2型糖尿病大鼠模型的制备方法

专利名称：：2型糖尿病大鼠模型的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物模型的制备方法，具体涉及一种2型糖尿病大鼠模型的制备方法。本发明制备的2型糖尿病大鼠模型可以用于分析2型糖尿病病理及进行2型糖尿病药物的筛选。
背景技术：
：糖尿病是一种古老而年轻的疾病，早在公元前，我国的《黄帝内经》就对其病因病症及治疗原则做了详细的论述。随着社会的发展、物质的丰富，绝大多数人的能量摄入由长期的相对不足，在短期内快速转变为相对过剩，而人类在长期能量供应不足的繁衍过程中所形成的以节约能量为主要使命的节约基因(thrifygenotype)却难于在短期内发生变化，仍然起着固有的作用，致使糖尿病的发病率直线上升，向当今年医学提出了产峻的挑战。糖尿病与心血管疾病的流行趋势相当，是现代疾病中的第二杀手，在各种疾病的死亡率中仅次于癌症。据国际糖尿病联盟UDF)统计，目前全世界有患糖尿病危险的人超过3亿，到2025年，糖尿病患病人数将从现在的1.94亿升至3.33亿，发展中国家的糖尿病人数将超过世界总糖尿病人数的75%。现在，2型糖尿病(T2DM)已经占到糖尿病患者的90%以上。T2DM患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏。T2DM的病理特征包括外周组织胰岛素抵抗以及胰腺P细胞分泌胰岛素的损伤，其表型包括高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、肝糖原合成不足及糖异生途径异常活跃等。一般认为，T2DM的发病除了遗传因素外，也与环境因素的诱导密切相关。但是，目前对于T2DM的机理还有很多不明之处，有待进一步研究。而适当的T7DM动物模型则是用于分析T2DM病理及进行胰岛素抗性研究，并进行T2DM药物筛选和鉴定治疗药物体内功效的临床前必需工具。以往多是通过手术和化学办法减少动物胰岛P细胞分泌胰岛素来建立糖尿病动物模型，特点是胰岛素分泌缺乏所致的高血糖和"三多一少症"(多饮、多食、多尿、消痩)，此类方式造成的高血糖动物更倾向于l型糖尿病UDDM)模型，而与T2DM的病理特征和临床特点相差甚远。现有的2型糖尿病动物模型多为遗传性自发性动物模型，发病率偏低，不能很好地模拟人体2型糖尿病的发病过程。目前制备T2DM大鼠模型的方法主要有3种1.应用小剂量(25mg/kg)链脲佐菌素(STZ)和高热量饲料给予成年大鼠的造模方法；2.中剂量STZ(30mg/kg)连续注射加高热量伺料给予成年大鼠的造模方法；3.给予出生后2天的新生雄鼠腹腔注射大剂量STZ(90mg/kg)的造模方法。但上述方法的造模时间普遍相对较长，而且一些方法制备的T2DM大鼠模型空腹血糖低，达不到临床诊断糖尿病的标准。
发明内容本发明的目的是提供一种2型糖尿病大鼠模型的制备方法，该方法制备的大鼠模型具有高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、胰岛素抵抗等2型糖尿病的典型症状，是较为理想的T2DM大鼠模型。本发明的2型糖尿病大鼠模型的制备方法是先用链脲佐菌素造成新生鼠胰岛P细胞对糖反应性下降，对断乳大鼠再次小剂量注射链脲佐菌素，造成胰岛轻度损伤，同时给予高糖高脂饮食诱导，使产生胰岛素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。本发明的2型糖尿病大鼠模型的具体制备方法包括以下步骤l.按照90mg/kg体重剂量向2d龄大鼠腹腔注射200mg/mL链脲佐菌素(STZ)溶液，哺乳喂养至断乳；2.