用甲虫气味在蔓生豌豆上阻止蛞蝓的潜力的研究的制作方法

专利名称：用甲虫气味在蔓生豌豆上阻止蛞蝓的潜力的研究的制作方法
1、简介在英国，蛞蝓是蔓生豌豆的主要问题。它们在豌豆植物上的爬行和进食习性通常导致它们大量进入豌豆收割机中，引起作物的污染和可能的废弃，从而使种植者遭到损失和面临高费用。
采用目前关注的以天敌作为潜在的化学忌避剂的来源的可能的解决方法，正在由加的夫大学(Cardiff University)的博士后学生研究，并可望得到一种新的蛞蝓抑制素。
虽然相当长时间以来已知蛞蝓不愿进入刚刚被步甲占领的区域，但是通过广泛的一系列实验室实验，现在已经清楚，蛞蝓响应于由位于甲虫腹部尖端的臀腺(


图1)发出的化学分泌物。通常响应于甲虫捕食者的攻击而从腺体释放的这些分泌物含有有害物质的混合物——通常是酸和烷烃的混合物，尽管不同物种间的比例可能不同。这种防御机制也警告了甲虫自己潜在的猎物而对甲虫产生不利，因为当暴露于甲虫提取物时，蛞蝓的行为明显改变，这在最近仅由加的夫大学报道(图2-5)。在一定时间内根据蛞蝓留下的细长痕迹而测量的蛞蝓的反应显示，当从P.melanarius甲虫获得提取物后12小时测量痕迹时(图2)，当从P.cupreus和P.madidus甲虫获得提取物后24小时测量痕迹时(分别见图3和4)，蛞蝓积极地躲避被处理的区域，甚至在48小时后测量痕迹时，蛞蝓仍躲免用Hr.rufipes甲虫处理的区域。该测试还揭示出这些蛞蝓在实验期间并不死亡。这一定表明当蛞蝓暴露在甲虫提取物中时并没有副作用。用于进行这些测试的录像记录揭示当与甲虫提取物接触时，部分蛞蝓直接和迅速的反应显示这些结果是非常令人鼓舞的。不同的反应有竖起、急速转弯行为和迅速收缩触须和头。在极少的情况下，蛞蝓移向并越过甲虫提取物而没有上述反应。目前观察到的多数情况中，蛞蝓从提取物处转向并移开，当然这显示了当蛞蝓接触到这些分泌物时直接负面反馈的直接证据。不用说，现在还要进行定量和分析的这些反应已经被多次重复，并仅示于博士后的论文中，作为清楚的确认，这些物质以人工制备的形式能够与先前对臀板的分泌物表现出的方式一样阻止蛞蝓。
2、步甲的臀腺及其阻止蛞蝓的独特工具显示臀腺的实验在Brian Staddon博士熟练的监管下进行，Brian Staddon博士早先是加的夫大学生命科学系的一员，以前曾研究过其他昆虫的腺体。首先，将活的试样放在冷冻装置中约10分钟，当它停止运动时，转移到有盐溶液(1gNaCl/100ml水)的玻璃培养皿中。然后，用通常解剖小试样的精细刀子在胸部将甲虫切断，并将背板，也称为并合的鞘翅或翅鞘，向后抬起以将腹部切开一半。由通过腹甲的侧面的切口，在立体显微镜下将后部背甲分离并显示沿着P.melanarius后部最显著背片的前缘打开的腺体。频繁更换盐并用精细的剪刀和镊子，小心地取出胃管、马尔皮基氏管、生殖材料和其他组织以显示那只甲虫的臀腺(
图1)。
为获得用于分析的分泌物，首先将甲虫冷却到约10℃，当观察到它行动迟缓时。在被提取分泌物之前，这个运动是必要的以防止任何的早熟改变。随后，当甲虫在室温下被温暖时，可看到它运动非常迅速。通常用来显示来自腺体的挥发物的标准方法用于提取该甲虫。为控制住甲虫，用昆虫分类学家通常用来观察小标本的非常精细的镊子很容易地夹住其前腿。受到攻击，甲虫立刻抬起腹部后部的大部分以从臀腺喷出被认为是防御分泌物的物质，并持续抬起以有力地喷射直到将其释放。由玻璃和非普通的滤纸制成的试样用来转移这些分泌物，因为玻璃对于保存测试化合物以避免污染是更为安全的。