专利名称：产量增加的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及增加植物产量的方法。更加具体而言，本发明涉及通过向植物引入编码D-型细胞周期蛋白依赖性激酶(D-type Cyclin-Dependent Kinase(CDKD))的核酸来增加植物产量尤其是种子产量的方法。本发明还涉及通过根据本发明的方法产生的植物，其中所述植物相比对应的野生型植物具有增加的产量。本发明也涉及在本发明方法中有用的构建体。
不断增长的世界人口和可用于农业的可耕地的不断减少的供给，激起农业研究向提高农业的效率发展。农作物和园艺改良的传统手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这样的选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传组分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后需要把该遗传物质导入到植物中。这种技术能够提供具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的作物或植物。一种具有特殊经济利益的性状是产率。产率通常定义为作物产生的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。产率直接取决于几个因素，例如，器官的数量和大小，植物结构(例如，分枝的数量)，种子产量等等。根的发育、营养吸收和应激耐受性也是确定产率的重要因素。可以通过优化上述因素之一来提高作物产率，这可以通过修饰植物内在的生长机制来完成。
植物内在的生长机制存在于总称为“细胞周期”的高度有序的事件序列中。通过细胞周期前进对多细胞生物的生长和发育是基本的，并且对细胞增殖是关键的。细胞周期的主要组分在酵母、哺乳动物和植物中高度保守。细胞周期一般分为下列连续的时期G0-G1-S-G2-M。DNA复制和合成一般发生在S期(“S”指DNA合成)，而染色体的有丝分裂分离发生在M期(“M”指有丝分裂)，其间插入间期G1(DNA复制之前的细胞生长期)和G2(DNA复制之后细胞准备分裂的时期)。M期的最后步骤一—胞质分裂之后，细胞分裂完成。离开细胞周期并变成休眠的细胞称为处于G0期。这个时期的细胞可以受刺激而重新进入细胞周期的G1期。G1、G2和G0中的“G”代表“间隙”。细胞周期进程的完成使得处于细胞分裂的每个子细胞接受亲本基因组的一个完整拷贝。
细胞分裂受控于两个主要的细胞周期事件，即DNA合成的起始和有丝分裂的起始。每个这些主要事件的每个过渡都受控于特定蛋白质复合体(涉及DNA复制和分裂)代表的检查点。在哺乳动物和植物细胞中，G1/S边界时DNA合成必需的基因的表达受转录因子的E2F家族调节(LaThangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人，2002)。进入细胞周期由E2F/Rb复合体调节/触发，该复合体整合信号并允许细胞周期基因的转录激活。细胞周期不同时期之间的转换以及因此细胞周期的前进通过形成和激活不同异二聚体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(通常称作细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK))来驱动。这些激酶活性的前提是与特定的细胞周期蛋白物理结合，激活的计时主要取决于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白的结合诱导相关联的CDK的N末端裂片(lobe)构象变化，并且促进复合体的定位和底物特异性。当单体的CDK结合细胞周期蛋白时，它们被激活，并因此具有激酶活性。细胞周期蛋白的蛋白水平在细胞周期中起伏，并因此代表着决定CDK激活作用定时的主要因素。这些包含细胞周期蛋白和CDK的复合体在细胞周期中的周期性激活介导了细胞周期转换(检查点)的时序调节。其它调节CDK活性的因子包括CDK抑制剂(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK活化激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人，1999；Reed 1996)。
在植物中，迄今为止，已经研究了两种主要类型的CDK，称作A型和B型CDK。A型CDK调节G1向S和G2向M的转换；而B型CDK似乎仅控制G2至M的检查点(Hemerly等人，1995；Magyar等人，1997；Porceddu等人，2001)。此外，已经报道存在C型CDK和CDK活化激酶(CAK)(Magyar等人，1997；Umeda等人，1998；Joubès等人，2001)。Vandepoele等人2002年通过基于同源性的注解方法鉴定了4种CAK。这些CAK为三种D型CAK(Arath；CDKD；1，Arath；CDKD；2和Arath；CDKD；3)；和一种F型CAK(Arath；CDKF；1)。
Yamaguchi等人(PNAS Vol.100(13)8019-8023，2003)描述了在烟草叶外植体中过量表达稻R2cDNA(编码CAK)。他们报道，R2在培养的第一个7天瞬时表达触发在没有细胞分裂素的情况下形成愈伤组织。Yamaguchi等人也检查了CDK对体外器官发生的控制。
Fabian-Marwedel等人(The Plant Cell，Vol.14，197-210，2002)报道了稻CAK、R2在悬浮细胞中调节S期进程和总体生长速率。
影响植物细胞周期并因此修饰植物多种生长特征的能力将应用于下列领域，例如作物增产、植物育种、观赏植物生产、aboriculture、园艺学、林业、用于生物反应器(用于诸如药物、抗体、或疫苗的生物技术生产、或有机废物的生物转化)的藻类的生产以及其它此类领域。
现在已经发现，向植物引入CDKD编码核酸使植物具有相比对应的野生型植物增加的产量。因此，根据本发明的一个实施方案，提供了在植物中增加产量的方法，其包括向植物引入编码CDKD的核酸。
如文中所定义的术语“增加的产率”分别用来指相对于对应的野生型植物，在如下的一个或多个方面的增加(i)植物一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分，增加的根生物量或增加的任何其它的可收获部分的生物量，(ii)增加的种子产率，其可能源于增加的种子生物量(种子重量)，可能是每株植物种子重量的增加或个别种子基础上的增加，并且所述种子重量的增加可能是因改变的种子大小所致，如种子长度和/或种子宽度和/或种子面积；(iii)增加的(饱满)种子数量；(iv)增加的种子大小，这可能也影响种子的组成；(v)增加的种子体积，这也可能影响种子的组成；(vi)增加的收获指数，其可以表达为可收获部分如种子的产率占总生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，是从计数的饱满种子的数量和它们的总重量推断的。增加的TKW可能源于增加的种子大小和/或种子密度。
根据本发明的一个优选实施方案，产率的增加涵盖如上文(ii)至(vii)中任何一项或多项所定义的种子水平上的产量增加。
以谷物为例，产量增加可表现为下列一个或多个方面每公顷或每英亩植株数的增加，每株植物穗的增加，行数、每行种仁数、粒重、千籽粒重、穗长度/直径的增加，等等。以稻为例，产量增加可表现为下列一个或多个方面的增加每公顷或每英亩植株数，每株植物的花序数，每个花序上的小穗数，每个花序上的花数，种子饱满率的增加、千籽粒重的增加，等等。产量的增加可能还导致改变的结构，或可能作为改变的结构的结果发生。
根据优选特征，使用本发明的方法导致植物具有增加的产量，其中所述增加的产量通过下列至少一种情况来证明增加的地上面积、增加的TKW、增加的饱满种子数量、增加的种子重量和增加的收获指数(每个都相对于对照或相应的野生型植物)。
使用本发明的方法方便地导致任何植物的产量增加。
