脂肪酸的合成的制作方法

专利名称：：脂肪酸的合成的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性的酶，所述的酶可用于合成脂肪酸的方法中。
背景技术：
：绝大多数生物体内的脂肪酸生物合成的初级产物是16-碳和18-碳化合物。不过，不同物种之间的这些脂肪酸的链长度和不饱和程度的相对比例差别很大。例如，哺乳动物和昆虫主要产生饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而绝大多数高等植物产生具有一个、两个或3个双键的脂肪酸，后两者包含多不饱和脂肪酸(PUFA)。PUPA的两个主要家族是co-3脂肪酸(也表示为"n-3"脂肪酸)，其代表性实例为二十碳五烯酸(EPA,20:5，n-3);以及Q)-6脂肪酸(也表示为"n-6"脂肪酸)，其代表性实例为花生四烯酸(ARA，20:4,n-6)。PUFA是细胞质膜(主要为酯化的磷脂形式)以及脂肪组织甘油三酯的重要组分。细胞调节其膜中的不饱和程度的能力主要取决于脂肪酸去饱和酶的作用。去饱和酶这类酶在其脂肪酰基链底物的特定位置处引入不饱和键。去饱和酶这类酶通常对底物的链长度和脂肪酰基链中已有双键的位置均显示出相当大的选择性(ShanklinandCahoon，1998)，并可基于此点对其进行分类。对脂肪酸去饱和酶的另一种分类基于其底物的烃链与哪种部分发生酰化。去饱和酶识别与酰基载体蛋白、与辅酶A、或与脂质分子如磷脂相结合的底物(MurataandWada，1995;ShanklinandCahoon，1998》甘油脂中的脂肪酸去饱和作用对生物膜的正常功能至关重要。在棕榈酸或硬脂酸的A9位引入不饱和性给膜脂质提供了流动性，因此A9去饱和酶在活的系统中是普遍存在的。亚油酸(LA;18:2，A9,2)是通过A12-去饱和酶从油酸(18:1，A9)产生的，而oc-亚麻酸(ALA;18:3)是通过A15-去饱和酶从LA酸产生的。十八碳四烯酸(18:4，A6,9,12,15)和，亚麻酸(18:3，A6,9，12)是通过A6-去饱和酶分别从ALA和LA产生的。不过，哺乳动物不能在A9位之外去饱和，因此不能将油酸转换为LA。已经发现14种昆虫物种(deRenobales，1987)可自"C-乙酸酯从头产生亚油酸，提示存在天然的A12-去饱和酶活性。家蟋美洲蟋蟀04c/zetoAm^^w)的A12-去饱和酶活性是第一种被报道可利用油酰-辅酶A的此类酶(Cripps,1990)。不过，尽管付出了广泛的努力，仍没有鉴定到昆虫的负责将油酸转化为LA的基因。类似地，哺乳动物不能合成ALA。因此，动物的主要多不饱和脂肪酸是通过对膳食中的LA和ALA进行去饱和并延长而自膳食中得到的。其他的真核细胞，包括真菌、线虫和植物，具有在碳12和碳15位置处去饱和的酶。拟南芥0^06^/0;71^sp.)和大豆的膜相关性A12去饱和酶利用酰基脂质底物。较为少见地，可利用具有少见型特异性的去饱和酶首先在9位之外的其他位置对饱和脂肪酸迸行不饱和化。伞状花科(伞形科)、五加科和绞木科(Ganyaceae滩物的种子油中富含岩芹酸(顺式-6冲八碳烯酸)，可达到总脂质脂肪酸的85%(KleimanandSpencer,1982)。已经表征了来自芫荽子(芫荽(Cbn'a"&M附ra"vwm))的去饱和酶，其产生这种少见型脂质。一种定位于质体的酰基-酰基载体蛋白(ACP)A4去饱和酶作用于ACP-棕榈酸以产生顺式-4-十六碳烯酸，后者被从质体转移至发育的种子，并在种子内延长为顺式-6-十八碳烯酸(Cahoon等1992)。从英国常青藤(7/^/ra&//xL.)中得到了一种具有83%序列相同性的有关的去饱和酶，当在拟南芥中表达时，其产生顺式-4-十六碳烯酸和顺式-6-十八碳烯酸(WWttle等2005)。顺式-5-二十碳烯酸(C20:lA5)是白芒花(丄/w"朋/;^/6")和有关丄/w""Aas物种的种子油的主要成分。在荷包蛋花(丄.Awg/"w7)中负责产生这种少见型油的酶已经被鉴定为是酰基辅酶A-A5去饱和酶，其底物偏向性是花生酸(Cahoon等，2000)。在大豆胚芽中表达荷包蛋花A5去饱和酶和脂肪酸链延长酶(elongase)基因导致产生顺式-5画二十碳烯酸(C20:lA5)和顺式-5-二十二碳烯酸(C22:lA5)。Sayanova等(2007)已经鉴定了一种酰基辅酶A-A5去饱和酶，其与Zim"W/^sp.去饱和酶有关但其利用饱和脂肪酸(C16:0，C18:0)和不饱和脂肪酸(LA,ALA)来产生A5一烯酸和多不饱和脂肪酸。在动物中没有克隆到如昆虫中的编码类似的酶的基因。作为产生多种蛾性信息素过程的一个步骤，一些鳞翅目昆虫对与酰基辅酶A酯化的饱和脂肪酸(C16:0，C18:0)进行All去饱和作用(Rodriguez等2004)。在酿酒酵母CSacc/wraw^cescereWw'ae)中表达来自海灰翅夜蛾C^^/o/tera/故0/^//》的去饱和酶，使得当给该酵母细胞提供额外的饱和脂肪酸时，产生了C14:0、C16:0和C18:0的顺式-A11单不饱和产物(Rodriguez等2004)。此外，从提供给该酵母的豆蔻酸(C14:0)形成了反式-A11十四碳烯酸。All去饱和作用的一种次要的副产品是形成11-羟基十六垸酸或硬脂酸(高达总脂肪酸的0.1%)(Serra等，2006)。