按照25mg/kg体重剂量向断乳大鼠腹腔注射5mg/mL链脲佐菌素溶液；3.给予高糖高脂饮食词养，4-8周得到T2DM大鼠模型。本发明的2型糖尿病大鼠模型制备方法中，高糖高脂饮食饲料是由基础鼠词料加蔗糖、猪油和蛋黄组成的，其重量百分比例为猪油18%，蔗糖20%，蛋黄3%,基础鼠饲料59%。制成的高糖高脂饮食饲料总热量21.37kJ/g，蛋白质含量15%,碳水化合物含量51%，脂肪含量25%。其中，基础鼠飼料是由20%小麦粉、41%玉米粉、15%麸皮、20%豆粉、2%骨粉和2%鱼粉配制而成的，总热量为13.85kJ/g,蛋白质含量23%,碳水化合物含量50%，脂肪含量5%。胰岛素抵抗是T2DM发病机理的基本环节和显著特征之一，表现为胰岛素敏感性降低和胰岛素反应性降低。资料报道，小剂量STZ可引起大鼠糖耐量异常，若喂养正常饲料，则大鼠体重增长比正常大鼠慢；单纯喂养高热量词料，大鼠体重及脂肪组织虽有明显增加，但糖耐量正常；若大剂量STZ注射，大鼠易产生高血糖，再加高热量饲料喂养，则易死亡。很多实验已经证实，STZ注射和高热量饲料喂养是形成T2DM模型的重要条件。新生鼠P细胞破坏后，胰岛重建的来源为导管上皮、腺泡细胞和P细胞增生，其中出生3天增生力最强，7天后增生力恢复至平均水平。应用STZ会导致大鼠成年后P细胞数量相对减少，尤其是对糖反应性下降，从而使得葡萄糖刺激后胰岛素分泌不足。本发明吸取目前的T2DM造模经验，在用STZ造成新生鼠胰岛P细胞对糖反应性下降的基础上，给予高糖高脂饮食诱导胰岛素抵抗，同时再次小剂量注射STZ—次,造成胰岛轻度损伤，从而出现空腹血糖升高及脂质代谢紊乱等一系列糖尿病的表现，成功制备出了T2DM大鼠模型，并且缩短了造模时间，提高了模型的空腹血糖水平。釆用本发明的造模方法，模型成功率高(96.2%,76/79)，成模时间48周左右，比现在至少需要io周的成模时间相对缩短。应用生物化学指标以及形态学方法对造模大鼠进行测定，进一步验证了模型的真实性及可靠性。验证结果显示，T2DM大鼠模型空腹血糖增高，糖耐量下降，糖化血红蛋白增高，空腹胰岛素正常，胰岛素敏感性降低。血胆固醇和甘油三酯增高。光镜下T2DM大鼠胰岛面积与正常大鼠比较无差别，P细胞胞浆颗粒少，染色淡，晚期可出现T2DM特有的胰岛淀粉样变，并且电镜下P细胞胞浆内颗粒致密程度也出现降低。这些都与临床的T2DM生化改变以及形态学改变表现一致。可见该模型能够很好地用于T2DM的研究。图1为两组大鼠不同时间段体重变化情况，图中，--为正常对照组，-■-为T2DM组；图2为光镜下观察12周正常大鼠胰岛(放大倍数10x10);图3为光镜下观察12周T2DM组大鼠胰岛(放大倍数10x10);图4为光镜下观察24周正常大鼠胰岛(放大倍数10x10);图5为光镜下观察24周T2DM组大鼠胰岛(放大倍数10x10);图6为电镜下观察正常大鼠胰岛P细胞(放大10000倍)；图7为电镜下观察T2DM组大鼠胰岛P细胞(放大10000倍)。具体实施例方式一、实验材料l.主要药品及试剂盒链脲佐菌素(Str印tozotocin,STZ)，美国Sigma公司；枸橼酸盐，博士德公司；血清甘油三酯(TG)测试药盒、血清胆固醇(Tch)测试药盒，上海荣盛生物技术有限公司；血浆胰岛素试剂盒(放射免疫法)，法国CIS公司；糖化血红蛋白(微柱法)测定试剂盒，宁波市慈城生化试剂厂；Masson染色相关试剂，山西医科大学病理科；血糖试纸，美国强生公司；尿糖试纸，桂林中辉生物技术有限公司。2.