部分作为育种材料的来源。
本发明还提供了产生四倍体西瓜植物的方法，包括a)获得结薄皮小果实的二倍体西瓜系；b)对所述二倍体西瓜系的植物进行四倍体转变以生成四倍体西瓜植物；c)选择步骤b)中得到的四倍体西瓜植物，其中所述四倍体西瓜植物所结果实重量为大约1.5kg至大约2.5kg且果皮厚度为大约4mm至大约10mm。
在一个优选实施方案中，四倍体西瓜所结果实重量为大约1.5kg至大约2.5kg，优选大约2kg。在另一个优选实施方案中，本发明四倍体西瓜的果皮厚度为大约4mm至大约7mm。在另一个优选实施方案中，四倍体西瓜系所结种子重量为大约20g至大约35g每1000粒。在另一个优选实施方案中，四倍体西瓜系每个果实结籽可达大约150粒种子，优选每个果实结籽大约50粒至大约150粒，优选每个果实结籽大约70粒至大约150粒，更优选每个果实结籽大约80粒至大约150粒。在另一个优选实施方案中，四倍体西瓜系每株植物结果大约3-4个。在另一个优选实施方案中，所述四倍体西瓜系的果实含有大约12％至大约14％的可溶性固体。在另一个优选实施方案中，所述四倍体西瓜系的果实在开花后大约24天至大约27天成熟。在另一个优选实施方案中，四倍体西瓜系包括本文公开的一项或多项特征。
在另一个优选实施方案中，所述二倍体西瓜系是二倍体自交西瓜系，优选二倍体自交西瓜系HD或具有二倍体自交西瓜系HD的特征的二倍体自交西瓜系。在另一个优选实施方案中，使用oryzalin方案将二倍体系转变成四倍体系。
在另一个优选实施方案中，该方法还包括使上文步骤c)中选择的四倍体西瓜植物自花授粉。在另一个优选实施方案中，该方法还包括使上文步骤c)中选择的四倍体西瓜植物自花授粉直至在后代中没有观察到变异。
本发明还提供了通过上文刚公开的方法可获得的四倍体西瓜系，包括所述四倍体西瓜系的花粉、胚珠、果实。
发明详述在三倍体西瓜种子的商业生产中，在同一块田地里种植四倍体和二倍体亲本系。通过人工或蜜蜂授粉来实现四倍体系即雌性亲本系与二倍体系即雄性亲本系之间的异花授粉。只有由二倍体植物的花粉受精的四倍体植物的西瓜才生成三倍体西瓜种子。所有商业种植的有籽西瓜都是二倍体；因此，有许多二倍体系可以用作二倍体亲本。培育无籽西瓜品种的主要限制在于获得有用的四倍体亲本系。一般而言，难以根据二倍体的特征来预测四倍体的性能。好的二倍体西瓜并非必然生成好的四倍体。此外，具有好的园艺特性的四倍体并非必然生成好的三倍体西瓜杂种。
通过常规二倍体西瓜系染色体的倍增来培育四倍体西瓜系。最初使用有毒生物碱秋水仙素来实现染色体倍增，即将秋水仙素施加于新出苗的西瓜幼苗的生长点。还开发了组织培养法(Zhang，X.P.、B.B.Rhodes、H.T.Skorupska、W.C.Bridges，1995，GeneratingTetraploid Watermelon Using Colchicine in Vitro(在体外使用秋水仙素生成四倍体西瓜)，G.Lester和J.Dunlap等人编，Cucurbitaceae′94134-139)。二硝基苯胺已经用于染色体数目的倍增，而且它们的效力先前已经与西瓜以外的作物进行了比较。Li等人(Li，Ying、J.F.Whitesides、B.Rhodes，1999，In vitro generationof tetraploid watermelon with two different dinitroanilines andcolchicines(使用两种不同的二硝基苯胺和秋水仙素在体外生成四倍体西瓜)，Cucurbit Genetics Cooperative Rpt2238-40)比较了使用秋水仙素与二硝基苯胺、ethalfluralin(N-乙基-N-2-甲基-2-丙烯基-2，6-二硝基-4-(三氟甲基)benzanine)、和oryzalin(3，5-二硝基-N4，N4-二丙基磺胺)的体外染色体倍增效率，并得出结论，ethalfluralin或oryzalin优于秋水仙素。