Moto等(2004)从蚕蛾的信息素腺中鉴定了一种双官能酰基辅酶A去饱和酶，其负责信息素前体分子的生物合成。该去饱和酶首先利用棕榈酸产生顺式-ll-十六碳烯酸，然后作用于该分子以除去烯丙型2H并形成共轭二烯脂肪酸(反式-A10,顺式-A12-十六碳二烯酸(trans-A10,cis-A12-hexadecendienoicacid)和一些反式-A10,反式12-十六碳二烯酸)，因此其同时具有顺式-All和结合酶去饱和酶活性。在新西兰巻叶螟CP/^o/oWAo"o)中，鉴定了来自信息素腺的去饱和酶，其在A10位置使得棕榈酸去饱和以形成顺式-A10-十六碳烯酸(Hao等2002)。现在广泛认为co-3LC-PUFA是对于人和动物健康十分重要的化合物，在人类膳食中添加co-3LC-PUFA例如EPA和DHA可带来多种与健康有关的益处。这些包括预防或减轻冠心病，高血压，2型糖尿病，肾病，类风湿性关节炎,溃疡性结肠炎，慢性阻塞性肺病，多种精神疾病例如精神分裂症，注意力缺陷多动症和阿尔茨海默氏病，并有助于脑的发育和生长(Simopoulos,2000)。这些脂肪酸可得自膳食来源或通过转化亚油酸(LA，co-6)或oc-亚麻酸(ALA,co-3)等脂肪酸人获得，亚油酸(LA,co-6)或ot-亚麻酸(ALA,co-3)均被认为是人类膳食的必需脂肪酸。尽管人类和许多其他脊椎动物能够将来自植物的LA或ALA转化为LC-PUFA，但该转化作用的速度极低。此外，大多数现代社会的膳食失衡，其中至少90%的多不饱和脂肪酸是0)-6脂肪酸，而不是4:1或更低的理想的to-6池-3脂肪酸比例(Trautwein，2001)。人类的LC-PUFA例如二十碳五烯酸(EPA，20:5)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)的直接膳食来源最主要的是鱼类或鱼油。健康专家因此建议将含有高水平LC-PUFA的鱼类规律纳入人类膳食。来自鱼类的LC-PUFA油越来越多地被加入到食品和婴儿配方中。不过，由于全球和国家水产业的下滑，因此需要给这些有益健康的油类找到替代性来源。脂肪酸也可以是羟化的，例如蓖麻油斷12-羟基冲八碳-顺式-9-烯酸)，其在来自蓖麻("c/m^commwm》的蓖麻油的脂肪酸中占到高达卯％，并且是重要的农业商品油。植物油中的其他有关羟化脂肪酸包括12-羟基-十八碳-顺式-9，顺式-15-二烯酸(densipolicacid)和14-羟基-二十-顺式-11,顺式-17-二烯酸(auricolicacid)。蓖麻属A12羟化酶作用于油酸脂质底物以产生蓖麻油酸；负责这一转化作用的去饱和酶基因与植物膜A12酰基脂质去饱和酶关系最为密切，但有不同(vandeLoo等1995)。Z^weW/a物种的种子油中存在高水平的与14-羟基-二十-顺式-ll-烯酸(lesquerolicacid)同源的C20羟化脂肪酸(Gunstone等，1994)。L/e"d/m'羟化酶基因己经被克隆并表达于拟南芥FAD2突变体，该突变体的种子中积聚了蓖麻油酸、lesquerolicacid和densipolicadd(Broun等1998)。植物和动物的鞘脂中存在可感知量的2-羟基脂肪酸，但它们同样作为较小的成分存在于种子油中，例如来自百里香(77^/m^v"/g"n》种子的2-羟基-十八碳-9,12，15-三烯酯，而2-羟基-油酸和亚油酸见于Sa/Wam7ofca(Smith,1971;BadamiandPatil，1981)。脂肪酸也可包含环氧基。最熟知的环氧脂肪酸是来自斑鸠菊属(F^"oWa)物种和五w;^orZ^/ag^cae的种子油的斑鸠菊酸(vemolicacid)(12，13-环氧基-十八碳-顺式-9-烯酸)(CuperusandDerksen，1996)。C.;^/a"""a的环氧化物酶基因与植物膜A12-油酸去饱和酶相关但有不同，该基因已经被功能性表征，并发现其利用亚油酸作为底物(Lee等1998)。在一些生物体中，通过结合酶产生了共轭脂肪酸(Crombie等，1984;Crombie等，1985;Fritsche等,1999;Cahoon等，2001;Qiu等，2001)。共轭脂肪酸如calendulicacid、桐油酸或石榴酸的生物合成如下进行，通过A12-去饱和酶将油酸去饱和为亚油酸，并通过特异性形成共轭三烯(conjutriene)的去饱和酶(结合酶)进一步去饱并结合Z9-或Z12-双键重排产生共轭三烯脂肪酸(conjutrienicfattyacid)。仍需要在重组细胞中产生脂肪酸以及更加高效产生脂肪酸的其他方法或产生新脂肪酸的方法。本说明书中对文献、法案、材料、装置、物品等等的任何讨论的目的仅在于提供本发明的背景。不应理解为承认它们的任何或全部如同在本申请各项权利要求的优先权日之前已经存在一样构成了现有技术基础或者是本发明所属
技术领域：
的公知常识
