专利名称：化合物4－羟基倍半萜烯丙酯的农药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种瑞香狼毒活性物质在农药中的用途，属于农药领域。
背景技术：
由于化学农药长期不合理使用，带来了诸多弊端，如造成环境污染，对非靶标生物的直接毒害，害虫易产生抗药性等。近来年，随着IPM理论的实施、可持续发展战略的发展和人类对自身健康要求的提高，环境兼容性好、安全、低残留、经济的生物农药地研究与开发日益受到人们的重视，正逐渐为市场所接受。植物农药正成为创制新农药的研究热点。
瑞香狼毒(StellerachanlaejastneL.)，红狼毒、绵大戬、一把香、红火柴头、断肠草。蒙古名达伦-图茹。为瑞香科狼毒属植物，始载于《神农本草经》，与大戟科植物狼毒大戟，月腺大戟同作狼毒入药，其性味苦平、有毒，有逐水祛痰，破积杀虫之功效。民间用其水煎液治疗胃癌、肠癌、水气肿胀、淋巴结核、骨结核和肺结核等。近年来，狼毒已成为中国草地危害较为严重的植物之一。据报道，狼毒的根可以用来制成生物农药-植物杀虫剂，这种杀虫剂对害虫有触杀、熏蒸及胃毒作用。并且具有药效快，有效期长，高效低毒，无残留，不污染环境，不破坏生态平衡，无抗药性等优点。解庆珂报道用狼毒溶液喷雾，可防治菜青虫、蚜虫、大豆食心虫、棉红蜘蛛、夜盗虫、松峭蛾、松毛虫、松叶蜂等，用狼毒制剂还可杀蚊、驱蝇、灭蛆，对臭虫、虱子及跳蚤均有特效，可用来防治农作物、饲料牧草、果树、蔬菜及森林害虫。
瑞香狼毒提取物在农药领域的研究很多，比如张国洲等，但主要停留在乙醇提取物对菜粉蝶幼虫的触杀等，目前未见使用正己烷提取物的报道，且报道的的提取物活性成分部明确。目前，从瑞香狼毒中主要分得即黄酮类和香豆素类化合物；另外刘桂芳等从瑞狼毒中还分出β-谷甾醇，胡萝卜甙(Daucosterol)等化合物。冯宝民、裴月湖、韩冰，“瑞香狼毒化学成分研究”，沈阳药科大学学报，2000，17(4)，p258-259公开了鉴定的三个化合物，其中包括化合物A 1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮，但是没有指出该化合物的用途。
发明内容
本发明的技术方案在于提供一种瑞香狼毒正己烷提取物在杀虫农药中的用途。所述瑞香狼毒正己烷提取物中含有化合物A、B中的一种或多种。
化合物A1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮
化合物B4-羟基倍半萜烯丙酯
本发明还提供了以瑞香狼毒正己烷提取物、化合物A、化合物B为主要活性成分的农药。所述农药可以是由瑞香狼毒正己烷提取物为活性成分制备而成，它含有正己烷提取物2000～3000mg/L，或500～1000mg/L的化合物A；或1500～2000mg/L的化合物B。
其中，所述的正己烷提取物是由如下方法制备将瑞香狼毒根粉用7～15倍量无水乙醇浸泡、提取、浓缩，再以正己烷萃取、浓缩得正己烷提取物。
所述化合物A和/或B的制备方法如下其中固定相为硅胶H；
a、大柱粗分
固定相硅胶H；流动相用正己烷-乙酸乙酯(体积比为20~1∶1)、正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)；柱径12cm，常规湿法装柱，硅胶高度约15cm，以流程一中的正己烷萃取物为分离样品，每次上样量25g，流速10ml/min，梯度洗脱，分三段收集得大柱段1、段2、段3，各段用薄层检测并进行生物活性测定。活性较强部分作为下一步骤起始样品进一步细分。
b、中柱细分
固定相硅胶H，柱径5cm，常规湿法装柱，硅胶柱高约40cm，将活性较高的大柱粗分样品段2、段3上中柱，每次上样5g；流速2.5ml/min，流动相用正己烷-乙酸乙酯(体积比为10～1∶1)、正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为10∶10∶2)；梯度洗脱，分部收集，经薄层层析检测后合并Rf值相同流分，得到三个流分，中柱段1、段2、段3进行生物活性测定，选择生物活性高的流分，进行下一步柱层析细分。