主要仪器强生surest印plus血糖仪，美国强生公司；UV755B紫外可见分光光度仪，上海分析仪器总厂；LD4-2A台式离心机，北京医用离心机厂；TLL-C台式高速冷冻离心机，北京四环科学仪器厂；KJ-B快速漩涡混勻器，江苏省姜堰巿健康医疗器具有限公司；DK-600电热恒温水槽，上海益恒实验仪器有限公司；JEM-100CX型透射电子显微镜，日本电子株式会社。3.造模动物封闭群清洁级Wistar新生2d龄雄性大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供。二、模型制备方法1.动物模型的制备掷币法将2d龄大鼠分为正常对照组和T2DM组，正常对照组68只，T2DM组79只。将STZ用pH4.4,0.lmol/L的枸橼酸缓冲液配成200mg/mL溶液，T2DM组大鼠按照STZ90mg/kg体重进行腹腔注射，正常对照组未作处理。出生4周后大鼠断乳，将STZ用PH4.4，0.lmol/L枸橼酸缓冲液配成5mg/mL溶液，T2DM组大鼠按照25mg/kg体重剂量腹腔注射STZ,同时给予高糖高脂饮食饲养。正常对照组给予基础鼠饲料，并且腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。STZ均要求现用现配。2.饲料的配制基础鼠饲料的配制:小麦粉20%,玉米粉41%,麸皮15%,豆粉20%,骨粉2%，鱼粉2%。配好后用饲料成型机压成颗粒状。基础鼠饲料总热量13.85kJ/g，蛋白质含量23%、碳水化合物含量50%、脂肪含量5%。高糖高脂饮食饲料的配制由基础鼠饲料加蔗糖、猪油和蛋黄制成，比例为猪油18%,蔗糖20%，蛋黄3%,基础鼠饲料59%。将上述配料充分混匀后，用搅肉机成形，烤熟后，压制成形。高糖高脂饮食饲料的总热量为21.37kJ/g,蛋白质含量15%、碳水化合物含量51%、脂肪含量25%。3.测定指标及方法3.1—般状况两组大鼠分别在出生2天(2d)、断乳时(出生28天，记为O周)、高糖高脂饮食第4周、8周、10周、12周、16周、20周、24周测定其体重，观测饮水量，摄食量和尿量，并用尿糖试纸检测尿糖情况。3.2空腹血糖、糖耐量测定在大鼠断乳后4周测定所有正常对照组以及T2DM组大鼠空腹血糖值，随机选取12只正常对照组大鼠和35只T2DM组大鼠测定糖耐量。剪尾采血，血糖釆用强生血糖仪，直接将全血滴在配套的血糖试纸上测得。设定空腹血糖大于对照正常大鼠空腹血糖均值+3个标准差为空腹血糖符合造模标准。，3.3糖化血红蛋白测定剪尾取血，EDTA抗凝。利用阳离子交换树脂(Biorex70)层析微柱洗脱糖化血红蛋白，测定洗脱液中糖化血红蛋白和溶血物中总血红蛋白的吸光度，计算出糖化血红蛋白占总血红蛋白的苜分比。测定步骤①溶血物制备取20pLEDTA抗凝血加到300pL溶血剂中，摇匀，置于37X:水洛15min,除去不稳定的糖化血红蛋白。②微柱准备震荡微柱使树脂混悬，打开上盖，将微柱上端圆片轻压到载体面，微柱插入15mmxl00mL试管，摘掉下盖，让柱内缓冲液体完全流出。③层析用100pL微量移液器吸取溶血物加到微柱内树脂床上，待溶血物完全进入树脂床后，将微柱移到另一个15mmxlOOmL试管上，小心滴加3mL洗脱液，收集洗脱液作为糖化血红蛋白(GHb)管。另取100pL溶血物加到另一个15mmx150mL试管中，用15mL蒸馏水稀释，作为总的血红蛋白(Hb)管。④测定以蒸馏水为空白，在420nm波长下，分别测定GHb管和总Hb管的吸光度值A。⑤计算GHb%=AGHb+(AHbx5)x1003.4空腹血清胰岛素及胰岛素敏感性指数计算在高糖高脂饮食第4周和第16周时，随机选取正常对照和T2DM组大鼠各10只，第12周时随机选取正常对照和T2DM组大鼠各25只，剪尾取血测定空腹血糖和空腹胰岛素，空腹血糖为血糖仪试纸直接测出。