几种处理方法被用于使用上述化学药品由二倍体诱导四倍体。一种方法是在播种前处理种子。将种子在清水中浸泡5-6小时，然后将种子在秋水仙素溶液(0.2％)或二硝基苯胺(如35μM oryzalin)中浸泡24小时。播种前简单漂洗种子。也可以将干燥的种子直接浸泡在化学药品溶液中，无需在水中预先浸泡。这种操作简单易行，而且在种子供应不受限制时是一种好方法。这种处理通常降低萌芽和出苗(emergence)。第二种方法是处理新出现的幼苗。将二倍体自交系播种于温室的苗地。为了快速且统一的萌芽，将土壤温度保持于29-31℃。一旦幼苗出土，立即将一滴秋水仙素(0.1％)或二硝基苯胺(如35μM oryzalin)溶液施加于子叶之间的苗端。连续三天在上午或傍晚将秋水仙素溶液施加于生长点。我们由一次施用oryzalin得到了良好的染色体倍增。另一种方法是在将萌芽种子种植到土壤中之前处理萌芽种子的苗端。种子在温箱中于30℃萌芽。当根大约2cm长时，在30℃温箱中，将萌芽种子下胚轴以上部分颠倒，在秋水仙素(0.1％)或二硝基苯胺(35μM oryzalin)溶液中浸泡10-15小时。这种处理应当在高湿度的房间或箱子中进行，以确保根不会变干。然后清洗种子，并种植到土壤中。后两种方法虽然更加冗长但是通常得到更高的四倍体回收率，因为根系不受处理的影响。
下一步是由个体转变事件培育四倍体系。将根据形态学表现选择的四倍体个体自花授粉，并作为系在下一代种植由此产生的种子。将这些系再次自花授粉，并比较生殖和园艺特性。若在这些系之间存在差异，则只选择期望的系。若在系内和所选系之间没有变异，则可以混合收获期望系。可以在分离块中进一步增加种子。可以在分离地里及其后对这种增加进行混合选择。可以在后续代中改进四倍体的生育力。
通过组织培养来繁殖四倍体西瓜植物还例示于Adelberg，J.W.、B.B.Rhodes，Micropropagation form zygotic tissue of watermelon(西瓜合子组织的微繁殖)，C.E.Thomas编，Proc.of theCucurbitaceae，89Evaluation and enhancement of cucurbitgermplasm，Charleston S.C.，美国；和Zhang等人，Shootregeneration from immature cotyledon of watermelon(由西瓜未成熟子叶再生芽)，Cucurbit Genetics Coop.17111-115，1994。
在两种不同四倍体之间杂交，然后经历重组育种，也能生成新的四倍体系。使用这种方法培育稳定的四倍体系需要较长育种时间。这是因为四倍体产生更多的组合和更少的种子。但是，一些育种员通过这种方法获得了良好进展。
由于同源四倍体中的减数分裂有时是不规则的，因此在它们的后代中确实存在二倍体和非整倍体。四倍体的叶、花、和花粉粒在形态上与二倍体不同(Zhang，X.P.、B.B.Rhodes、H.T.Skorupska、W.C.Bridges，1995，Generating Tetraploid Watermelon UsingColchicine in Vitro(在体外使用秋水仙素生成四倍体西瓜)，G.Lester和J.Dunlap等人编，Cucurbitaceae′94134-139)。四倍体在保卫细胞中还具有不同数目的叶绿体(Compton，M.E.、D.J.Gray、和G.W.Elmstrom，1996，Identification of tetraploidregenerants from cotyledons of diploid watermelon cultures invitro(二倍体西瓜子叶的体外培养物的四倍体再生体的鉴定)，Euphytica，87165-172)。这些形态学特性有助于育种员清除有性繁殖过程中四倍体种群中存在的二倍体和非整倍体。
三倍体种子目前通过两种方法生成，蜜蜂授粉法和人工授粉法。在美国，使用蜜蜂授粉法来生成三倍体西瓜种子。几乎所有的美国三倍体西瓜种子生产都位于北加利福尼亚。生产地里的种植比例通常是2行四倍体雌系对1行二倍体雄系。手工摘除雌性四倍体植物上的所有雄花蕾。该过程称为去蕾(de-dudding)。让雌花由蜜蜂露天授粉。标记去蕾过程中的座果，并用于收获三倍体杂种种子。在整个授粉季节里手工摘除四倍体雌藤上的雄蕾。若能获得雄性不育的四倍体系，则工人只需要少得多的时间和努力就能够容易地清除四倍体雌性行中的雄性能育植物。雄性不育四倍体植物的所有座果都能收获杂种三倍体种子。在使用已标记的雄性不育系统时，种子生产者能够确保雌性四倍体系和杂种三倍体种子中不存在雌性不正常类型(Zhang，X.P.和B.B.Rhodes，2000，Method using male sterility and a marker toproduce hybrid seeds and plants(使用雄性不育性和标记生成杂种种子和植物的方法)；美国专利6,018,101)。