如文中所用的术语“植物”包含整个植物，植物的祖先和后代，以及植物的部分，包括种子，枝条，茎，叶，根(包括块茎)，以及组织和器官，其中上述的每一种都包含目的基因。术语“植物”还包含胚，分生组织区域，配子体，孢子体，花粉与小孢子，同样其中上述的每一种也都含有目的基因。如本文所定义，术语植物不包括悬浮培养物和愈伤组织。
本发明的方法可以用于任何植物，尤其属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物，观赏植物，粮食作物，选自如下物种的乔木或灌木金合欢属物种(Acacia spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp.)、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomelesspp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、柏木属物种(Cupressusspp.)、Cyathea dealbata、(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartiaspp.、子(Eleusine coracana)、画眉草属物种(Eragrestis spp.)、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoasellowiana)、草莓属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Irisspp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、Lettucaspp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、罗顿豆(Lotonusbainesii)、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属物种(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食豆属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物种(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesiio)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophvlla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、苋属植物、朝鲜蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿叶植物、亚麻、无头甘蓝、小扁豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶叶和藻类，等等。根据本发明的一个优选实施方案，植物是作物如大豆，向日葵，芸苔，紫花苜蓿，油菜籽，棉花，番茄，马铃薯或烟草。更进一步优选地，植物是单子叶植物，如甘蔗。更优选地，植物是谷类，如稻，玉米，小麦，大麦，粟，黑麦，高粱或燕麦。
术语“D型CDK”或“CDKD”在本文可互换使用，并且指当在CDK系统树(如
图1描绘的系统树)的构建中使用时聚类在包括D型CDK(但无其它CDK类型，例如A、B、C、E或F型CDK)的组周围或组中的任何氨基酸序列。本文编码CDKD的核酸是指编码如上文定义的CDKD氨基酸的核酸。
本领域技术人员使用已知技术和用来制作此类系统树的软件，例如GCG、EBI或CLUSTAL软件包，使用默认参数可以容易确定任何所讨论的氨基酸序列是否属于上述定义。构建此类系统树时，聚类在D型CDK组周围或组中的序列将被认为属于“D型CDK”的定义。编码此类序列的核酸将用于进行本发明的方法。
D型CDK一般具有磷酸化并激活CDK的能力，并且也已经显示为磷酸化并激活RNA聚合酶II。D型CDK也可以呈现一种或多种并且优选所有下列特征(i)NXTALRE基序，其中X为任意氨基酸；(ii)催化性激酶结构域；以及(iii)结合细胞周期蛋白H的能力。
由于基序NXTALRE对CDKD是特异的(根据现有知识)，所以这种类型的CDK可以容易与任何其它CDK区别。相反，根据现有知识，A型CDK将具有PSTAIRE基序，B型CDK具有P(P/S)T(A/T)(L/M)RE基序，C型CDK具有PITAIRE基序，E型CDK将具有SPTARE基序，而F型CDK将具有XSAXRE基序。
本领域技术人员可以对例如纯化的底物(例如人CAK2)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA聚合酶II羧基末端测定激酶活性。CDKD结合细胞周期蛋白H的能力可以通过从纯化的CDKD和细胞周期蛋白H中共沉淀CDKD-细胞周期蛋白H复合体或者通过使用双杂交测定容易地确定。
在拟南芥中，CDKD由3种不同基因CDKD；1、CDKD；2和CDKD；3编码；每种基因编码包含基序NXTALRE的蛋白质，其中X为任意氨基酸。
有利地，本发明的方法可以使用任何编码上文定义的CDKD的核酸来执行。向植物引入CDKD编码核酸使得此核酸在植物中的调节性表达(优选增加的表达)和/或植物中CDKD多肽的受调节的(优选增加的)活性和/或水平。CDKD的活性可以通过增加多肽水平来增加。备选地，当CDKD多肽的水平没有改变或者甚至当CDKD多肽的水平减小时，活性增加。当多肽的内在性质改变(例如，通过制备比野生型多肽更具活性的突变形式)时，就会发生活性增加。
编码CDKD的核酸优选与组成型启动子有效连接以在植物中过量表达。组成型启动子优选为GOS2启动子，进一步优选来自稻的GOS2启动子。应当清楚的是，本发明的应用既不局限于使用拟南芥CDKD，也不局限于SEQ ID NO1代表的CDKD，本发明的应用也不局限于CDKD编码核酸在GOS2启动子驱动下的表达。
根据本发明优选的方面，想象到CDKD核酸增强或增加的表达。获得基因或基因产物增强或增加的表达的方法在本领域详细记载，并且包括例如通过强启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。
编码CDKD的核酸可以来自任意来源。编码CDKD的核酸/基因可以从微生物来源(例如细菌、酵母或真菌)或植物、藻类或动物(包括人类)来源分离。这个核酸可以在组合物和/或基因组环境中通过有意的人为操作来对其天然形式进行修饰。核酸优选为同源核酸，即从植物获得的核酸(无论是从它将被引入的相同植物物种，或从不同植物物种)。核酸可以从双子叶物种，优选十字花科(Brassicaceae)、更加优选拟南芥中分离。更加优选地，从拟南芥分离的编码CDKD的核酸是CDKD；1、CDKD；2或CDKD；3。最优选地，CDKD是拟南芥的CDKD；1，具体而言是SEQ ID NO1代表的核酸序列和SEQ ID NO2代表的相应氨基酸序列。
有利地，本发明的进行不局限于使用SEQ ID NO1代表的拟南芥CDKD；1。根据本发明的方法也可以使用上文定义的CDKD的功能性变体或使用编码CDKD的核酸的功能性变体来进行。优选的功能性变体为SEQID NO1代表的核酸序列的变体或SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的功能性变体。
本文定义的术语“功能性变体”为落入上文定义的CDKD定义的变体。优选地，功能性变体也具有磷酸化和激活CDK以及磷酸化和激活RNA聚合酶II的能力。优选地，D型CDK的功能性变体也呈现一种或多种并优选地所有下列特征(i)NXTALRE基序，其中X为任意氨基酸；(ii)催化性激酶结构域；以及(iii)结合细胞周期蛋白H的能力。本领域技术人员也可以通过简单地将待检验功能的变体替换下文实施例部分描述的序列容易地确定特定变体是否为功能性的(根据它是否能够增加植物产量)。
在进行根据本发明的方法中有用的适当变体核酸及氨基酸序列包括(i)CDKD编码核酸的功能性部分；(ii)能够与CDKD编码核酸杂交的序列；(iii)CDKD编码核酸的可变剪接变体；(iv)CDKD编码核酸的等位变体；和(v)CDKD氨基酸的同源物、衍生物和活性片段。