当分泌物被释放时，拿一根末端膨大的6″玻璃棒靠近甲虫以收集分泌物，并用称作质谱的气相色谱中最近的技术进行分析，质谱仅用于鉴别通过气相色谱后的测试化合物，并且其描述将相关的仅显示在博士后论文中。然而，在P.melanarius周围是甲基丙烯酸和巴豆酸的混合物，而在P.madidus附近的是甲基巴豆酸和甲基丙烯酸，在P.cupreus测试化合物是大量的乙酸和巴豆酸，在H.rufipes中仅发现了甲酸。当提取甲虫分泌物时，甚至从这些酸的气味也很容易识别。在这些样品中还存在很多烷烃和酮，但是仅作为添加剂，因此没有用于本研究中。
重要的化学药品已经从商业来源获得，并进行测试以显示其对于阻止蛞蝓采食生长中的植物的作用以及阻止蛞蝓爬上生长中的植物的作用。进行这项测试最合适的地点当然是在Talybont，那里由全部玻璃暖房的设施来栽培豌豆，并可就地进行这些测试，而且离加的夫大学的步行距离很短。此外，这里还是加的夫大学唯一进行基础研究以开发用于植物保护的新化学药品的地方。
2.1关于臀腺释放的潜在的化学品只有那些具有潜力开发用作新的蛞蝓抑制素的化学药品公司被包括在本研究中。例如，甲基丙烯酸在Merck Sharp & Dohme公司找到，该公司也有出色的实验室设备用来评价用于商业开发的新化合物的适用性。其次是Fisher科学国际公司(Fisher Scientific International Inc.)的子公司Fisher科学英国有限公司(Fisher Scientific UK Limited)，出售巴豆酸、乙酸和甲酸以鼓励这项工作，该公司在化学品市场也为消费者服务。对甲基巴豆酸的需求由Sigma Aldrich公司满足供应，该公司也是一个为工业市场提供精细化学药品的全球供应商。化合物的物理描述显示，这些化学药品是水溶的，并可以与蒸馏水混合，蒸馏水无疑不含有普通用途的普通水中存在的所有杂质。在此报道包括室温(20-25℃)下颜色和物理状态(固体、液体或气体)的化学药品的外观。如果化合物能通过嗅觉检测到，则标明气味。由于数据没复制而不能被简单测量的值，必须注明为不能提供。
2.1.1甲基丙烯酸物理状态 透明液体颜色 APHA20max(表示颜色基本状态的数值)气味 刺鼻气味pH 不能提供蒸汽压 20℃下0.8mbar粘度 20℃下1.4mPas沸点 760.00mmHg下，63℃凝固/熔点 16℃自燃温度 365℃(689.00)闪点 76℃(168.80)爆炸极限，下限 08vol％爆炸极限，上限 02vol％分解温度在水中的溶解度 9.7g/100ml(20℃)比重/密度 1.0150g/cm3分子式 C4H6O2分子量 86.092.1.2巴豆酸物理状态 片状外观 白色-浅黄色气味 刺激性气味pH 约3(10g/l水溶液)蒸汽压 20℃下0.25mbar粘度 不能提供沸点 760.00mmHg下，185-199℃凝固/熔点 70-73℃自燃温度 490℃(914.00)闪点 88℃(190.40)爆炸极限，下限 不能提供爆炸极限，上限 不能提供分解温度 210℃在水中的溶解度 94g/l水中(25℃)比重/密度分子式 C4H6O2分子量 86.092.1.3乙酸物理状态 透明液体外观 APHA10max气味 刺激性气味pH 不能提供蒸汽压 20℃下15mmHg粘度 25℃下1.53mPas沸点 760.00mmHg下，117-118℃凝固/熔点 16-16.5℃自燃温度 427℃(800.60)闪点 