人工授粉主要用于在不能进行隔离且在同一地块里生产了几种三倍体杂种的地区生产三倍体西瓜种子。在自交雌性四倍体亲本系之前7-10天播种自交雄性亲本系。雄性亲本通常位于杂交区的外部。对于每株雄性植物相应种植大约4至10株四倍体雌性植物以确保足够授粉。在收集雄花前仔细检查雄性亲本的均一性。清除可以根据植物形态和子房特征辨认的任何异类。当四倍体雌性亲本的第二朵雌花即将开花时开始授粉。辨认四倍体雌性亲本系的雌花蕾，并在第二天上午开花前覆盖纸杯或小纸袋。在蜜蜂或其它授粉昆虫光顾花之前在清晨收集二倍体雄性亲本系的雄花。然后揭开覆盖的雌花蕾，并用收集的新鲜雄花授粉。然后将已授粉的雌花再次覆盖并标记。定期摘除雌性亲本植物上的露天授粉果实以确保人工授粉果实的发育。授粉后由地里清除雄性植物以确保只收获雌性亲本的果实。
本发明四倍体系的培育在二倍体西瓜系转变成四倍体系时经常观察到的问题是四倍体系的生育率显著降低。这导致座果低，而且常常与座果晚和果实成熟晚有关。因此，四倍体西瓜的种子生产是低效且昂贵的，而且四倍体西瓜通常不是三倍体杂种种子生产的好亲本。因此，本发明的一个目标是生成克服这些生育力问题同时具有本申请公开的有利特征且能够将这些特征完全或至少部分遗传给它们的三倍体后代的四倍体西瓜。
二倍体自交西瓜系HD，作为亲本系用于生产二倍体有籽西瓜杂种的专有Syngenta系，经鉴定是有希望的四倍体转变候选者。二倍体系HD结实薄皮有籽小果实，而且座果卓越。此外，二倍体系HD所结果实含糖量高且果肉结实。对二倍体西瓜系HD进行了四倍体转变。
在北加利福尼亚通过将二倍体自交系HD转变成四倍体西瓜而培育了自交系90-4194。由二倍体(2X)至四倍体(4X)的转变是使用oryzalin方案实现的，包括以下步骤1999年11月，在温室中将HD的种子播种在50孔塑料苗盘中。对每一个新出苗的幼苗，将一滴35μM oryzalin施加于2个子叶之间的分生组织尖端。播种后大约10天完成对所有幼苗的oryzalin处理。
对幼苗定期浇水和施肥。
1999年12月末，在温室中将假定的四倍体移植到装满Pro-Mix BX无土土壤的2加仑罐中。在植物发育过程中，根据叶的形态和雄花特征清除二倍体(未转变)植物和分枝。
下面是四倍体西瓜系例如自交系90-4194培养的时间顺序世代季节/年度描述T02000年春在幼苗移植期，将72个假定四倍体移植到温室中2加仑罐中。根据叶的形态和雄花特征辨认并清除未转变的植物和分枝。鉴定了大约20个四倍体，而且只对真四倍体植物/分枝上的雌花进行自花授粉。在果实完全成熟时，收获果顶痕(blossomend scars)较大(是其二倍体版本的2-3倍)的果实，并根据每个果实种子数来检查生育力。进行四个个体选择4XHD-1、-2、-3、和-4和一个混合选择4XHD-B以种植T1代。
T12000年夏 在温室中种植4XHD-1和4XHD-2以进行进一步选择和增加种子。在田地里种植4XHD-3和4XHD-4以进行田间观察和增加种子。在田地里的杂交块中种植4XHD-B以生产三倍体杂种。在幼苗阶段4XHD-2不如4XHD-1好，因而丢弃。将42株4XHD-1植物在温室中种植至成熟。混合收获4XHD-1的所有种子，并标记为4XHD-1-B，因为在这个系中没有观察到变异。在4XHD-3和4XHD-4之内和之间没有观察到变异。因此同样混合收获种子，并标记为4XHD-3/4。
2000年秋 在佛罗里达州评估由4XHD-B衍生的五个三倍体杂种。三个杂种是独特且有希望的三倍体杂种。
T22001年春 为了世代前进和增加种子，在塑料温室中种植大约700株4XHD-1-B。进行人工授粉。没有观察到变异。所有果实都是均一且典型的。混合收获种子并命名为90-4194。
T32001年夏 为了增加原种(stock seed)将大约3500株90-494植物移植到一英亩隔离小区里，使用蜜蜂授粉。为了增加基础种籽(foundation seed)将1200株90-4194移植到2个覆网笼中，使用人工授粉。田地里和笼中的种植物都没有观察到变异。育种过程完成，并将收获的种子用作基础种籽(foundation seed)和原种。