发明内容本发明人已经从鞘翅目和直翅目昆虫中鉴定到了一些新的酶，它们具有去饱和酶、结合酶、环氧化物酶、和/或羟化酶活性。因此，本发明提供真核细胞，其包含编码多肽的外源核酸，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有选自去饱和酶、结合酶、环氧化酶和羟化酶活性中的一或多种活性。在一个实施方式中，所述多肽可分离自鞘翅目或直翅目昆虫。可从中分离到所述多肽的昆虫物种包括，但不限于，拟谷盗属(7W&^m)、花萤属((^^//0^7^/21^)或蟋蟀(^￡^她)。在一个实施方式中，由所述外源核酸编码的多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:28、73禾卩/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA12去饱和酶活性。在另一个实施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的序列具有至少50°/。相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA5去饱和酶活性。在另一个实施方式中，所述多肽是-(i)包含SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或14(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA9去饱和酶活性。是本发明人首次鉴定了编码的酰基辅酶AA12去饱和酶的核酸。因此，本发明提供真核细胞，其包含编码酰基辅酶AA12去饱和酶的外源核酸。在一个实施方式中，酰基辅酶AA12去饱和酶包含(i)SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:28、73禾卩/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在一个实施方式中，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞而言，所述真核细胞含有水平升高的16:2卑12和/或18:2鄭12脂肪酸。在另一个实施方式中，所述真核细胞含有水平升高的与辅酶A酯化的16:2A，2和/或18:2A，2脂肪酸。本发明人还首次鉴定到了这样的酰基辅酶AA5去饱和酶，与多种其他底物相比，所述的酶对18:0和/或16:0脂肪酸底物具有偏向性。因此，在另一方面本发明提供真核细胞，其包含编码酰基辅酶AA5去饱和酶的外源核酸，其中所述去饱和酶对18:0和/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A"中的任意一个、两个、三个或全部。在一个实施方式中，酰基辅酶AA5去饱和酶包含(i)SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:18或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在另一个实施方式中，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞而言，所述真核细胞含有水平升高的16:lAS和/或18:lAS脂肪酸。在另一个实施方式中，所述真核细胞含有水平升高的与辅酶A酯化的16:lAs和/或18:lAs脂肪酸。本发明人还首次鉴定到了这样的酰基辅酶AA9去饱和酶，其对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的某些脂肪酸底物的活性。因此，在另一方面本发明提供真核细胞，其包含编码酰基辅酶A八9去饱和酶的外源核酸，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。在一个实施方式中，酰基辅酶AA9去饱和酶包含(i)SEQIDNO:23或SEQIDNO:74的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:23或SEQIDNO:74具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在一个具体的实施方式中，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞，所述真核细胞含有水平升高的14:1A9。在另一个实施方式中，所述真核细胞含有水平升高的与辅酶A酯化的14:1A9。优选地，包含所述外源核酸的真核细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一个实施方式中，所述真核细胞位于植物或植物种子内。优选地，所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。本发明的一个方面提供了用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的关联比其与SEQIDNO:135的关联更密切，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸分子之前的该细胞或无细胞表达系统是否被改变，以及(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。在另一方面本发明提供用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28、73、和域134中的一或多个序列具有至少50%的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸分子之前的该细胞或无细胞表达系统是否被改变，以及(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。