40℃(104.00)爆炸极限，下限 4.00vol％爆炸极限，上限 17.00vol％分解温度 210℃在水中的溶解度 可与水混溶比重/密度 1.0490g/cm3分子式 CH3CO2H分子量 60.042.1.4甲基巴豆酸物理状态 粉末和块状外观 白色-米色气味 不能提供(不显著)pH 不能提供蒸汽压 不能提供粘度 不能提供沸点 760.00mmHg下，198.4℃凝固/熔点 61.00-65.00℃自燃温度 不能提供闪点 不能提供爆炸极限，下限 不能提供爆炸极限，上限 不能提供分解温度在水中的溶解度 溶于热水并少量溶于冷水比重/密度 9690g/cm3分子式 C5H8O2分子量 100.122.1.5甲酸物理状态 透明液体颜色 无色气味 刺激性气味pH 不能提供蒸汽压 20℃下44mbar粘度 20℃下1.47mPas沸点 760.00mmHg下，101℃凝固/熔点 8℃自燃温度 520℃(968.00)闪点 69℃(156.20)爆炸极限，下限 14.00vol％爆炸极限，上限 33.00vol％分解温度在水中的溶解度 可混溶比重/密度 1.2200/cm3分子式 HCO2H分子量 46.022.1.6应用和来源这五种有机酸有共同的用途。像甲酸和乙酸这样普遍存在的物质在工业和实验室中有许多不同的功用。
甲酸杀虫剂药理学的革(皮革)橡胶硫化起始原料乙酸人造纺织品制造pH调节水的脱矿质防腐调味剂溶剂药理学的起始原料甲基丙烯酸
各种甲基丙烯酸聚合物的单体巴豆酸药理学的食品包装膜的共聚物甲基巴豆酸药理学的替代药香料来源甲酸天然存在于胡萝卜、大豆根、角豆蓍草(carob yarrow)、芦荟、累范特浆果(Levant berry)、熊果、艾草(wormwood)、依兰树、白屈菜、蔓陀罗、水薄荷、苹果、西红柿、月桂叶、刺柏(common juniper)、银杏、杜梨(scented boronia)、薄荷、欧洲薄荷(European pennyroyal)和香蕉。
乙酸天然存在于许多植物种类中，包括Merrill flowers、可可果、芹菜、黑檀(blackwood)、越桔汁、凤梨、甘草、葡萄、洋葱鳞茎、燕麦、欧洲七叶树(horse chestnut)、芫荽(coriander)、人参(ginseng)、辣椒(hotpepper)、亚麻籽、黄葵(ambrette)和chocolatevines。
3、这些化学药品与Deroceras reticulatum蛞蝓的相互作用3.1显示该试验的实验室研究下面，用从质谱获得的结果以这些有机酸来制备测试溶液，对蛞蝓在甲虫气味存在下的行为进行研究。首先，该测试在实验室中以前面对采用对照的臀板分泌物所示的方式进行，并且在培养皿中测试扇形以显示整晚蛞蝓的选择。在24小时中(n＝10次重复)，培养皿被蛞蝓痕迹覆盖的总面积的比例显示蛞蝓活跃地避开用P.melanarius、P.madidus、P.cupreus和H.rufipes甲虫处理的区域。该结果显示蛞蝓有显著的行为改变，并且最重要的，发现当暴露在从商业来源制造的甲虫气味中时，蛞蝓不死亡。在单独的测试中，每种化学药品其自身的潜力也同时被证实以显示这种趋避行为。然而，所有测试的结果仍要进行分析，并在用计算机软件进行图像分析后将仅示于博士后的论文中。