空腹胰岛素为釆血后提取血清，由双抗体放射免疫分析法测定。胰岛素敏感性指数的计算取空腹血糖与胰岛素乘积倒数的自然对数为胰岛素敏感性指数，设定4周组正常大鼠的胰岛素敏感指数为1，计算相对胰岛素敏感性。3.5血胆固醇、血甘油三酯的测定在高糖高脂饮食第12周时，随机选取正常对照组和T2DM组大鼠各25只，内眦取血，测定血清总胆固醇含量和甘油三酯含量。3.6胰腺形态学观察在高糖高脂饮食第12周和第24周随机选取两组大鼠各6只，制备胰腺光镜标本及电镜标本，观察胰岛以及其中P细胞的形态变化。3.6.l胰腺光镜标本的制备①断头处死动物，迅速取出胰腺，盘带状巻曲，Bouin液固定。②Masson三色染色胰腺组织固定后，依照固定程序脱水，石蜡包块。切片后，常规脱蜡至水化。Masson复合染色液染色5min，0.2%醋酸水溶液稍作冲洗，5%磷钨酸染色5~10min,0.2°/。醋酸水溶液浸洗2次，2%苯胺蓝液染色5min,0.2%醋酸水洗2次。无水酒精脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。3.6.2胰腺电镜标本制备①断头处死动物，迅速取出胰腺，切成lmW小块，加预冷的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液2mL，于4。C固定2h;②用磷酸缓冲液冲洗；③ly。锇酸固定1.5h，逐级脱水；70%酒精饱和醋酸铀块染8~10h;⑤环氧树脂618包埋，于6(TC下聚合48h;⑥用瑞典LKB型超薄切片机制成半薄切片，观察到胰岛后，再切成50nm厚的切片置于铜制载网上干燥保存。三、统计分析方法采用SAS6.12统计软件进行双因素及单因素方差分析，结果用X士S表示，oc-O.05。四、制备的2型糖尿病大鼠模型验证1.各组大鼠一般状况正常对照组大鼠生长良好，体重持续增加。T2DM组大鼠在高糖高脂饮食饲养前10周平均体重与正常对照组大鼠相似，12周后T2DM组大鼠体重增长减慢，平均体重明显低于对照组，20、24周体重不再增高，甚至较前下降(图l)。观察还发现T2DM组大鼠摄食量、饮水量和尿量增多，尿膻味加重，因资料收集难以十分准确，未作统计。2.空腹血糖以及糖耐量测定结果断乳第4周测得正常对照组空腹血糖为3.76±0.97mmol/L,故本实验成模大鼠的空腹血糖确定为6.67mmol/L。造模大鼠中，有96.2%(76/79)达到要求。并且糖耐量测定表明正常对照组大鼠餐后血糖增高不明显，而T2DM组大鼠餐后30min、60min血糖水平明显增高，120min时血糖下降，但仍显著高于正常对照组(见表l)。在第4周和第16周的空腹血糖比较时发现，随着大鼠增龄，两组动物的空腹血糖均出现增高趋势(表2)。3.糖化血红蛋白测定结果糖化血红蛋白测定结果显示，正常大鼠的糖化血红蛋白值为1.64±0.08%，T^DM组中全部大鼠的糖化血红蛋白值(3.41士0.75%)超过了正常大鼠的平均值。表1高脂髙糖膳食饲养第4周两组大鼠糖耐量试验及糖化血红蛋白测定指标(X土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.空腹胰岛素和胰岛素敏感性测定结果分别在第4、第12、第16周测定了空腹胰岛素和胰岛素敏感性，结果显示T2DM组大鼠空腹胰岛素与正常对照组比较差异无显著性，而胰岛素敏感性降低(见表2，表3)，并且随着大鼠增齡，胰岛素敏感性减低。5.血胆固醇、甘油三酯测定结果'T2DM组大鼠在高糖高脂饮食12周后，血清总胆固醇和甘油三脂测定值显著高于正常对照组。