下面描述了本发明四倍体西瓜系例如自交系90-4194的独特特征。下文所示数值来自在北加利福尼亚在夏季条件下生长的植物。当植物在实质不同的条件下生长时可能观察到变异。
本发明的四倍体西瓜系是很早成熟的四倍体西瓜。例如，在北加利福尼亚在夏季条件下90-4194的果实在开花后24-27天成熟。其它商品化四倍体在相同条件下需要至少35天。
本发明四倍体西瓜系的果实很小，大约1.5kg至大约2.5kg，优选大约1.5kg至大约2kg，优选大约2kg，只有商业使用的四倍体的大小的大约1/4至1/3。果形是圆形，而果皮颜色是浅绿色，带绿色铅笔线痕。果肉坚实且红色，折光计％可溶性固体(主要是糖)为大约12％至大约14％，优选大约13％。
本发明四倍体西瓜系的种子较小，优选大约20g至大约35g每1000粒种子，优选大约23g至大约33g每1000粒，优选大约31g每1000粒，在另一个优选实施方案中是大约25g每1000粒种子，是商业使用的四倍体的重量的大约1/2至1/3。
本发明的四倍体系具有良好的种子产量。当四倍体系自花授粉时，或者用二倍体雄性亲本给四倍体系授粉以生成三倍体种子时，种子产量高。在一个优选实施方案中，本发明的四倍体系每个果实结籽可达大约150粒种子，优选每个果实结籽大约50粒至大约150粒，优选每个果实结籽大约70粒至大约150粒，更优选每个果实结籽大约80粒至大约150粒种子。在另一个优选实施方案中，本发明的四倍体系平均每个果实结籽大约80粒种子。种子颜色是中等褐色。
果皮很薄，大约4mm至大约10mm，优选大约4mm至大约7mm，是商业使用的四倍体的厚度的大约1/2至1/3。这种薄皮在相对湿度波动大的干燥条件下易于破裂。
本发明的四倍体系在恶劣的环境条件下具有卓越的座果能力。2001年早春在Syngenta的Woodland研究站在塑料温室中(不提供补充光照)种植90-4194与其它23种二倍体和1种四倍体育种系时，它是正常座果的唯一西瓜系。大多数西瓜系由于恶劣的生长条件毫无结果。
本发明的四倍体系的每个植物能够结多个果实。例如，一株90-4194能够结果多达4个。本发明的四倍体系还能够在较长时间里结果。例如，2001年夏天在北加利福尼亚增加原种的过程中90-4194的一次种植带来了两次收获。收获第一次座果后，90-4194产生第二次座果，且种子产量卓越。
由本发明四倍体系生成的三倍体杂种的果实大小为大约3kg或更小，优选大约2.5kg或更小。所有传统三倍体杂种的果实大得多，大多超过6kg。优选的是，三倍体杂种的果实还包括以下特征之一果实个小，每株植物结果更多(优选每株结果3-4个)，含糖量更高，果皮薄(无籽果实的果皮是大约4mm至大约13mm，优选大约7mm至大约11mm)，通常是常规三倍体厚度的1/2或1/3，三倍体果实比常规三倍体无籽西瓜果实早成熟大约7-10天，由本发明培育的三倍体更能耐受空心病，座果能力卓越，可溶性固体的含量超过大约11％，优选大约11％至大约13％。
可以通过无性繁殖和有性繁殖来繁殖本发明的四倍体西瓜自交系。优选可以通过茎枝繁殖(shoot proliferation)然后在组织培养中生根来进行无性繁殖。详细方法描述于Zhang，X.P.、B.B.Rhodes、H.T.Skorupska、W.C.Bridges，1995，Generating TetraploidWatermelon Using Colchicine in Vitro(在体外使用秋水仙素生成四倍体西瓜)，G.Lester和J.Dunlap等人编，Cucurbitaceae′94134-139。这种方法简单描述如下A)由温室、田间、或实验室生长的90-4194植物收集茎尖和腋芽。将茎尖和腋芽在自来水下冲洗30分钟至1小时。将茎尖和腋芽在10％家用漂白液中消毒8-10分钟。将茎尖和腋芽在无菌蒸馏水中漂洗三次。B)为了茎枝繁殖在含10μMBA的Murashige和Skoog(MS)培养基上培养茎尖和腋芽。每3-4周进行继代培养。C)让繁殖芽在含5-10μM IBA的MS培养基上生根大约2周。D)在温度和湿度受控温室中让生根小植物进行适应。E)在隔离小区里种植微繁殖植物并由这些植物收获种子。