c、小柱细分
固定相硅胶H，柱径3cm，常规湿法装柱，硅胶柱高约40cm，将活性最高的中柱样品段2上柱，每次上样2g；流动相用正己烷-乙酸乙酯(体积比为4∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)；梯度洗脱，经薄层层析检测后合并，用于生物活性测定，得小柱段2的生物活性最高。在段2中仍有2条谱带，改变洗脱剂条件无法分离，故采用反相柱层析进行下一步的分离。
d、反相硅胶柱分离
固定相反相硅胶，柱径2cm，常规湿法装柱，硅胶柱高约30cm，将活性最高的较纯的样品小柱段2上柱，每次2g；流动相甲醇-水-四氢呋喃(体积比为(10～20)∶(2～5)∶(3～7))、甲醇-四氢呋喃(体积比为1∶1)；梯度洗脱，经反相薄层检测后合并相同流分，浓缩得单一谱带样品A与B，反复改变溶剂条件进行薄层检测确定纯度。
本发明提供的瑞香狼毒正己烷提取物的制备方法中，乙醇渗透性强，易于渗入植物组织，有效组分提取完全，同时乙醇(尤其是热乙醇)溶解性能好，除此之外无水乙醇还有价格低廉、易于回收、对人体毒性小等突出优点，大规模提取时无疑是上选。瑞香狼毒根的正己烷萃取产物尚包括较多的组分，象这样复杂的化合物的分离比较麻烦，采用分段柱层析具有节约溶剂、硅胶、节省人力，分离效果较好等优点。首先进行大柱初分可以进行粗略分类，去除一些永久吸附杂质，实验表明，大柱初分对粗分提取物分段效果十分理想，一步即可将有效成分纯度提高4倍以上，同时样品体积的减少亦有利于下步的进一步纯化。中柱细分采用梯度洗脱，最后采用小柱的梯度洗脱，并且进行反相硅胶柱的分离得到纯品化合物A和B。
菜粉蝶Pieris rapae Linnaeus，英文名cabbage butterfly，俗名菜白蝶、白蝴蝶，幼虫别名菜青虫。属鳞翅目粉蝶科，对农业构成较大危害的菜青虫即是菜粉蝶的幼虫。菜青虫在啃食绿色蔬菜的叶片的同时，不仅造成缺口和虫粪污染，还传播大白菜软腐病等病菌，害虫高发期甚至可将蔬菜全部吃光，仅留叶柄，严重影响蔬菜质量。长期以来对这种害虫的防治，主要依赖化学农药，不但杀伤了大量天敌，且造成菜青虫抗药性增强，以至于不得不加大用药量与次数，形成恶性循环，造成蔬菜中农药残留量大，影响蔬菜质量，危及人体健康等。
试验证明，本发明提供的瑞香狼毒正己烷提取物稀释30倍时，72h内的对菜青虫校正死亡率为100％，触杀活性的致死中浓度(LC50)是812.1mg/L；在测试拒食率的时候，正己烷萃取物的拒食中浓度(AFC50)是4006mg/L，说明狼毒对菜青虫具有较强的毒杀和拒食活性。经过进一步分离获得了有效成分，化合物A1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮(1，5-Diphenyl-3-Hydroxy-1-Pentanone)，其对菜青虫的触杀活性为483.4mg/L(LC50)；和化合物B4-羟基倍半萜烯丙酯(4-Hydroxy-Sesquiterpene-Propylene-Es ter)，其对菜青虫的触杀活性为530.3mg/L(LC50)。
总之，本发明提供的农药药效快，有效期长，质量可控，为农业提供了一种高效低毒，无残留，不污染环境的新的选择，可防治菜青虫、蚜虫、大豆食心虫、棉红蜘蛛、夜盗虫、松峭蛾、松毛虫、松叶蜂等，还可杀蚊、驱蝇、灭蛆，对臭虫、虱子及跳蚤也有特效。
图1本发明瑞香狼毒提取物制备示意图2瑞香狼毒有效活性成分的分离纯化示意图3化合物A的1H核磁共振谱图4化合物B的1H核磁共振谱图。
具体实施例方式
实施例1瑞香狼毒提取物的制备及触杀活性测定
瑞香狼毒采自四川省若尔盖草原，采集回来的新鲜瑞香狼毒根洗净晒干，用粉碎机粉碎，得到绒毛状狼毒粉。
称取一定量瑞香狼毒根干粉，加入10倍质量的无水乙醇浸泡后提取浓缩，再分别以不同极性溶剂正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇作分级萃取，获得不同极性提取物，重复3次至萃取充分，合并相同萃取液。