在一个实施方式中，步骤(iv)包括选择一种核酸分子，其编码酰基辅酶AA12去饱和酶。在另一个实施方式中，所述改变的脂肪酸组成包含水平升高的16:2A9'A'2和/或18:2A9'A12。本发明还提供用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氮基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18和/或19中的一或多个序列具有至少50%的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸之前的所述细胞或无细胞表达系统是否被改变，和(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。在一个实施方式中，步骤(iv)包括选择一种核酸分子，其编码酰基辅酶AA5去饱和酶，其中所述去饱和酶对18:0禾口/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2MiA"中的任意一个、两个、三个或全部。在另一个实施方式中，所述改变的脂肪酸组成包含水平升高的16:1^和/或18:"5脂肪酸。本发明还提供用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多个序列具有至少50%的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸之前的所述细胞或无细胞表达系统是否被改变，和17(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。在一个实施方式中，步骤(iv)包括选择一种核酸分子，其编码酰基辅酶AA9去饱和酶，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0禾口/或18:0。在另一个实施方式中，所述改变的脂肪酸组成包含水平升高的14:1A9。在另一个实施方式中，由所述核酸分子编码的多肽是昆虫多肽或其突变体。本发明还提供基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA12去饱和酶。在一个实施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:28、73和/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段。本发明还提供基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA5去饱和酶，其中所述去饱和酶对18:0和/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A14中的任意一个、两个、三个或全部。在一个实施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:18和/或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段。本发明还提供基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA9去饱和酶，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和域18:0。在一个实施方式中，所述多肽是(i)包含具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:74的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:17和/或SEQIDNO:74中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。本发明还提供基本上纯化的多肽或重组多肽，其是(i)包含SEQIDN0:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有选自去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性的一或多种活性。优选地，所述多肽包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80禾H/或134中的一或多个序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述多肽可分离自鞘翅目或直翅目昆虫。优选地，所述多肽对脂肪酸的A2至A15位之任一位置处的碳-碳键具有去饱和酶活性。在一个实施方式中，所述多肽对C16或C18脂肪酸具有去饱和酶活性。在另一个实施方式中，所述多肽是还包含至少一种其他多肽序列的融合蛋白。本发明还提供分离的和/或外源多核苷酸，其包含-(i)选自SEQIDNO:l至15、67至72、79和133中的任一核苷酸序列，(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，(iii)与SEQIDNO:l至15、67至72、79和/或133中的一或多个序列具有至少50°/。