每一种上述变体都是上文定义的功能性变体。
使用全长CDKD编码DNA序列并非进行根据本发明方法的先决条件，这对本领域技术人员是显而易见的。根据本发明的方法可以使用CDKD编码DNA/核酸的功能性部分，优选SEQ ID NO1代表的核酸序列的功能性部分来有利地进行。功能性部分为落入上文定义的功能性变体定义的CDKD编码核酸。部分可以使用本领域众所周知的技术，例如通过在编码CDKD的核酸(例如SEQ ID NO1的核酸序列)中产生一个或多个缺失来制备。
因此，根据本发明，提供了增加植物产量尤其是种子产量的方法，其包括向植物引入CDKD编码核酸的一部分。
另一变体为能够与CDKD编码核酸杂交的序列。此类杂交序列为那些落入上文功能性变体定义的序列。特别优选的是能够在严格条件下与CDKD编码核酸，尤其是SEQ ID NO1代表的CDKD编码核酸杂交的序列。
如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可完全发生在溶液中，即两互补的核酸都处于溶液中。依赖这种方法的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；以及基于此的所有方法)、扣除杂交、随机引物延伸、S1核酸酶作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA测序。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖凝胶珠子或任何其它树脂上。依赖这种方法的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。依赖这种方法的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、集落杂交、噬菌斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。杂交优选在严格条件下进行。严格条件为(1)采用低离子强度和高温度进行洗涤，例如，0.5M磷酸钠缓冲液pH 7.2，溶于7％SDS的1mM EDTA pH 8.0，温度为65℃或55℃，或者(2)在杂交期间使用变性剂如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺加0.1％牛血清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.05M磷酸钠缓冲液pH 6.5加0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠，温度为42℃。具体的实例包括使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhard’s液，超声处理的鲑精DNA(50nm/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，温度为55℃，并于55℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。本领域的技术人员能够很容易地确定并适当地改变严格条件，以获得清楚和可检测的杂交信号。
因此，根据本发明，提供了增加植物产量的方法，其包括向植物引入能够优选地在严格条件下与CDKD编码核酸杂交的序列。
另一在本发明方法中有用的变体是CDKD编码核酸的可变剪接变体。适当的剪接变体为那些落入上文定义的功能性变体的定义的变体。本文所用术语“可变剪接变体”包含其中所选的内含子和/或外显子已经被缺失、替代或加入的核酸变体。此类变体是其中蛋白质的生物活性保持不受影响的变体，这可以通过选择性地保持蛋白质的功能性片段来实现。此类剪接变体可以在天然中找到或者是人造的。制备此类剪接变体的方法在本领域是众所周知的。SEQ ID NO1的剪接变体特别优选由于根据本发明的方法。
因此，本发明也提供了增加植物产量的方法，其包括向植物引入CDKD编码核酸的可变剪接变体。
用于本发明的方法的另一种变体为CDKD编码核酸的等位变体。合适的等位变体为那些落入上文定义的功能性变体的定义的变体。等位变体天然存在，而且本发明方法中包含的等位变体就是使用这些天然的等位基因。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成了大多数生物天然发生的多态性株系中最大的序列变体集。在根据本发明的方法中尤其优选使用SEQ ID NO1的等位变体。
因此，本发明也提供了增加植物产量的方法，其包括向植物引入CDKD编码核酸的等位变体。
更加有利地，根据本发明的方法也可以使用CDKD的同源物、衍生物或活性片段来进行。编码氨基酸的同源物、衍生物或活性片段的核酸(例如SEQ ID NO2代表的核酸)可以容易地通过本领域技术人员众所周知的常规技术来确定。此类适合在本发明的方法中使用的核酸可以容易地如上所述确定。
蛋白质的“同源物”包含相对所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸置换、缺失和/或插入、但具有与它们从中衍生的未修饰蛋白质类似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。要产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以用其它具有相似性质(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或断裂α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的氨基酸代替。保守置换表是本领域众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany)。
用于根据本发明的方法中的同源物与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列具有(按升序的优选性)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。CDKD彼此之间呈现大约65％的同一性，并且与其它CDK呈现小于40％的同一性。因此，具有与SEQ ID NO2代表的CDK至少50％同一性的同源物将不包含非D型CDK的任何其它CDK。
术语“同源物”还涵盖两种特殊形式的同源性，其包括直向同源(orthologous)序列和共生同源(paralogous)序列，它们涵盖了用于描述基因遗传关系的进化概念。术语“共生同源”涉及某物种基因组内的基因复制，产生共生同源基因。术语“直向同源”涉及不同生物体中因遗传关系所致的同源基因。
例如，单子叶植物物种中的直向同源物可以通过实施所谓的交互blast搜索很容易地找到。这可以通过第一次blast完成，包括在任何序列数据库如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可用的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)进行blast。如果寻找的是稻的直向同源物，所讨论的序列将与例如来自NCBI上可用的Oryza sativa Nipponbare稻的28,469的全长cDNA克隆进行blast。当从核苷酸开始时可使用BLASTn，或当从蛋白质开始时可使用TBLASTX，并使用标准缺省值(期望值10，比对值50)。blast的结果可以进行过滤。然后再将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列(SEQ ID NO1或2)进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。在大家族的情况下，使用ClustalW，接着使用相邻连接树以帮助观察聚类(clustering)。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即，其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，而将一个不同的残基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；插入通常是大约1到10个氨基酸残基，缺失为大约1到20个残基。优选地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。