根据张宗炳介绍的方法，同时采用拒食活性和触杀活性测定毒力首先在郊外未施用过农药的菜地中采集菜青虫，仔细挑选虫体大小适中的健康3龄个体供实验使用。
将所得样品与二甲基亚砜、乳油以1∶1∶2(质量比)的比例，用超声波充分乳化混匀，水稀释定容作为处理液，备用。对照液以双蒸水∶二甲基亚砜∶乳油＝1∶1∶2(质量比)的比例配制，水稀释定容备用。
测试萃取物对菜青虫的拒食活性将新鲜甘蓝叶片用圆形打孔器(直径2cm)打成叶碟，将处理液和对照液按梯度稀释。给处理组中的菜青虫饲喂处理液处理过的叶碟，对照组饲喂对照液处理过的叶碟。选用3龄菜青虫，每组20头虫，重复3次。将菜叶及菜青虫放入铺有滤纸的φ15培养皿中，合上养虫笼防止菜青虫爬失，置室温(25℃)，分别于处理后24h、48h和72h时观察，用坐标纸记录取食面积。
测试萃取物对菜青虫的触杀活性采用浸虫法，将试虫放于滤网中浸于按梯度稀释的处理液及对照液中，3s后取出，待虫体表面药液晾干，将试虫放于养虫笼中。均饲喂洁净甘蓝叶片。选用3龄虫，饥饿6h，每组20头虫，重复3次。分别于处理后24h、48h和72h观察，记录死亡情况。
活性结果见表1。并测定24h拒食率。
表1 不同SCEE萃取物对菜青虫的触杀、拒食活性
从表1可以看出，正己烷萃取物的触杀活性最高，72h致死中浓度(LC50)为812.1mg/L，甲醇萃取物其次在测试拒食率的时候，正己烷萃取物的生物活性最强，其次是氯仿萃取物，然后是甲醇萃取物、乙酸乙酯萃取物依次减弱。因此，下一步以正己烷萃取物为起点通过正相硅胶柱分离纯化。
实施例2瑞香狼毒灭虫活性物质的层析分离纯化
用薄层层析硅胶GF254作吸附层析固定相，在薄层自动铺板仪上按常规方法铺板。薄板尺寸5×10(cm)，硅胶厚度0.25mm。铺好的板子放入烘箱中105℃烘半个小时，冷却后存放在干燥器中待用。用点样毛细管点样，分别以正己烷、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等溶剂的不同组成不同比例的混和溶剂为展开剂展层，展层后以254nm紫外分析灯照射和碘粉蒸气、硫酸-乙醇显色三种方法结合检测谱带。选择分离效果好，不拖尾的溶剂条件供柱层析参考。
大柱粗分
大柱初分中，选择正己烷-乙酸乙酯(体积比为20∶1)作为起始洗脱剂，采用梯度洗脱，逐渐增加极性，至正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)。收集的各段洗脱流分经浓缩后，薄层检测及生物活性测定。
表2 大柱层析流分对菜青虫的触杀、拒食活性
段1约含有3条谱带，段2约含有3条谱带，段3约含有3条谱带，后两者有1条交叉谱带。生物活性测定结果表明，段2表现较好的活性，所以，合并段2、段3，进一步分离纯化。
中柱细分
采用正己烷-乙酸乙酯(体积比为10∶1、4∶1、1∶1)、正己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶1∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为10∶10∶2)；梯度洗脱，分部收集，分得3个流分，各流分经薄层检测及生物活性测定；段1约含有2条谱带，段2约含有3条谱带，段3约含有2条谱带。段1、段2有一条谱带交叉，而后两者也有一条谱带交叉。
活性结果如表3
表3 中柱层析流分对菜青虫的触杀、拒食活性
结果显示，段2具有较好的生物活性，继续进行小柱分离纯化。
小柱细分
采用正己烷-乙酸乙酯(体积比为4∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)，梯度洗脱，获得三个流分。各流分经薄层检测和生物活性测定，结果如下
表4 小柱层析流分对菜青虫的触杀、拒食活性
段1约含有1条谱带，段2有2条谱带，段3有2条谱带。段2、段3有交叉谱带。结合生物活性测定，将段2再上反相硅胶柱，进行一下步的分离提纯。
反相硅胶柱分离
采用甲醇-水-四氢呋喃(体积比为16∶4∶5)、甲醇-四氢呋喃(体积比为1∶1)；梯度洗脱，反相硅胶薄板检测，展开剂为甲醇-水-四氢呋喃(体积比为16∶4∶5)，检测结果如下