相同性的核苷酸序列，和域(iv)在严格性条件下与(i)至(iii)之任一序列杂交的序列。还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。在一个实施方式中，所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。本发明还提供一种细胞，其包含本发明的重组多肽、本发明的外源多核苷酸和/或本发明的载体。优选地，细胞是植物、真菌、酵母、细菌或动物细胞。更优选地，细胞是真核细胞。本发明还提供产生本发明的多肽的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的多核苷酸。在一个实施方式中，所述方法还包括分离所述多肽。本发明还提供转基因非人类生物体，其包含本发明的细胞。在一个实施方式中，生物体是转基因植物。本发明还提供包含本发明的细胞的种子。本发明还提供一种油，其产自或得自本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子。在一个实施方式中，所述油包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1^，其中所述油中的18:1^的总量与18:0的总量之比在100:1和1:2之间，且其中所述油的脂肪酸包含低于10%或低于5c/。(w/w)的20:1A5。在另一个实施方式中，所述油的(:18脂肪酸有至少43%、或至少50%、或至少60%是18:^5。在另一个实施方式中，所述油的脂肪酸包含占所述油的总脂肪酸的百分比为至少3.0%(w/w)、或至少5Q/o(w/w)或至少10。/q(w/w)的18:1A5。在另一个实施方式中，所述油包含占所述油中的总脂肪酸的百分比为低于10°/。(w/w)、或低于5。/。(w/w)的18:3A9，A12'A15(ALA)。在一个实施方式中，所述油是通过从油料种子中提取油而得到的。本发明还提供一种油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1"，其中所述油中的18:1^的总量与18:0的总量之比在100:1和1:2之间，且其中所述油的脂肪酸包含低于10%或低于5。/。(w/w)的20:1A5。本发明还提供一种油，其包含脂肪酸，其中所述油的C18脂肪酸有至少43%、或至少50%、或至少60%是18:1A5。本发明还提供一种油，其包含脂肪酸，所述脂肪酸包含占所述油的总脂肪酸的百分比为至少3.0%(w/w)、或至少5Q/。(w/w)或至少10。/。(w/w)的18:1A5。在一个实施方式中，油包含占所述油中的总脂肪酸的百分比为低于10%(w/w)、或低于5。/。(w/w)的18:3A9'A12，A15(ALA)。本发明还提供脂肪酸，其产自或得自本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子。本发明还提供产生含不饱和脂肪酸的油的方法，所述方法包括从本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子中提取油。本发明还提供一种组合物，其包含本发明的细胞、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的油或本发明的脂肪酸。20本发明还提供包含本发明的油或本发明的脂肪酸的词料(Feedstuffs)、化妆品或化学制品。本发明还提供进行去饱和酶反应的方法，所述方法包括使与辅酶A酯化的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸底物接触本发明的多肽。本发明还提供基本上纯化的抗体或其片段，其特异性结合本发明的多肽。本发明还提供治疗或预防能从PUFA中获益的疾病的方法，所述方法包括给对象施用本发明的细胞、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的油、本发明的脂肪酸和/或本发明的饲料。在一个实施方式中，所述疾病是心律失常、血管成形术、炎症、哮喘、银屑病、骨质疏松、肾结石、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合征、注意力缺陷多动症、囊性纤维化、苯丙酮尿症、单相抑郁症、攻击性敌意(aggressivehostility)、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿尔茨海默氏病、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板聚集、消化道出血、子宫内膜异位、经期前综合征、肌痛脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼病。本发明还提供本发明的细胞、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的油或本发明的脂肪酸和/或本发明的饲料在制备用于治疗或预防能从PUFA中获益的疾病的药物中的用途。