同源物还可以是蛋白质的“插入变体”，即，其中一个或多个氨基酸残基被引入到蛋白质中的预定位点。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入将小于氨基或羧基末端融合，约为1到10个残基的数量级。氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂合系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易地制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的位点定向诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变方案。
“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与S3a蛋白天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQ ID NO2所示，其可以包括天然和非天然存在氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括改变的、糖基化的、酰化的天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。与其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报告分子或其它配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸残基。
CDKD蛋白质的“活性片段”包含足够的氨基酸残基来聚类于构建的系统树(如
图1所示的一个系统树)上D型CDK组的周围或其中。当使用此系统树中的片段时，相似片段应当与相似片段比较，这表示应当用其它CDK的相应片段来创建系统树。
搜索和鉴定CDKD同源物的方法是本领域技术人员熟知的。对用于比较的序列进行比对的方法是本领域熟知的，这类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法来实现两个全序列的比对，其最大化匹配的数目，并最小化空位数目。BLAST算法计算序列同一性百分比，并对两个序列之间相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)可公众获得。适合在本发明的方法中使用的同源物，即那些具有与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列至少50％序列同一性的同源物，可以通过取得全长的CDK蛋白质序列并使用ClustalX1.81软件(采用默认参数)将它们比对来鉴定。然后使用BOXSHADE软件(同样采用默认参数)从这个比对计算距离矩阵。两种软件程序都可以公开获得。
因此，本发明也提供了增加植物产量的方法，其包括向植物引入编码CDKD例如SEQ ID NO2代表的CDKD的同源物、衍生物或活性片段的核酸，其中所述同源物、衍生物或活性片段与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列具有(按升序的优选性)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。
本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法的核苷酸序列。
因此，提供的基因构建体包含(i)CDKD编码核酸，优选SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性变体(如上文定义)；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选地(iii)转录终止序列。
在根据本发明的方法中使用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。基因构建体可以插入适合转化进入植物并且适合在转化的细胞中表达目的基因的商品化载体中。
用包含目的序列(即SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性变体(如上文定义))的载体转化植物。目的序列与一个或多个控制序列(至少与一个启动子)有效地连接。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能对与它们连接的序列的表达起作用的调控核酸序列。上述术语涵盖来源于经典真核生物基因组基因(包括精确转录起始所需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)的转录调控序列。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够、在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以便启动子序列能启动目的基因的转录。
优选地，编码CDKD或其功能性变体的核酸有效地与组成型启动子连接。如文中所定义的术语“组成型启动子”指该启动子在至少一种组织或器官中优势表达，而且在植物生活周期的任何阶段都优势表达。优选地，组成型启动子在整株植物中优势表达。优选地，组成型启动子是来自稻的GOS2启动子。
适合用于本发明方法的其它组成型启动子的例子列于下表A。
表A用于实施本发明的组成型启动子的实例
任选地，一个或多个终止子序列也可用于被引入到植物中的构建体中。术语“终止子”涵盖控制序列，其是位于转录单元末端的DNA序列，传递3’加工和初级转录物聚腺苷酸化以及转录终止的信号。另外的调控元件也可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子与增强子。这样的序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易地获得。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制原点序列。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为染色体外遗传元件(例如，质粒或粘粒分子)维持的情况。优选的复制原点包括但不局限于f1-ori和colE1。
基因构建体可以任选地包含选择性标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括任何赋予细胞表型的基因，其中它的表达促进已用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或筛选。适当标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记。因此，包含重组DNA的细胞能够在杀死未转化细胞浓度的抗生素或除草剂存在下存活。选择标记基因的实例包括提供除草剂Basta抗性的bar基因；赋予抗生素卡那霉素抗性的npt基因；赋予潮霉素抗性的hpt基因。可见标记例如绿色荧光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或萤光素酶也可以用作选择标记。适当的选择标记基因的其他实例包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(npt II)、潮霉素抗性基因、以及氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因等。