通过反相硅胶柱，从小柱的段2中又分离得到A、B两个纯品。测定生物活性结果如下
表5 样品A、B对菜青虫的触杀、拒食活性
由表5可知，两样品均显示了较好的杀虫活性，72h时，样品A触杀活性的致死中浓度(LC50)是530.3mg/L，；72h，样品B的触杀活性的致死中浓度(LC50)是483.4mg/L。同时，显示了较强的拒食活性。
实施例3活性物质结构鉴定
化合物A
化合物A为淡黄色油状物，易溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，紫外分析灯下在硅胶GF254薄层上呈蓝紫色斑点。波谱数据分析如下
Uv λmax(甲醇)nm283.0，309.0(弱)。紫外吸收峰309.0nm处的弱峰为(羰基)的n→π*跃迁，紫外吸收峰283.0为π→π*的跃迁。
IR νmax cm-13400.81(羟基，钝型峰)，3027.84(苯环氢)，2930.28，2858.62(饱和氢)，1682.26(羰基)，1598.67，1581.49，1496.20，1450.86，753.90，699.65(单取代苯环)。
1H-NMR(CDCl3，600Hz)δppm1.90(2H，dm)为4位H，δ2.83(2H，dm)，为5位H，δ3.13(2H，M)，为2位H，δ3.95(1H，m)为羟基H，δ4.25(1H，m)为3位H，δ7.19(1H，m宽q，)为4”位H，δ7.24(2H，宽q，)为2”，6”位H，δ7.30(2H，t)为3”，5”位H，δ7.47(2H，t，J＝7.8Hz)为3’，5’位H，δ7.59(1H，t，J＝7.8Hz)为4’位H，δ7.94(2H，t，J＝7.8Hz)为2’，6’位H。
(1)δ值
根据shoolery公式δ(CH2)＝0.23+∑δ，根据公式δ(苯环氢)＝7.27-ΣSi计算各H的化学位移值，再与实测值比较如下
表6.δ值比较
由上表可知，苯环氢化学位移实测值与计算值较为符合，由于羟基和羰基的影响，亚甲基以及次甲基上的氢均向低场移动，但都在各自化学位移之内。对于羟基氢，由于样品采用乙醇提取，因此可能与样品发生缔合，故使得谱图上出现裂分。
(2)J偶合及H个数
δ＝1.90处是两组多重峰，分别是4位的2个氢受5位2个氢及3位氢影响裂分；δ＝2.83处是两组多重峰，分别为5位氢的2个氢受4位2个氢和苯环上氢的影响裂分。δ＝3.13是四组双重峰，为2位氢受3位碳上氢以及苯环上的氢影响裂分，δ＝4.25为一组多重峰，为3位氢受2位和4位氢两种环境不同的氢影响而产生的多重裂分峰。芳环氢δ7.10～7.26处为2”，4”，6”H重叠在一起的宽峰，H个数为3，δ＝7.30处为3”，5”两个H受两旁H裂分为三重峰。δ7.47为3’，5’处受两旁H裂分的1∶2∶1三重峰，δ＝7.59为4’位受3’，5’两位2个H(A2系统)裂分的三重峰。δ＝7.94处位2’，6’H受3’或5’H裂分位1∶1的二重峰。
13C-NMR(CDCl3，400Hz)δppm31.807(C-5)，38.081(C-4)，44.976(C-2)，67.645(C-3)，107.919～178.415(12C，苯环上的C信号)，200.887(羰基碳)
13C具体分析
羰基碳化学位移值在200处，可以确定为酮基，印证了红外谱中的羰基峰。
根据公式δ(芳环C)＝128.5+ΣAi，δ(烷烃C)＝-2.6+ΣnijAj+ΣSi计算各碳的化学位移值，再与实测值比较，结果如下
表7δ值比较
由上表可知，各化学位移值与计算值较符合，由于受羰基和羟基的影响而稍有偏移，但却在各自化学位移的正常范围内。
根据质谱分析，得分子式为C17H18O2。不饱和度Ω
＝1+n4+(n3-n1+3n5)/2＝1+17-18/2＝9
综合光谱及波谱分析，化合物A为1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮，与通过有机合成的方法得到产品鉴定结果相同。
化合物B