显而易见的是，本发明的一个方面的优选特征也适用于本发明的许多其他方面。在本说明书中，"包含"一词或其变化形式例如"包括"应理解为旨在纳入所提及的元件、整数或步骤或是元件、整数或步骤的组，但不排除任何其他的元件、整数或步骤或是元件、整数或步骤的组。下面通过以下非限制性实施例并结合附图进一步阐述本发明。图1.比较Tribdesat2b的由基因预测程序得到的核酸序列与其高保真RT-PCR产物的核酸序列。点表示序列相同，同时指出了不同的核苷酸。图2.比较Tribdesat3的由基因预测程序得到的核酸序列与其高保真RT-PCR产物的核酸序列。点表示序列相同，同时指出了不同的核苷酸。图3.比较Tribdesat6b的由基因预测程序得到的核酸序列与其高保真RT-PCR产物的核酸序列。点表示序列相同，同时指出了不同的核苷酸。图4.比较Tribdesat10的由基因预测程序得到的核酸序列与其高保真RT-PCR产物的核酸序列。点表示序列相同，同时指出了不同的核苷酸。图5.比较Tribdesat11的由基因预测程序得到的核酸序列与其高保真RT-PCR产物的核酸序列。点表示序列相同，同时指出了不同的核苷酸。图6.GC/MS痕量和色谱显示，Tribdesat10在拟南芥中产生亚油酸(18:2A9，A12)，以拟南芥Fadl/Fae2为对照。图7.A.来自表达A/D"DM的酿酒酵母的酵母脂肪酸甲酯的气相色谱(GC)。B.来自仅含载体的酿酒酵母的酵母脂肪酸甲酯的气相色谱(GC)。C.GC质谱法确认C16:2和C18:2产物的双键位置。图8.给予C14:0和C15:0的混合物后，对仅表达pYES2载体的酵母o/e/细胞(A)或表达存在于pXZP282中的美洲蟋蟀A12-去饱和酶的酵母o/e7细胞(B)进行GC分析。图9.代表性酰基辅酶A或酰基脂质去饱和酶蛋白质序列的系统发生分析。图10.代表性酰基辅酶A或酰基脂质去饱和酶蛋白质序列的系统发生分析。序列表说明SEQIDNO:l-拟谷盗属去饱和酶1的编码序列SEQIDNO:2"以谷盗属去饱和酶2a的编码序列SEQIDNO:3-拟谷盗属去饱和酶2b的编码序列SEQIDNO:4-拟谷盗属去饱和酶2c的编码序列SEQIDNO:5-拟谷盗属去饱和酶3的编码序列SEQIDNO:6-拟谷盗属去饱和酶4的编码序列SEQIDNO:7-拟谷盗属去饱和酶5的编码序列SEQIDNO:8-拟谷盗属去饱和酶6a的编码序列SEQIDNO:9-拟谷盗属去饱和酶6b的编码序列SEQIDNO:10"^谷盗属去饱和酶7a的编码序列22SEQIDNO:l1-拟谷盗属去饱和酶7b的编码序列SEQIDNO:12-拟谷盗属去饱和酶8的编码序列SEQIDNO:13-拟谷盗属去饱和酶10的编码序列SEQIDNO:14-拟谷盗属去饱和酶11的编码序列SEQIDNO:15-拟谷盗属去饱和酶12的编码序列SEQIDNO:16-拟谷盗属去饱和酶1的氨基酸序列SEQIDNO:17-拟谷盗属去饱和酶2a的氨基酸序列SEQIDNO:18-拟谷盗属去饱和酶2b的氨基酸序列SEQIDNO:19-拟谷盗属去饱和酶2c的氨基酸序列SEQIDNO:20-拟谷盗属去饱和酶3的氨基酸序列SEQIDNO:21-拟谷盗属去饱和酶4的氨基酸序列SEQIDN022-拟谷盗属去饱和酶5的氨基酸序列SEQIDNO:23-拟谷盗属去饱和酶6a的氨基酸序列SEQIDNO:24-拟谷盗属去饱和酶6b的氨基酸序列SEQIDNO:25-拟谷盗属去饱和酶7a的氨基酸序列SEQIDNO:26-拟谷盗属去饱和酶7b的氨基酸序列SEQIDNO:27-拟谷盗属去饱和酶8的氨基酸序列SEQIDNO:28-拟谷盗属去饱和酶10的氨基酸序列SEQIDNO:29-拟谷盗属去饱和酶11的氨基酸序列SEQIDNO:30-拟谷盗属去饱和酶12的氨基酸序列SEQIDNO:31-保守性昆虫去饱和酶序列SEQIDNO:32至66-寡核苷酸引物SEQIDNO:67-花萤属去饱和酶CL1的编码序列SEQIDNO:68-花萤属去饱和酶CL3的编码序列SEQIDNO:69-花萤属去饱和酶CL6的部分编码序列SEQIDNO:70-花萤属去饱和酶CL7的部分编码序列SEQIDNO:71-花萤属去饱和酶CL8的部分编码序列SEQIDNO:72-花萤属去饱和酶CL9的部分编码序列SEQIDNO:73-花萤属去饱和酶CL1的氨基酸序列SEQIDNO:74-花萤属去饱和酶CL3的氨基酸序列SEQIDNO:75-花萤属去饱和酶CL6的部分氨基酸序列SEQIDNO:76-花萤属去饱和酶CL7的部分氨基酸序列SEQIDNO:77—花萤属去饱和酶CL8的部分氨基酸序列SEQIDNO:78-花萤属去饱和酶CL9的部分氨基酸序列SEQIDNO:79-花萤属去饱和酶CN1的编码序列SEQIDNO:80-花萤属去饱和酶CN1的氨基酸序列SEQIDNO:81至103-寡核苷酸引物SEQIDNO:104至111-保守性去饱和酶基序SEQIDNO:112至122-去饱和酶序列内的组氮酸盒SEQIDNO:123至126—特征性基序SEQIDNO:127至130-寡核苷酸SEQIDNO:131和132—保守区SEQIDNO:133-美洲蟋蟀去饱和酶AdD12Des的编码序列SEQIDNO:134-美洲蟋蟀去饱和酶AdD12Des的氨基酸序列SEQIDNO:1354以南芥(Jra6Wop^Aa//a"a)FAD2A12去饱和酶发明详述通用技术除非另有说明，否则本说明书中所使用的科技术语均具有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学等领域)普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。