四倍体西瓜通常是通过种子有性繁殖的。我们在温室里、在覆网笼中、和在露地里成功繁殖了自交系90-4194。若在露地里进行种子增加，则种子增加田地应当与任何其它西瓜隔离至少1.5km。应当进行严格的害虫管理和栽培实践。较高(比用于商品化杂种果实生产的高20-30％)水平的磷酸盐和钾肥对于生产产量高且品质好的种子是有益的。为了将因果实破裂而引起的果实损失降至最低，给低钙地补充钙。将蜂箱置于种子生产地里以确保足够授粉，这是种子生产的关键生物学事件。优选在果实破裂和变质前收获果实。然后在由果实获取种子前将收获的果实于室温保存一段时间，使得果实中的胚进一步发育、种子进一步成熟。由果肉获取种子后，彻底清洗种子，并使用强迫通风干燥器迅速干燥，从而最好地维持种子存活力。
四倍体西瓜的主要用途是生产结无籽果实的三倍体杂种西瓜的种子和植物。将四倍体系作为雌性亲本与作为雄性亲本系的二倍体西瓜系进行杂交。期望三倍体杂种的生成大大依赖四倍体亲本的性能(尤其是种子的生产力)和配合力。本发明的四倍体西瓜自交系例如90-4194系是用于生成具有卓越果实质量、小型果实(单个大小的范围为2-3kg)、成熟早、和卓越座果能力的三倍体无籽西瓜杂种的新四倍体系。
优选根据小的果实大小来选选择二倍体雄性亲本，理想的是小于8磅，优选小于6磅。另外，由二倍体雄性亲本选择对三倍体西瓜期望的果皮颜色和条纹样式，因为本发明四倍体的果皮颜色和条纹样式(无)对于所有其它果皮颜色和条纹样式而言是隐性的。还对二倍体雄性亲本选择它们的小的种子大小以减小三倍体果实中白籽胚珠的大小。
大多数四倍体在温室中生长时非常难以或未能生成三倍体种子。但是，自交系90-4194在温室中产生三倍体种子且种子产量较高。自交系90-4194在田间也产生三倍体种子。本发明的四倍体西瓜系在生产三倍体杂种中也具有很好的配合力。例如，通过有限的调查，通过自交系90-4194与不同二倍体雄性系的杂交生成了5个期望三倍体杂种。
一旦确定了适当的组合，几种方法可用于由本发明的四倍体自交系生成三倍体种子。以90-4194系作为实例，本文描述了两种常用的方法。可以根据实际的生产情况对这些方法进行改变。
人工授粉法。这是最常用的方法，用于由90-4194生成三倍体种子。将自交四倍体雌性亲本90-4194和自交二倍体雄性亲本系种植在同一块地里。比雌性亲本90-4194早7-10天种植自交雄性亲本以确保授粉时的足够花粉供应。雄性亲本与雌性亲本90-4194的种植比例是1株雄性亲本对4-10株雌性亲本。为了授粉过程中的高效雄花收集，可以在地的顶端种植二倍体雄性亲本。当四倍体雌性亲本90-4194的第二朵雌花即将开花时开始授粉。辨认第二天即将开花的雌花蕾，覆盖纸杯或小纸袋以预防蜜蜂或任何其它昆虫光顾雌花，并标记第二天上午能够容易看见的任何种类的材料。该过程最好在下午进行。在它们开花和被授粉昆虫光顾前，在清晨收集二倍体雄性亲本的雄花。揭开四倍体雌性亲本上覆盖的已经开放的雌花，并用收集的二倍体雄性亲本的新鲜雄花授粉，一旦雄花散发花粉就开始。授粉后将已授粉的雌花再次覆盖以预防蜜蜂和任何其它昆虫的光顾。已授粉的雌花同样标记。只收获标记的果实用于获取三倍体杂种种子。
蜜蜂授粉法。在使用蜜蜂授粉法时，四倍体雌性亲本90-4194与二倍体雄性亲本的种植比例通常是2行四倍体亲本对1行雄性亲本。将雌性四倍体植物修剪成2-3个分枝。在授粉季节每天手工摘除雌性四倍体亲本植物上的所有雄花蕾(去蕾过程)。将蜂箱置于地里，通过蜜蜂将花粉由雄性亲本转移至雌性亲本的雌花。标记此去蕾时期的座果。只收获标记的果实用于获取杂种三倍体种子。
在它们成熟后自交系90-4194的果实易于破裂，因为它的果皮极薄。在湿度波动显著的条件下进行种子生产时这会是严重的问题。因此，就在破裂前收获果实，并在阴暗处或藤下保存2-3周。由藤上摘下果实时果皮变得牢固，而且收获果实中的胚继续发育，导致种子质量更好。
依照本发明，以四倍体自交系作为亲本系用于培育新的四倍体系。本发明四倍体西瓜系例如90-4194系的独特期望特性使之作为新四倍体自交系培育中的亲本系同样非常有用。这种系可以作为雌性或雄性亲本用于杂交另一种自交或杂种四倍体以培育新的四倍体自交系。
实施例实施例1四倍体自交系90-4194的描述果实 圆形，小适种区 大部分地区花的出现 比商品化四倍体品种90-4231早5天授粉至成熟 比商品化四倍体品种90-4231早7天倍性 四倍体子叶 扁平性别 雌雄同株主茎数目 冠处3个第一次座果的花数 18朵雄蕊，4朵雌蕊茎 圆形，有柔毛，第二个节处直径7mm