化合物B为浅乳黄色晶体，易溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，在紫外灯下不显色，在碘蒸气和硫酸-乙醇溶剂中显色。波谱数据分析如下
Uv λmax(甲醇)nm208.0，285.0(弱)。可初步推测其中含有醛酮得羰基或共轭羰基。
IR νmax cm-13368.34，3306.58处有宽峰，(υ-OH伸缩振动峰，由于羰基间存在氢键，使谱带移向低频，并且峰形变宽)
2920.33，2853.16(υc＝C-H，S)，1711.63(υc＝O，S)，1463.69，1411.79，1379.10(δCH，m)，1258.50，1072.94(υc＝O，m)，723.96(δCH，w)
1H-NMR(CDCl3，600Hz)δppm0.89(m)为甲基氢，2.35(t)为
，受旁边亚甲基影响裂分为三重峰。在1.20～2.10处有多组峰，为亚甲基或次甲基氢的峰。
13C-NMR(CDCl3，400HZ)δppm179.408为
，129.237，127.991为双键碳。26左右为五元环以上环烷烃，14为甲基碳。
EI-MSm/z(％)根据同位素及M+离子分析，查Beyon表得分子式为C18H32O3.Ω＝1+n4+1/2(n3-n1+3n5)＝1+18-32/2＝3.有M-17[-OH(R)]，M-26[
]，M-45[
]
确定化合物B结构为4-羟基倍半萜烯丙酯(4-Hydroxy-Sesquiterpene-propylene-ester)，
实施例4本发明农药的制备
将本发明正己烷提取物100g与二甲亚砜、乳油以质量比1∶1∶2混合，用超声波充分乳化混合均匀，即得抗菜青虫农药。使用时用水稀释至33-50L，使提取物浓度为2000-3000mg/L左右。
实施例5本发明农药的制备
将本发明化合物12.5g与二甲亚砜、乳油以质量比1∶1∶2混合，用超声波充分乳化混合均匀，即得抗菜青虫农药。使用时用水稀释至12.5-25L，使化合物A的浓度为500-1000mg/L左右。
实施例6本发明农药的制备
将本发明化合物25g与二甲亚砜、乳油以质量比1∶1∶2混合，用超声波充分乳化混合均匀，即得抗菜青虫农药。使用时用水稀释至12.5-17L，使化合物B浓度为1500-2000mg/L左右。
综上所述，本发明提供的瑞香狼毒正己烷提取物、化合物A、化合物B等都对对菜青虫具有较强的毒杀和拒食活性，以其为杀虫活性物质的农药具有药效快，有效期长，质量可控的特点，为农业提供了一种高效低毒，无残留，不污染环境的新的杀虫农药选择。
权利要求
1、化合物B在杀虫农药中的用途，
化合物B 4-羟基倍半萜烯丙酯。
2、根据权利要求1所述用途，其特征在于所述的杀虫农药是抗菜青虫农药。
3、一种杀虫农药，它是由化合物B为活性成分制备而成，它含有150-2000mg/L的化合物B。
4、一种杀虫农药，它是由化合物A和化合物B为活性成分制备而成，它含有1500～2000mg/L的化合物B和500～1000mg/L的化合物A，
化合物A 1，5-二苯基-3-羟基-1-戊酮。
全文摘要
本发明提供了一种瑞香狼毒正己烷萃取物和进一步分离得到的活性化合物A、B在农药中的应用。以菜青虫为靶标昆虫，生物活性测试结果表明狼毒正己烷萃取物在稀释30倍时，对菜青虫72h内的校正死亡率为100％；化合物A1，5－二苯基－3－羟基－1－戊酮(1，5－Diphenyl－3－Hydroxy－1－Pentanone)，其对菜青虫的触杀活性为483.4mg/L(LC50)；和化合物B4－羟基倍半萜烯丙酯(4－Hydroxy－Sesquiterpene－Propylene－Es ter)，其对菜青虫的触杀活性为530.3mg/L(LC50)，这为进一步利用瑞香狼毒创制新型无公害植物农药奠定了基础。
文档编号A01N35/04GK1843114SQ20061007959
公开日2006年10月11日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者侯太平, 肖波, 张可君, 陈琳, 鲁韬 申请人:四川大学