本发明也包括通根据本发明的方法可以获得的植物。因此本发明提供了通过根据本发明的方法可以获得的植物，其中所述植物相对于对应的野生型植物具有增加的产量并且所述植物具有改变的CDKD蛋白质活性和/或水平和/或编码CDKD蛋白质的核酸改变的表达。
本发明也提供了产生具有增加产量的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达CDKD编码核酸或其功能性变体(如上文定义)。
更加具体地，本发明提供了产生具有增加产量的转基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物细胞引入CDKD编码核酸或其功能性变体(如上文定义)；(ii)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
)义于，其中核酸可以直接引入到植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其它部分)之中。根据本发明的一个优选的特征，核酸优选通过转化被引入到植物中。
如本文所提及的术语“转化”涵盖把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移的方法如何。能够随后无性繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用本发明的遗传构建体进行转化，并从其再生完整植物。选择的特定组织将视可用于且最适于转化的特定物种的无性繁殖体系而改变。例示性的靶组织包括叶圆盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择地，它可以整合到宿主基因组中。所得的转化植物细胞然后可用于以本领域技术人员所知的方法再生为转化植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，任何转化方法都可用于引入目的基因到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA涂层颗粒轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。表达CDCK编码核酸的转基因稻植物优选使用任何用于稻转化的熟知方法，通过土壤农杆菌(Agrobacterium)介导的转化产生，例如在任何以下文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等(PlantPhysiol.2002 May；129(1)13-22)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。通常在转化以后，选择植物细胞或细胞群中与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记，接着将转化的材料再生成完整植株。
DNA转移和再生之后，可评价推断转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选择地或另外地，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
产生的转化植物可通过各种方法进行繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化株，而T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。
产生的转化生物体可以是各种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。
本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及囊括由任何上述的方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是该后代显示与由本发明的方法在亲代中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括含有分离的编码CDKD的核酸的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还延及植物的可收获部分，如但不局限于种子、叶、果实、花、根茎、块茎和鳞茎。
本发明也包含编码CDKD的核酸的用途以及CDKD多肽的用途。
当然，该用途之一涉及CDKD在增加植物产量，尤其是增加种子产量中的用途。种子产量可以包括下列一种或多种情况增加的饱满种子数量、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的TKW等等。CDKD可以是SEQID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其如上文定义的功能性变体。
编码CDKD的核酸和CDKD多肽也可以用于育种程序中。CDKD可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其如上文定义的功能性变体。例如，CDKD编码核酸或其功能性变体可以在染色体(或其部分)上，优选和一个或多个相关家族成员在一起。在此育种程序的实例中，鉴定DNA标记，其中所述的DNA标记可以与编码CDKD蛋白质或其功能性变体的核酸遗传性连接。然后这个DNA标记可以在育种程序中用来选择具增加产量的植物。
CDKD的等位变体也可以用在常规育种程序，例如标记辅助育种中。此类育种程序有时需要通过诱变处理植物来向植物中引入等位基因变异。一种合适的诱变方法是EMS诱变。然后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。紧接着是筛选步骤，选择所讨论序列的导致植物产量增加的优良等位变体。筛选一般通过监测包含所讨论的序列的不同等位变体(例如SEQ IDNO1不同的等位变体)的植物产量来进行。监测产量可以在温室或田间完成。其他的任选步骤包括将植物与另一植物杂交，其中鉴定出优良等位变体。这可以用来例如产生目的表型特征的组合。
编码CDKD的核酸和CDKD多肽也可以用作生长调节剂。CDKD可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其如上文定义的功能性变体。因为这些CDKD可用于增加植物产量，所以CDKD也是有用的生长调节剂，例如除草剂或生长刺激剂。因此，本发明提供了包含CDKD、以及适当载体、稀释剂或赋形剂的组合物，其用作生长调节剂。
根据本发明的方法也可以不向植物引入编码CDKD的核酸来进行。这可以通过引入基因修饰(优选在CDKD编码基因的基因座中)来实现。本文定义的基因的基因座用来表示基因组区域，其包括目的基因和编码区上游或下游的10KB。
可以例如通过任意一种(或多种)下列方法来引入遗传修饰TDNA激活、tilling、位点定向诱变、同源重组或者如上文详述，通过在植物(细胞)中引入和表达CDKD编码核酸。
T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，其通常在目的基因的基因组区域或基因编码区的上游或下游10KB处中含有如此构造的启动子(也可能是翻译增强子或内含子)，从而该启动子能指导靶基因的表达。一般地，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通过土壤农杆菌感染随机插入到植物基因组中，并导致靠近该插入的T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体[在本案为植物]中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部突变技术，TargetedInduced Local Lesions IN Genomes)，把遗传修饰引入到CDKD编码核酸/基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定、并最终分离能显示CDKD生物学活性的CDKD编码核酸的诱变变体。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现的更高的CDKD活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链；(e)DHPLC，其中库中异源双链的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple2004(TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics.NatRev Genet.2004年2月；5(2)145-50.)综述)。