节间长 7cm第一次座果的花 雄蕊对径3cm，雌蕊对径3cm，黄色成熟果实大小圆形，长15cm，中部直径15cm，平均重量2kg，光滑，果皮浅绿色，带铅笔线痕，有斑点/网纹果皮脆，果顶厚4mm，侧面厚7mm果肉脆，纤细，带少许纤维，中等红色，13％可溶性果汁固体，无空心、胎座分离、或横向破裂种子长7mm，宽5mm，厚2mm，指数(长度÷宽度×10)为14，31g每1000粒种子，每个果实80粒种子，深褐色晒伤抵抗相反，商品化四倍体系90-4231果实重量为大约6-7kg，并有一些空心、胎座分离、和横向破裂。
总而言之，本发明的自交四倍体西瓜系90-4194的独特性包括a)四倍体90-4194所结果实显著小于常规四倍体的果实，大约是常规四倍体大小的1/3；b)四倍体90-4194展示异常优越的座果能力。在洪都拉斯，四倍体90-4194能够由一次种植收获三次(由四倍体植物收获三倍体种子)，而常规四倍体植物只有一次这样的收获。同样，在加利福尼亚州、秘鲁、和智利，本发明的90-4194由一次种植收获两次。c)四倍体90-4194在温室环境中每株植物结果3-4个，而常规四倍体通常每株结果平均少于1个。d)按照由开花至果实成熟测量，四倍体90-4194比常规四倍体早成熟7-10天。e)本发明90-4194的四倍体种子比常规四倍体的种子小得多。12-17粒常规四倍体西瓜种子达到1g。相反，35-39粒本发明90-4194的种子才有1g。f)90-4194的果皮是常规四倍体的大约1/2至1/3。g)90-4194四倍体植物的种子产量显著优于由相同技术产生的大多数四倍体。在由二倍体雄性亲本授粉时，90-4194每个果实结籽可达150粒三倍体种子。在由二倍体雄性亲本授粉时，目前培育的大多数四倍体西瓜通常每个果实结籽大约10-75粒三倍体种子。
实施例2三倍体西瓜果实由本发明四倍体植物产生的三倍体种子长出的三倍体西瓜果实展示商业上重要且新颖的特点。
例如，与常规无籽西瓜相比，由依照本发明的90-4194产生的三倍体的独特性包括a)果实尺寸小，b)每株植物结果更多，c)含糖量更高(SSC)(见下文表1)，d)果皮薄，通常是常规三倍体厚度的1/2或1/3，e)三倍体果实比常规三倍体无籽西瓜果实早成熟大约7-10天，f)由本发明四倍体90-4194培育的三倍体更能耐受空心，这是三倍体无籽西瓜的常见缺陷。在三倍体无籽西瓜RWT 8123和RWT 8124上没有观察到空心。RWT 8123和RWT 8124是由四倍体90-4194产生的三倍体。和g)座果能力卓越。
表1显示了平均重量(平均重量)、每株植物结果数、和果肉中可溶性固体(主要是糖)含量(SSC％)。Tri-X-313是标准大小的商品化三倍体无籽西瓜，它使用常规四倍体西瓜作为雌性亲本。RWT 8123和RWT 8124是使用本发明的四倍体90-4194西瓜作为雌性亲本的三倍体无籽西瓜。根据它们显著不同的表型选择Tri-X-313、RWT 8123、和RWT 8124系的雄性二倍体亲本。
表1
下文表2显示了RWT 8124(见上文)的果实比常规三倍体西瓜小得多，而且RWT 8124的座果(以每株植物结果数表示)比商品化无籽西瓜高得多。
表2
依照本发明的方法，优选根据小的果实大小来选择二倍体雄性亲本，理想的是小于8磅。另外，由二倍体雄性亲本选择对三倍体西瓜期望的果皮颜色和条纹样式，因为90-4194的果皮颜色和条纹样式(无)对于所有其它果皮颜色和条纹样式而言是隐性的。还对二倍体雄性亲本选择它们的小的种子大小以减小三倍体果实中白籽胚珠的大小。
虽然本文已经较为详细的描述了前述发明，但是显然可以在仅由所附权利要求限定的发明范围内进行改变和修改。
保藏申请人在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，Virginia，20110-2209，美国)进行了至少2500粒二倍体自交西瓜系HD[HD(2X90-4194)]种子的保藏，ATCC保藏号是PTA-5146。二倍体自交西瓜系HD的该保藏物将在公共的保藏单位ATCC保藏中心维持30年或者最近请求后5年或者专利有效期，以时间较长者为准，并且在保藏期间若它变得不能存活则会进行替换。此外，申请人已经满足了37 C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供了样品的存活证明。申请人不对由ATCC获得保藏材料施加限制；但是，申请人没有权利免除法律对生物学材料转移或其商业运输施加的任何限制。申请人不免除任何对该专利和《植物品种保护条例》(7 USC 2321及以下)授予的权利的侵犯。