除非另有说明，本发明所采用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术均为本领域人员所熟知的标准技术。此类技术在文献中有充分的描述和解释，例如参见J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984);J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989);T.A.Brown(编辑)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,Volumes1and2，IRLPress(1991);D.M.GloverandB.D.Hames(编辑)，DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4,IRLPress(1995and1996);和F.M.Ausubel等(编辑)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括迄今所有的更新版)；EdHarlowandDavidLane(编辑)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988);禾口J.E.Coligan等(编辑)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括迄今所有的更新版)，通过引用将上述文献并入本申请。选定的定义在本文中，术语"脂肪酸"指的是羧酸(有机酸)，通常具有长的脂肪族尾部，可以是饱和的或不饱和的。典型地，脂肪酸具有碳-碳键连接的链，其长度为至少8个碳原子，更优选地长度为至少12个碳。绝大多数天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有2个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以是游离状态的(非酯化的)或者是酯化的形式，例如作为甘油三酯、甘油二酯、单酰基甘油酯的部分、酰基辅酶A(硫酯)结合型或其他结合形式。脂肪酸可酯化为磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式。"饱和脂肪酸"在其链上不含有任何双键或其他官能团。术语"饱和"指的是氢，其中所有的碳(除羧基[-COOH]之外)均含有尽可能多的氢。换言之，o)端含有3个氢(CH3-)而链内的各个碳含有2个氢(-CH2-)。"不饱和脂肪酸"与饱和脂肪酸形式相似，不同之处为沿着链存在一或多个烯烃官能团，每一烯烃将链中的单键的"-CH2-CH2-"部分置换为双键的"-CH:CH-"部分(g卩，与另一碳双键连接的碳)。链中连接于该双键任一侧的2个相邻碳原子可以顺式或反式构型存在。在本文中，术语"单不饱和脂肪酸"指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少12个碳原子且链中仅有一个烯烃基。在本文中，术语"多不饱和脂肪酸"或TUFA"指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少12个碳原子和至少2个烯烃基(碳-碳双键)。通常，脂肪酸碳链的碳原子数涉及的是非分支碳链。如果碳链是分支的，则碳原子数不包括侧基碳原子。在一个实施方式中，长链多不饱和脂肪酸是co3脂肪酸，即脂肪酸自甲基端开始的第三个碳-碳键发生去饱和(碳-碳双键)。在另一个实施方式中，长链多不饱和脂肪酸是co6脂肪酸，即脂肪酸自甲基端开始的第六个碳-碳键发生去饱和(碳-碳双键)。在本文中，术语"长链多不饱和脂肪酸"或"LC-PUFA"指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少20个碳原子和至少2个碳-碳双键。在本文中，术语"去饱和酶"指的是这样的酶，其能够在脂肪酸底物的酰基中引入碳-碳双键，所述脂肪酸底物典型地是酯化的形式，例如是脂肪酸辅酶A酉旨。酰基可与磷脂例如磷脂酰胆碱发生酯化，或与酰基载体蛋白(ACP)发生酯化，或在优选的实施方式中与辅酶A发生酯化。相应地，去饱和酶通常可分为3类。在本文中，术语"A12去饱和酶"指的是这样的蛋白质，其所进行的去饱和酶反应导致在自羧基端起的第12位键处引入碳-碳双键，并且其在该位置处的去饱和作用强于任何其他位置。在一个实施方式中，A12去饱和酶活性包括油酰-辅酶AA12去饱和酶活性。在另一个实施方式中，A12去饱和酶活性包括棕榈油酰-辅酶AA12去饱和酶活性。这些脂肪酸可以是酯化的形式，例如作为磷脂的一部分。A12去饱和酶的实例包括包含SEQIDNO:28、78和134所示氨基酸序列的蛋白质。存在两种A12去饱和酶酰基辅酶AA12去饱和酶和酰基-PCA12去饱和酶，分别主要对连接于酰基辅酶A和酰基-PC的18:1底物有活性。不过，A9去饱和酶也对酰基-ACP(酰基载体蛋白)有活性。