3.2这些化学药品对半野外条件下生长的豌豆植物的潜在影响3.2.1玻璃温室研究显示其对阻止蛞蝓采食生长的植物的效果一旦在加的夫大学内获得此突破，下一阶段将对野外研究来反映该实验，在那里测试将显示使用这些化学药品对于阻止蛞蝓采食和爬上生长的豌豆植物是安全的。基于显示趋避行为的原理，该玻璃温室的研究必须代替合适的实验设计。基于记录蛞蝓行为的五点测量也被显著地获得，在仅持续五天的简单实验过程下，采用在Talybont现有的设施完成该半野外的试验。制造其产品用于超市销售的Addis家用品有限公司(Addis Housewares Ltd)提供不同颜色的塑料碗以适于随机型实验在玻璃温室中展示该野外研究。Whitford塑料有限公司(Whitford Plastics Ltd)生产聚四氟乙烯(fluon)，一种以前在加的夫大学中用于防止蛞蝓从计划的实验中逃脱的试验化学药品，该药品以升为单位出售，足以用简单的漆刷来覆盖这些塑料碗的各面。F.A.Smith是为加的夫大学在Talybont园艺服务提供土壤的商人，生产通常用于苗圃以种植豌豆的John Innes Potting堆肥2号，因为理想情况，添加有泥炭和砂砾的杀菌的土壤具有用于快速发芽的基肥。其次，Lyndon Tuck是受雇于加的夫大学的技术员，在Talybont做园艺工作，并且以前有种植豌豆的经验，因此提供这些植物以进行化学药品的处理，这些植物在1/4浅盘中，仅不超过19天大。“Feltham First”种子由于其豌豆的质量好因而被英国的大多数种植者当然地广泛采用以种植豌豆，该种子由“Moles”，一个在东撒克斯(Essex)的种子公司提供，该公司也生产并正规地向超市出售种子。为保持豌豆良好并湿润，以及使蛞蝓舒适，购自当地B&Q商店的多用途泥炭基堆肥是充足的以支持放在塑料碗中的豌豆浅盘，该碗的2/3用湿润的泥炭填充，并且浅盘放在使其边缘与泥炭的表面平齐的位置。用于本实验的所有蛞蝓收集自Talybont周围的田野中，它们在早上日出的较早时间里潜伏在植物下面活跃地寻找食物，并在玻璃温室中测试前在15℃、80％RH和12小时光照黑暗的条件下预先使蛞蝓饿24小时。在蔓生豌豆的常规操作中造成污染的是同一种蛞蝓，其拉丁名是Deroceras reticulatum，并且对于在英国种植的其他作物的有形损坏是众所周知的。Deroceras reticulatum，或者也称作“麦蛞蝓(grey field slug)”，也能容易地从其外部特征识别，因为它具有独特的外表，在浅灰色的背景下身体上纵向覆盖有清晰可见的花纹，这也是为什么其拉丁文名字被称为reticulatum的原因。当在例如豌豆上测试新化学药品时，大容积的烧瓶是合适的，因为测试溶液是以升为单位制备的，并且为本国当地家庭用品商店专门生产园艺设备的Hozelock有限公司提供在生长的植物上测试这些化学药品所需的相当大的喷雾器。还必须注意安全，在开始这个简单的实验进行喷洒时，注意戴上头罩和一次性手套。喷洒这些化学药品还必须在合理的时间内完成，以显示该实验的结果是一套没有偏倚的结果。出于这个考虑，在喷洒每种化学药品时使用独立的玻璃温室是明智的，以避免在这样的处理之间损失时间，并且必须小心不要让植物湿透，而通过简单使用这些喷雾器上提供的设备仅产生保护植物不受Derocerasreticulatum蛞蝓侵害所需的细薄雾即可。一旦植物被这种认为是友好的溶液覆盖以将这些蛞蝓阻止在甚至很小的距离外，就可进行评价，可让10只蛞蝓进入一个碗中以匹配8株植物，额外的2只蛞蝓用于当将蛞蝓引入碗中以开始该随机型实验时可能发生任何意外时进行补充。仅用干净的自来水配制来自P.melanarius、P.madidus、P.cupreus和H.rufipes甲虫的测试溶液，用40个有森林绿、蓝色、金属色、浅褐色和黄色的这五种颜色的315×285×220mm的碗匹配这些处理。例如，森林绿色总是用作对照，测试来自托架上及其位置的自来水溶液样品以避免进行该实验时的任何混淆。重复实验的数目不得不压缩为8个，因为除了给房间留下机动的地方，以用来检查温度、湿度水平和保持泥炭和地面潮湿外，玻璃温室中只能容纳40个碗。基于五点测量，每天记录被蛞蝓去掉和啃咬的叶子的百分数以显示蛞蝓的破坏