可利用位点定向诱变产生CDKD编码核酸的变体。若干方法可用来实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley编http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。TDNA激活、TILLING和位点定向诱变是能够产生新的等位基因和CDKD变体的技术的实例。
同源重组能够在基因组的规定选择位置处引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾谷类作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Effcient genetargeting by homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)132-8)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的CDKD编码核酸或其变体)不需靶向到CDKD编码基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或附加地引入到内源基因中。
如上文所述，根据本发明的方法产生具有增加的产量的植物。这些有利的产量效应也可以与其它经济上有利的性状(例如进一步的产量增强性状、多种压力的耐受性、修饰多种结构特征和/或生物和/或生理特征的性状)组合。
附图描述现在本发明将参考下列附图进行描述，其中
图1为显示多种植物CDK的树。全长的CDK蛋白质序列使用“ClustalX1.81”软件采用其默认参数进行比对。使用“ClustalX1.81”采用其默认参数从这个比对中计算邻接树。使用“Phylip3.5”软件包的“drawgram”程序用其默认参数绘制树。
图2显示在稻(Oryza sativa)中表达GOS2启动子调控下的拟南芥CDKD；1基因的双元载体。
图3详述了用于进行根据本发明的方法的序列的实例。
实施例本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。
进行ng DNA操作除非另有说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，3rd Edition Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等第1卷和第2卷(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中描述的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1基因克隆使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增拟南芥的CDKD1；1。在从幼苗提取的RNA进行反转录之后，将cDNA克隆进入pCMV Sport 6.0。文库的平均插入片段大小为1.5kb，而最初克隆数为1.59×107集落生成单位(cfu)。在第一次6×1011cfu/ml扩增之后，最初效价测定为9.6×105cfu/ml。提取质粒之后，使用200ng在50μl PCR混合物中用作模板。使用引物prm2676(有义，起始密码子带下划线，AttB1位点为斜体5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAACAGCCGAAGAAAG 3’)和prm3677(反义、互补的，终止密码子带下划线，AttB2位点为斜体5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATAGGAACTCGAGATCAAGTT 3’)(其中包括进行Gateway重组的AttB位点)进行PCR扩增。用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行PCR。扩增得到1256bp的PCR片段，同样使用标准方法纯化。然后进行Gateway方法的第一个步骤BP反应，在此期间PCR片段在体内与pDONR201质粒重组，产生根据Gateway命名法的“进入克隆”p2777。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分从Invitrogen购买得到。
实施例2载体构建随后进入克隆p2777用来与用于稻转化的目的载体p0640进行LR反应。这个载体包含在T-DNA边界中植物选择性标记、可筛选标记以及旨在与已经克隆入进入克隆的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。组成型表达的稻GOS2启动子定位于Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将所得到的表达载体(如图2所示)(CDKD1；1::GOS2-上调)转化进入农杆菌，随后转化进入稻植物。让转化的稻植物生长，并检测实施例3中描述的参数。
实施例3评估和结果产生了大约15到20个独立的T0稻转化株。一代转化株从组织培养室转移到温室中生长，并收获T1种子。6个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。对于这些事件中的每一个，通过监控视觉标记的表达，选择了大约10个包含转基因的T1幼苗(异型和同型接合子)，和大约10个缺乏转基因的T1幼苗(无效接合子)。
统计分析t-检验和F-检验两因子的ANOVA(方差分析)用作统计模型，用于植物表型特征的综合评价。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行F测验。进行F测验以检查基因对所有转化事件的作用，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。显著的F测验值显示基因效应，意味着不仅仅是基因的存在或位置引起表型的差异。
为了检验事件中的基因效应即株系特异效应，在每个事件中用从转基因植物和相应无效植物采集的数据进行t-检验。“无效植物”或“无效分离子”为以与转基因植物相同的方式处理但转基因已经从中分离的植物。无效植物也可以描述为纯合的阴性转化体。t-检验的显著性阈值设置为10％的概率平准。在一个5种转化事件的总体中，一些事件可以低于或者高于这个t-检验阈值。这基于如下假设，即基因只在基因组的某些位置才具有效应，而且这种位置依赖性效应的发生是普遍的。这种类型的基因效应也已知为基因的株系效应(line effect)。通过比较t-值和t-分布或者备选地通过比较F-值和F-分布可以获得p-值。这时，p值代表无效假说(无效假说即“没有转基因效应”)正确的概率。
4.1营养生长测量将经选择的T1代植物(大约10株含转基因，大约10株不含转基因)转移至温室。每棵植物接受唯一的条形码标签来将表型数据与相应植物明确地关联。经选择的T1代植物在10cm直径的盆中在下列环境条件下在土上生长光周期＝11.5h，目光强度＝30,000勒克斯(lux)或以上，白天温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置彼此相邻地生长。从播种阶段到成熟阶段，每棵植物数次穿过数字成像箱(digital imaging cabinet)并照相。在每个时间点每棵植物至少从6个不同角度采集数字图像(2048×1536像素，1千6百万色彩(colours))。使用图像分析软件以自动方式从所有植物的所有数字图像得到下文所述参数。