为了清楚和理解的目的，已经通过示例和实施例的方式详细描述了前述发明。但是，显然可以在仅由所附权利要求的范围限定的本发明范围内进行某些改变和修改，诸如单基因修饰和突变、体细胞克隆变异体、由本发明自交植物大种群选择的变异个体等。
将本文所引用的所有文献完整收入本申请作为参考。
关于保藏的微生物或者其它生物材料的说明(PCT实施细则第13条之二)
PCT/RO/134表
权利要求
1.产生果实重量为大约1.5kg至大约2.5kg且果皮厚度为大约4mm至大约10mm的果实的四倍体西瓜植物。
2.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其产生果实重量为大约1.5kg至大约2kg且果皮厚度为大约4mm至大约7mm的果实。
3.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其产生重量为大约20g至大约35g每1000粒种子的种子。
4.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其产生重量为大约31g每1000粒种子的种子。
5.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中每个果实产生达大约150粒种子。
6.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中每个果实产生大约50粒至大约150粒种子。
7.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中每个果实产生大约70粒至大约150粒种子。
8.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中每个果实产生大约80粒至大约150粒种子。
9.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中所述植物每株结果大约3-4个。
10.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中所述果实含有大约12％至大约14％的可溶性固体。
11.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中所述果实含有大约13％的可溶性固体。
12.依照权利要求1的四倍体西瓜植物，其中所述植物的果实在开花后大约24天至大约27天成熟。
13.依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的种子。
14.依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的花粉。
15.依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的胚珠。
16.依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的果实。
17.通过将依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物与二倍体西瓜植物杂交产生三倍体杂种西瓜种子的方法。
18.权利要求17的方法，其中所述四倍体植物是雌性亲本。
19.权利要求17的方法，其中所述二倍体植物是雄性亲本。
20.可通过权利要求17的方法获得的三倍体杂种西瓜种子。
21.产生三倍体杂种西瓜种子的方法，包括以下步骤a)在授粉距离内种植依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的种子和二倍体西瓜植物的种子；b)在种植所述四倍体西瓜植物的种子之前7-10天种植所述二倍体西瓜植物的种子；c)栽培由所述种子产生的西瓜植物直至所述植物开出第二朵雌花；d)就在所述雌花开放那天之前的下午覆盖所述四倍体西瓜植物的雌花；e)在所述雌花开放那天的清晨收集所述二倍体西瓜植物的雄花；f)用步骤e)中收集的所述雄花给所述雌花授粉；并g)收获由在步骤f)中授粉的所述雌花产生的种子。