1、未被破坏的叶子的数目2、叶子去掉高达25％被破坏的叶子的数目3、25％-50％被破坏的叶子的数目4、50％-75％被破坏的叶子的数目5、＞75％被破坏的叶子的数目并且1-5的数目相加显示在记录当天每个重复实验中被破坏的和未被破坏的叶子的总数。实施该实验仅显示蛞蝓造成的采食破坏。还进行常规检查看看是否叶子有颜色的转变作为该实验的一个结果。只有颜色转变被认为严重时，该破坏才被记录。
3.2.2阻止蛞蝓爬上生长的豌豆植物的效果在分别的实验中，这些蛞蝓的爬行习惯也被观察以显示化学药品趋避的直接证据以支持本研究。这容易从植物上的3个不同点来做，假如我们说，它们是上部、中部和下部来描述这些位置，所述位置还必须包括碗中的土壤，以解释如果在这些植物附近没有发现蛞蝓的趋避行为。一旦蛞蝓以这种方式分布，剩下的就仅仅是进行统计了。在植物自身上的蛞蝓的位置是非常重要的，因为如果结果显示这些小软体动物能被阻止不迁移到植物内部，那么就能假定甲虫气味具有开发为新的蛞蝓抑制素的潜力。这可被有效地获得，如果该测试被证明是肯定的并且理想地有短期效果，例如在2-3小时间，那么可以就在收割前将必要的工具一起充足地提供给种植者以清除蔓生豌豆因Deroceras reticulatum蛞蝓而面临的问题。因此，在下午7点以后当外面黑了后进行记录，以显示该效果。
每种测试化合物的潜力也被单独测试，以解释这些小生物采食和随后的爬行习惯。
4、结果4.1显示甲虫气味防止Deroceras reticulatum蛞蝓对豌豆的采食破坏效果的进展由Deroceras reticulatum蛞蝓对生长的豌豆植物造成采食破坏的实验结果清楚地显示，甲虫气味甚至是在野外情况下具有控制存在的蛞蝓数量的潜力。这结果的确在此测试的第二天得到，当对任何测试仅加入甲基丙烯酸或甚至甲基丙烯酸其自身使破坏有效减少时，就显示甲虫气味可用作防止蛞蝓爬上豌豆植物的抑制素。这就是为什么采用在其测试化合物中含有甲基丙烯酸的P.madidus和P.melanarius步甲时由Deroceras reticulatum蛞蝓造成的采食破坏被有效减少。该抑制在此测试的第五天和最后一天也是明显的，显示这些结果是成功的。仅含有甲酸的II.rufipes组也分享这个成功，在加的夫大学内的实验室研究中已知甲酸是恐吓蛞蝓僵硬的抑制素。在此实验中其他甲虫组的控制信息也是明显的。至于乙酸和甲基巴豆酸在第2天的结果可能是由于实验的错误？4.2通过软体动物的爬行试验显示此改进然而，需要直接的证据来显示当豌豆收割机开始工作时，这些蛞蝓可远离植物以使它们停止干扰，在简单测试中看到一旦甲虫气味被引导到植物上蛞蝓保持与以前相同的方式。仅两个小时的期间足以使蛞蝓在用P.madidus溶液覆盖的植物的土壤上保持麻痹，并且在该测试的第一天用甲基丙烯酸，的确也有类似的反应，显示一旦在这些结果下分布，蛞蝓可被阻止迁移到植物中。但是很好的消息是，蛞蝓在每个实验后仍然活着，显示由人造化学药品制备的甲虫气味没有任何副作用，即使在此实验的第五天和最后一天。从显示这些化学药品没有副作用的潜力可看到将甲虫气味开发为新的蛞蝓抑制素的很好的机会。