4.1.1地上植物面积植物的地上面积通过计数地上植物部分排除背景后的像素总数测定。将这个值对在同一时间点从不同角度拍摄的图像平均，并通过校准将其转化为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明，这种方式测定的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。然后，T1代评估最好的3个株系在T2轮中进行评估。T2代评估的结果如下文表1所示。如表所示，其中一个株系与相应失效合子相比显示地上面积的统计学上显著增加(t-检验的p-值为0.0107)。
表1
每行对应一种事件，其中测定了转基因(TR)和无效株系(null)的地上面积，以单位形式表示。给出了阳性植物和阴性植物之间的数字差异(dif)以及这些植物之间的差异百分数(％dif)。P-值代表通过每种植物株系的t-检验产生的概率。最后一行给出所有事件的平均数。其中，p-值表示从F-检验得到的p-值。
4.2种子相关参数测量收获成熟的初级穗，装袋，进行条形码标记，然后在烘箱于37℃干燥3天。然后对穗脱粒，收集所有的种子并计数。使用鼓气装置，把饱满的谷壳从空谷壳中分离开。丢弃空谷壳，并对保留的部份再次计数。饱满的谷壳在分析天平上称重。该方法产生如下所述的种子相关参数组。
4.2.0饱满种子数饱满种子数通过在分离步骤后计数依然存在的饱满外壳数来测定。同样，T1代评估最好的3棵植物进行T2轮。T2代评估的结果如下文表2所示。如其所示，2个株系显示与相应的非转基因植物的饱满种子数相比转基因植物显著增加的饱满种子数。也存在总体基因效应，其通过F检验的显著性p值为0推断。
表2
每行对应一种事件，其中测定了转基因(TR)和无效株系(null)的饱满种子数，以单位形式表示。给出了阳性植物和阴性植物之间的数字差异(dif)以及这些植物之间的差异百分数(％dif)。P-值代表通过每种植物株系的t-检验产生的概率。最后一行给出所有事件的平均数。其中，p-值表示从F-检验得到的p-值。
4.2.1每棵植物的种子总产量种子总产量通过对植物收获的所有饱满外壳称重来测定。同样，T1代评估的3棵最好植物进行T2轮。T2评估的结果如下文表3所示。如其所示，2个株系显示与相应的非转基因植物相比转基因植物显著增加的种子重量。也存在总体基因效应，其通过F检验的显著性p值为0来推断。
表3
每行对应一种事件，其中测定了转基因(TR)和无效株系(null)的种子总重量，以单位形式表示。给出了阳性植物和阴性植物之间的数字差异(dif)以及这些植物之间的差异百分数(％dif)。P-值代表通过每种植物株系的t-检验产生的概率。最后一行给出所有事件的平均数。其中，p-值表示从F-检验得到的p-值。
4.2.3植物的收获指数本发明的收获指数定义为种子总产量和地上面积(mm2)的比率乘以因子106。T1代评估中最好的3棵植物进行T2轮，T2评估的结果如下文表4所示。如其所示，1个株系显示与对应的非转基因植物相比转基因植物增加的收获指数，t检验的p值为0。总体基因效应也很明显，F检验的p值为0。
表4
每行对应一种事件，其中测定了转基因(TR)和无效株系(null)的收获指数，以单位形式表示。给出了阳性植物和阴性植物之间的数字差异(dif)以及这些植物之间的差异百分数(％dif)。P-值代表通过每种植物株系的t-检验产生的概率。最后一行给出所有事件的平均数。其中，p-值表示从F-检验得到的p-值。
4.2.4千籽粒重(TKW)这个参数从已计数的饱满种子数和它们的总重量外推得到。T1代评估中最好的3棵植物进行T2轮，T2评估的结果如下文表5所示。如其所示，1个株系显示与对应的非转基因植物相比转基因植物增加的TKW，t-检验的p值为0.0455。
表5
每行对应一种事件，其中测定了转基因(TR)和无效株系(null)的TKW，以单位形式表示。给出了阳性植物和阴性植物之间的数字差异(dif)以及这些植物之间的差异百分数(％dif)。P-值代表通过每个植物株系的t-检验产生的概率。最后一行给出所有事件的平均数。其中，p-值表示从F-检验得到的p-值。
序列表序列表<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>产量增加的植物及其制备方法<130>CD-109-PCT<150>EP 04100841.5<151>2004-03-01<150>US 60/550,918<151>2004-03-05<160>5<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1256<212>DNA<213>拟南芥<400>1atggaacagc cgaagaaagt tgctgatagg tatctaaagc gagaggttct tggtcaaggt 60acttatggag tcgtcttcaa agctactgat acaaagaatg gagaaactgt agcgatcaag 120aaaataagac ttggtaaaga gaaagaaggt gtgaatgtaa cagctcttag agaaatcaaa 180ttacttaaag agcttaagca tccacatata attgagttga ttgatgcgtt tcctcacaag 240gagaatttgc acatcgtgtt tgagttcatg gagactgatc tcgaagcagt tatccgagat 300cgtaatctct atctttcgcc tggtgatgtc aaatcttacc tccaaatgat attgaaaggt 360cttgaatatt gccatggcaa atgggttctg cacagagata tgaagccaaa caacttgttg 420ataggaccca atggacagct gaaacttgca gattttgggt tagcacgtat atttggtagc 480ccaggtcgta agtttaccca ccaggtgttt gctagatggt atagagcacc tgaacttttg 540tttggtgcaa aacaatatga tggtgcagtt gatgtttggg ctgctggctg catttttgct 600
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50 55 60Leu Lys His Pro His Ile Ile Glu Leu Ile Asp Ala Phe Pro His Lys65 70 75 80Glu Asn Leu His Ile Val Phe Glu Phe Met Glu Thr Asp Leu Glu Ala85 90 95Val Ile Arg Asp Arg Asn Leu Tyr Leu Ser Pro Gly Asp Val Lys Ser100 105 110Tyr Leu Gln Met Ile Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Cys His Gly Lys Trp115 120 125Val Leu His Arg Asp Met Lys Pro Asn Asn Leu Leu Ile Gly Pro Asn130 135 140Gly Gln Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Phe Gly Ser145 150 155 160Pro Gly Arg Lys Phe Thr His Gln Val Phe Ala Arg Trp Tyr Arg Ala165 170 175Pro Glu Leu Leu Phe Gly Ala Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Val Asp Val180 185 190Trp Ala Ala Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu Leu Leu Arg Arg Pro Phe195 200 205Leu Gln Gly Asn Ser Asp Ile Asp Gln Leu Ser Lys Ile Phe Ala Ala210 215 220Phe Gly Thr Pro Lys Ala Asp Gln Trp Pro Asp Met Ile Cys Leu Pro