22.产生三倍体西瓜种子的方法，包括以下步骤a)在田地里种植依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物的种子和二倍体西瓜植物的种子，种植模式是两行四倍体西瓜植物对一行二倍体西瓜植物；b)将所述四倍体西瓜植物修剪成每株植物大约2-3个分枝；c)将所述四倍体西瓜植物上的基本上所有雄花和雄花蕾去雄；d)允许用所述二倍体西瓜植物的花粉给所述四倍体西瓜植物的雌花授粉；e)标记去雄阶段授粉的雌花；并f)由四倍体西瓜植物的标记果实收获种子。
23.产生四倍体西瓜种子的方法，包括a)种植依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜植物；b)容许所述四倍体西瓜植物自花授粉；c)由步骤b)的四倍体西瓜植物获得果实；d)由所述果实取出四倍体西瓜种子。
24.依照权利要求23的方法，还包括清洗并干燥所述种子。
25.产生四倍体西瓜植物的方法，包括a)获得结薄果皮小果实的二倍体西瓜系；b)对所述二倍体西瓜系的植物进行四倍体转变以获得四倍体西瓜植物；c)选择步骤b)中得到的四倍体西瓜植物，其中所述四倍体西瓜植物所结果实重量为大约1.5kg至大约2.5kg且果皮厚度为大约4mm至大约10mm。
26.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物所产生的种子重量为大约20g至大约35g每1000粒种子。
27.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物每个果实产生达大约150粒种子。
28.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物每个果实产生大约50粒至大约150粒种子。
29.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物每个果实产生大约70粒至大约150粒种子。
30.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物每个果实产生大约80粒至大约150粒种子。
31.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的四倍体西瓜植物每株植物产生大约3-4个果实。
32.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的所述四倍体西瓜植物的果实含有大约12％至大约14％的可溶性固体。
33.依照权利要求25的方法，其中步骤c)中选择的所述四倍体西瓜植物的果实在开花后大约24天至大约27天成熟。
34.依照权利要求25的方法，其中所述二倍体西瓜系是二倍体自交西瓜系HD或具有二倍体自交西瓜系HD的特征的二倍体自交西瓜系。
35.依照权利要求25的方法，其中所述步骤b)包括对所述植物进行oryzalin处理。
36.依照权利要求25的方法，还包括d)使步骤c)中选择的四倍体西瓜植物自花授粉。
37.依照权利要求25的方法，还包括d)使步骤c)中选择的四倍体西瓜植物自花授粉直至在后代中没有观察到变异。
38.可通过权利要求25-36任一项的方法获得的四倍体西瓜系。
39.依照权利要求37的四倍体西瓜系的种子。
40.依照权利要求37的四倍体西瓜系的花粉。
41.依照权利要求37的四倍体西瓜系的胚珠。
42.依照权利要求37的四倍体西瓜系的果实。
43.依照权利要求1-12任一项的四倍体西瓜系用于产生杂种三倍体西瓜的用途。
全文摘要
本发明公开了四倍体西瓜自交系。本发明涉及四倍体西瓜自交系的种子和植物、通过种子和组织培养繁殖四倍体自交系的方法。本发明还涉及通过四倍体西瓜自交系与二倍体西瓜自交系之间的杂交生成三倍体无籽西瓜种子和植物的方法，以及由此产生的三倍体植物。
文档编号A01H5/08GK1652680SQ03810750
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月12日 优先权日2002年5月14日
发明者张兴平 申请人:辛根塔参与股份公司