专利名称：一种提高超声波破碎效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高超声波破碎效率的方法，适用于基因工程和细胞工程中的细胞破壁，从而利用胞内制药和提取活性物质。
背景技术：
现代生物制药产业中，为了提取微生物和藻类细胞内的活性物质，常常需要进行细胞破碎。在细胞破碎时，通常不用化学法或生物化学法，以免有外加化学物质污染目的产物，一般用物理或机械法。适用于实验室内小规模的细胞破碎的物理或机械法有French压榨法、珠磨法、超声波和冻融法。珠磨法中，在珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微珠，填充率为80％-85％。在搅拌浆的高速搅拌下微珠高速运动，微珠和微珠之间以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破碎过程中会产生大量的热能，因此，在实验设计中应充分考虑换热能力问题。
超声波破碎法是利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物和藻类的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程中会产生极大的热量，所以在实验中需在冰水中进行，防止胞内生化物质变性失活。
发明内容
将实验室中用于细胞破碎的两种方法——超声波破碎法和珠磨法联合使用，在超声波破碎的同时向破碎液中加入70-100目的经过预处理过的石英砂，使石英砂的填充率达到5％-10％，可以大大提高破碎效率，缩短破碎时间，降低能耗，同时，可以防止长时间超声波破碎时产生的大量热能使蛋白变性失活。
由于石英砂在制作过程中不同于实验室使用的其它药品，在使用石英砂之前应对石英砂做预处理，具体方法是用0.1mol/L的HCL反复冲洗石英砂3遍，后用蒸馏水调PH至中性，用超声波对石英砂进行超声处理至上清清澈，用75％的无水乙醇封存。使用前，将无水乙醇洗净并将PH值调至中性。使用后的石英砂在洗净后可以反复使用多次。
本专利技术主要应用于基因工程和细胞工程等技术等领域。
图1，加入石英砂的样品的破碎率明显增高。添加石英砂后，破碎6min时的细胞破碎率和不添加石英砂时破碎8min时的细胞破碎率相当。
图2，加入石英砂后，随着细胞破碎率的提高，蛋白质溶出率明显增高。但是在添加石英砂利不添加石英砂的样品中，破碎8min后，总蛋白含量均有下降。
具体实施例方式 实验1 取等量湿藻体溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，以50ml为一份，共配置等体积两分。向其中一份中加入适量石英砂，每隔一分钟取样一次，以细胞破碎率、上清中总蛋白含量研究石英砂对超声波破碎的影响。(图1、2) 实验2 取适量湿藻体溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，按每份总体积50ml配制9份。根据单因素实验，设石英砂添加量(A)、超声波功率(B)、破碎时间(C)和破碎液浓度(D)四个因素，每个因素下设3个水平，取L9(34)正交表进行实验，以细胞破碎率、上清中总蛋白含量对超声波破碎条件进行优化。具体实验方案如表1所示。
表1超声波破碎条件实验方案 根据表2、3可知，影响细胞破碎率的主次因素为A＞C＞D＞B，实验范围内最优条件为A3C3D3B3。
表2超声波破碎后细胞破碎率直观分析表 表3超声波破碎后细胞破碎率方差分析表 根据表4、5可知，影响总蛋白含量的主次因素为A＞C＞D＞B，实验范围内的最优实验条件为A3C3D3B2。
表4超声波破碎后总蛋白含量(μg/μl)直观分析表 表5超声波破碎后总蛋白含量方差分析表 实验3 取转人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的工程鱼腥藻，称适量溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，按每份总体积50ml配制2份，向其中一份中加入适量的石英砂。在两份样品的细胞破碎率达到93％时，用ELISA测定破碎后上清中的TNF-ct含量，以测定优化后的超声波破碎条件对目的蛋白的保护作用。
根据下表可知，在相同破碎条件下，添加石英砂后TNF-α的含量上升约17.5％。
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权利要求
1、提高超声波破碎效率的方法
在使用超声波破碎细胞时，向破碎液中加入适量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率。
2、超声波破碎条件优化
加入石英砂后，对超声波破碎条件进行优化，可以缩短破碎时间，在保证蛋白质活性的同时提高破碎效率。
全文摘要
本发明技术属于生物科学和生物技术等领域。在超声波破碎的同时，向破碎液中加入适量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率，缩短破碎时间，减少能耗，降低由于高温而使蛋白质变性失活的可能。本发明技术主要应用于细胞工程和基因工程中细胞破壁等领域。
文档编号B02C19/18GK101100642SQ20071005764
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月15日 优先权日2007年6月15日
发明者施定基, 轩 李, 丹 李, 悦 王, 赵兴贵, 宋冬辉 申请人:天津科技大学