225 230 235 240Asp Tyr Val Glu Tyr Gln Phe Val Pro Ala Pro Ser Leu Arg Ser Leu245 250 255Leu Pro Thr Val Ser Glu Asp Ala Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Phe260 265 270Thr Tyr Asp Pro Lys Ser Arg Ile Ser Ile Gln Gln Ala Leu Lys His275 280 285Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Pro Ser Pro Thr Asp Pro Leu Lys Leu Pro290 295 300Arg Pro Val Ser Lys Gln Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Lys Leu Glu305 310 315 320Ala Ile Lys Val Leu Ser Pro Ala His Lys Phe Arg Arg Val Met Pro325 330 335Asp Arg Gly Lys Ser Gly Asn Gly Phe Lys Asp Gln Ser Val Asp Val340 345 350Met Arg Gln Ala Ser His Asp Gly Gln Ala Pro Met Ser Leu Asp Phe355 360 365Thr Ile Leu Ala Glu Arg Pro Pro Asn Arg Pro Thr Ile Thr Ser Ala370 375 380Asp Arg Ser His Leu Lys Arg Lys Leu Asp Leu Glu Phe Leu385 390 395<210>3
<211>2193<212>DNA<213>稻<400>3aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aggaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200
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<223>引物prm2676
<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggaa cagccgaaga aag 53<210>5<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm2677<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctataggaac tcgagatcaa gtt 5权利要求
1.相对于对应的野生型植物增加植物产量的方法，其包括向植物引入编码D-型细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKD)的核酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述增加的产量为增加的种子产量。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述增加的产量选自(i)植物的一个或多个部分的增加的生物量；(ii)增加的种子生物量；(iii)增加的(饱满)种子数；(iv)增加的种子大小；(v)增加的种子体积；(vi)增加的收获指数；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)。
4.根据权利要求1-3任意一项的方法，其中所述核酸编码CDKD或其功能性变体，并且其中所述核酸从植物获得。
5.根据权利要求1-4任意一项的方法，其中所述编码CDKD的核酸由SEQ ID NO1代表或者为其功能性变体，并且其中CDKD多肽由SEQID NO2代表或者为其功能性变体，所述功能性变体选自(i)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的部分；(ii)能够与SEQ ID NO1的序列代表的核酸杂交的序列；(iii)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的可变剪接变体；(iv)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的等位变体；和(v)SEQ ID NO2的序列代表的氨基酸的同源物、衍生物和活性片段。
6.根据权利要求1-5任意一项的方法，其中所述编码CDKD的核酸序列在植物中过量表达。
7.根据权利要求1-6任意一项的方法，其中所述编码CDKD的核酸的表达受组成型启动子驱动。
8.产生具有增加的产量的转基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物细胞引入CDKD编码核酸或其功能性变体；(ii)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
10.增加植物产量、尤其是增加种子产量的方法，其包括向植物中编码CDKD多肽或其功能性变体的基因的基因座中引入遗传修饰。
11.根据权利要求10的方法，其中所述遗传修饰通过下列方法之一实现位点定向诱变、同源重组、靶向诱导基因组局部突变技术(tilling)和T-DNA激活。
12.植物，其可以通过根据权利要求1-11任意一项的方法获得。
13.构建体，其包含(i)CDKD编码核酸或其功能性变体；(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选地(iii)转录终止序列。
14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列为组成型启动子。
15.植物，其用根据权利要求13或14的构建体转化。
16.具有增加产量的转基因植物，其特征为所述植物包含分离的编码CDKD的核酸或其功能性变体。
17.根据权利要求12、15或16的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物，例如甘蔗，或者其中所述植物为谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
18.根据权利要求12或15到17的任意一项的植物的可收获部分。
19.分离的编码CDKD的核酸或其功能性变体在增加产量、尤其是种子产量中的应用。
20.根据权利要求19的用途，其中所述种子产量包括一种或多种下列情况增加的饱满种子数、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的TKW。
21.根据权利要求19或20的用途，其中所述CDKD是SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性变体，或者其中所述CDKD为SEQ ID NO2代表的氨基酸或其功能性变体。
全文摘要
本发明涉及增加植物产量尤其是种子产量的方法，其包括向植物引入编码CDKD或其功能性变体的核酸。本发明也提供了通过本发明的方法产生的转基因植物，并且提供了用于本发明方法中的构建体。
文档编号A01H5/00GK1946848SQ200580012292
公开日2007年4月11日 申请日期2005年3月1日 优先权日2004年3月1日
发明者V·弗兰考尔德 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司