对于采食和爬上植物的这些结果的重要意义已经通过简单的卡方检验(chi-sq test)而测试，显示这些化学药品已经达到所需的标准需求，以将工作进行到此研究的下一阶段，并且这些测试的详细内容在对chi-sq分析的竞争分析可显示在随后我的博士后论文中。
5、结论现在，当前的研究重复了在实验室中的过程，显示与以前看到的一样，在不杀死蛞蝓的情况下也可在野外获得该结果，并因此给那些不幸的种植者以一个在收获时减少蛞蝓污染的新途径。为继续此工作，必须进入一个使其对英国农民有实用价值的阶段，其中更多的测试将显示在野外使用这些化学药品也是安全的。因此，只要这些安全标准与未来在一个新的方案下博士后之后继续的研究相吻合，那么此工作就将使种植者受益。只要在下一阶段之后，种植者将会看到该新的蛞蝓抑制素在蔓生豌豆收获期间作为防止蛞蝓污染的潜在来源。然而，在加的夫大学很快将起草一个方案来显示如何在几个阶段开展此工作以为种植者展示进行此工作必要的改进。化学药品公司也将接受该新的蛞蝓抑制素作为当前在英国用于阻止和防止蛞蝓进入其他作物的潜在来源。
权利要求
1.蛞蝓忌避剂，包括天然存在的来自步甲的分泌物。
2.如权利要求1所述的蛞蝓忌避剂，采用甲虫分泌物在蔓生豌豆上阻止蛞蝓。
3.一种组合物作为蛞蝓忌避剂的用途，该组合物包括甲基丙烯酸和水。
4.一种组合物作为蛞蝓忌避剂的用途，该组合物包括甲基丙烯酸、甲基巴豆酸和水。
5.一种组合物作为蛞蝓忌避剂的用途，该组合物包括甲基丙烯酸、巴豆酸和水。
6.一种组合物作为蛞蝓忌避剂的用途，该组合物包括甲酸和水。
7.如权利要求3～6中所述的组合物在蔓生豌豆上阻止蛞蝓的用途。
全文摘要
在英国，蛞蝓是蔓生豌豆的主要问题。它们在豌豆植物上的爬行和进食习性通常导致它们大量进入豌豆收割机中，引起作物的污染和可能的废弃，从而使种植者遭到损失和面临高费用。采用目前关注的以天敌作为潜在的化学忌避剂的来源的可能的解决方法，正在由加的夫大学的博士后学生研究，并可望得到一种新的蛞蝓抑制素。虽然相当长时间以来已知蛞蝓不愿进入刚刚被步甲占领的区域，但是通过广泛的一系列实验室实验，现在已经清楚，蛞蝓响应于由位于甲虫腹部尖端的臀腺(
图1)发出的化学分泌物。通常响应于甲虫捕食者的攻击而从腺体释放的这些分泌物含有有害物质的混合物——通常是酸和烷烃的混合物，尽管不同物种间的比例可能不同(见说明书)。这种防御机制也警告了甲虫自己潜在的猎物而对甲虫产生不利，因为当暴露于甲虫提取物时，蛞蝓的行为明显改变，这在最近仅由加的夫大学报道(见说明书，图2－5)。用于进行这些测试的录像记录揭示当与甲虫提取物接触时，部分蛞蝓直接和迅速的反应显示这些结果是非常令人鼓舞的(见说明书，第1页)。该测试还揭示出这些蛞蝓在实验期间并不死亡。这一定表明当蛞蝓暴露在甲虫提取物中时并没有副作用。重要的化学药品已经从商业来源获得，并在半野外的条件下进行测试以显示其对于阻止蛞蝓采食生长中的植物的作用以及阻止蛞蝓爬上生长中的植物的作用。该发现推断，甲虫气味具有开发为新的蛞蝓抑制素的潜力。化学药品公司也将接受该新的蛞蝓抑制素作为当前在英国用于阻止和防止蛞蝓进入其他作物的潜在来源。
文档编号A01N37/02GK1905795SQ200580001627
公开日2007年1月31日 申请日期2005年1月6日 优先权日2004年1月14日
发明者纳格拉斯·阿布杜尔·盖尼 申请人:纳格拉斯·阿布杜尔·盖尼