_表2两组大鼠空腹血糖、空腹血清胰岛素及胰岛素敏感指数比较(X±S)_空腹血糖，咖ol/L空腹血清胰岛素nU/L胰岛素敏感性指数分组n-_fJ5_!1jI_U_!^j_1j_16周1.60±0.121.70±0.10对照组103.47±0.314.65±0.5511.78±2.7711.11±2.22,、，(1.0)(0.96)2,09±0.412,39±0.20T2DM组109.43±5.4315.08±5.6616.48±15.415.70±4.55,、(0.78)(0.70),45.2283.19858.886表3第12周两组大鼠血清甘油三酯、胆固醇、胰岛素及胰岛素敏感指数比较(文土S)分组n甘油三酯，咖ol/L胆固醇，mmol/L血清胰岛素pU/L胰岛素敏感性指数对照组250.87±0.311.711.2411.04±2.371-62±0響13(1.0)T2DM组251.20±0.552.911.7314.75±10.212.09±0.43(0.8)尸6.719.043.1458.8866.光镜下胰岛形态学变化Masson染色后，胰岛内ot细胞染成深红色，|3细胞染成浅红色，PP细胞为蓝色。光镜下观察发现两组大鼠在第12周和第24周时比较，从单个视野的胰岛数目，以及单个胰岛的面积看，两者均无显著性差异。24周时T2DM组大鼠与正常对照组比较发现，其单个胰岛内13细胞比例减少，胞浆染色淡，有淀粉样改变。(见图2、3、4、5)。7.电镜下P细胞形态学变化透射电镜观察发现，正常胰岛内P细胞占总数的60-80%，多位于胰岛中部，P细胞胞浆内可见大量致密的分泌颗粒(图6)。T2DM组大鼠胰岛内p细胞比例减少，细胞胞浆内分泌颗粒减少，密度减低(图7)。权利要求1、一种2型糖尿病大鼠模型的制备方法，是先用链脲佐菌素造成新生鼠胰岛β细胞对糖反应性下降，对断乳大鼠再次小剂量注射链脲佐菌素，造成胰岛轻度损伤，同时给予高糖高脂饮食诱导，使产生胰岛素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。2、根据权利要求1所述的2型糖尿病大鼠模型的制备方法，其特征是包括以下步骤a).按照90mg/kg体重剂量向2d龄大鼠腹腔注射200mg/mL链脲佐菌素溶液，哺乳喂养至断乳；b).按照25mg/kg体重剂量向断乳大鼠腹腔注射5mg/mL链脲佐菌素溶液；c).给予高糖高脂饮食饲养，48周得到T2DM大鼠模型。3、根据权利要求1或2所述的2型糖尿病大鼠模型的制备方法，其特征是所述的高糖高脂饮食饲料的重量百分比组成为猪油18%蔗糖20%蛋黄3%基础鼠饲料59%。4、根据权利要求3所述的2型糖尿病大鼠模型的制备方法，其特征是所述的基础鼠饲料的重量百分比组成为小麦粉20%玉米粉41%麸皮15%豆粉20%骨粉2%鱼粉2%。全文摘要一种2型糖尿病大鼠模型的制备方法，是先用链脲佐菌素造成新生鼠胰岛β细胞对糖反应性下降，对断乳大鼠再次小剂量注射链脲佐菌素，造成胰岛轻度损伤，同时给予高糖高脂饮食诱导，使产生胰岛素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。采用本发明方法制备的大鼠模型具有高空腹血糖、高胰岛素血症、糖耐量低减、胰岛素抵抗等2型糖尿病的典型症状，是理想的T2DM大鼠模型，并且缩短了造模时间，模型成功率高。文档编号A23K1/18GK101095958SQ20071006226公开日2008年1月2日申请日期2007年7月4日优先权日2007年7月4日发明者双卫兵,利张,王东文,高宏飞申请人:山西医科大学第一医院