在本文中，术语"酰基辅酶AA12去饱和酶活性"或"酰基辅酶AA12去饱和酶"指的是这样的去饱和酶，其对酰基辅酶A底物的活性高于酰基-脂质(例如酰基-PC)禾tV或酰基-ACP底物。在一个实施方式中，活性至少高两倍。在本文中，"A5去饱和酶"指的是这样的蛋白质，其所进行的去饱和酶反应导致在自羧基端起的第5位键处引入碳-碳双键，并且其在该位置处的去饱和作用强于任何其他位置。在一个实施方式中，A5去饱和酶具有酰基辅酶A-硬脂酰A5去饱和酶活性。在另一个实施方式中，A5去饱和酶具有酰基辅酶A-棕榈酰A5去饱和酶活性。在一个实施方式中，A5去饱和酶催化对C20LC-PUFA的去饱和作用，将双高-Y-亚油酸DGLA转化为花生四烯酸(ARA，20:4co6)以及将ETA转化为EPA(20:5co3)。在本文中，术语"酰基辅酶AA5去饱和酶活性"或"酰基辅酶AA5去饱和酶"指的是这样的去饱和酶，其对酰基辅酶A底物的活性高于酰基-脂质(例如酰基-PC)和/或酰基-ACP底物。在一个实施方式中，活性至少高两倍。在本文中，"A9去饱和酶"指的是这样的蛋白质，其所进行的去饱和酶反应导致在自羧基端起的第9位键处引入碳-碳双键，并且其在该位置处的去饱和作用强于任何其他位置。A9去饱和酶活性的实例包括豆蔻酰-辅酶AA9去饱和酶活性、硬脂酰-辅酶AA9去饱和酶活性、棕榈酰-辅酶AA9去饱和酶活性、二十四酰-辅酶AA9去饱和酶活性和二十二酰-辅酶AA9去饱和酶活性。在本文中，术语"酰基辅酶AA9去饱和酶活性"或"酰基辅酶AA9去饱和酶"指的是这样的去饱和酶，其对酰基辅酶A底物的活性高于酰基-脂质(例如酰基-PC)和/或酰基-ACP底物。在一个实施方式中，活性至少高两倍。在本文中，术语"结合酶"指的是形成共轭三烯的去饱和酶。术语"环氧化酶"在本文中指的是这样的酶，其在脂肪酸中引入环氧基，产生环氧脂肪酸。在优选的实施方式中，环氧基被引入至脂肪酸链特别是C16或C18脂肪酸链的第2位和/或第12位碳。在本文中，"羟化酶"指的是这样的酶，其在脂肪酸中引入羟基，产生羟化脂肪酸。在优选的实施方式中，羟基被引入至C18脂肪酸链的第2位、第12位和/或第17位碳。在另一个优选的实施方式中，羟基被引入至C16脂肪酸链的第15位碳。术语"植物"包括整个植物、植物的结构(例如，叶、茎)、根、花等器官/组织、种子(包括胚、胚乳和种皮)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等等)、细胞和植物的子代。"转基因植物"、"遗传学修饰的植物"或其变体指的是这样的植物，其含有基因构建体("转基因")，该基因构建体在同样物种、品种或栽培变种的野生型植物中是不存在的。"转基因"在此具有生物
技术领域：
的通常含义，并包括通过重组DNA或RNA技术而产生或改变并被引入至植物细胞内的遗传学序列。转基因可包括源自植物细胞的遗传学序列。典型地，转基因已经通过人为操作而引入植物，例如通过转化，但也可采样本领域人员所知的任何方法。术语"种子"和"籽粒"在此可互换使用。"籽粒"通常指的是成熟的收获的籽粒，但根据上下文也可指吸涨或萌芽后的籽粒。成熟籽粒具有的含水量通常低于大约18-20%。"可操纵地连接"在本文中指的是两个或多个核酸(例如DNA)节段之间的功能性关系。典型地，其指的是转录调控元件(启动子)与被转录序列的功能性关系。例如，启动子可操纵地连接于编码序列，例如在此所述的多核苷酸，条件是其在合适的细胞内刺激或调变编码序列的转录。通常，可操纵地连接于被转录序列的启动子转录调控元件与被转录序列在物理上是连续的，27即，它们具有顺式作用。不过，某些转录调控元件，例如增强子，不需要与被增强转录的编码序列在物理上连续或位于与之十分接近的位置。在本文中，术语"基因"取其最广泛的含义，并包括脱氧核糖核苷酸序列，后者包含结构基因的蛋白质编码区、并包括邻近所述编码区且位于距所述编码区5'和3'端之任一端至少大约2kb距离处的序列，所述序列参与该基因的表达。位于编码区5'端且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区3'端或下游且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语"基因"涵盖cDNA和基因组形式的基因。基因的基因组形式或克隆含有被非编码序列中断的编码区，这些非编码序列称为"内含子"或"干扰区"或"干扰序列"。内含子是被转录至核RNA(hnRNA)内的基因节段；内含子可含有调控元件例如增强子。内含子要自核转录产物或初级转录产物去除或"剪切掉"，因此信使RNA(mRNA)转录产物内没有内含子。mRNA的功能是在翻译过程中确定新生多肽内的氨基酸序列或次序。术语"基因"包括编码全部或部分在此所述的蛋白质的合成分子或融合分子以及上述任一的互补核苷酸序列。在本文中，术语"可自...分离"指的是该多核苷酸或被编码的多肽是由生物体、特别是昆虫天然产生的。多肽服"基本上纯化的多肽"或"纯化的多肽"指的是这样的多肽，其通常已经与天然状态下与之结合的那些脂质、核酸、其他的肽以及其他污染分子分离。优选地，基本上纯化的多肽至少60%、更优选地至少75%、且更优选地至少90%不含与之天然结合的其他成分。术语"重组"当涉及多肽时指的是，当所述多肽由细胞或者无细胞表达系统产生时，与其天然状态相比，所述多肽产生的量或速度发生改变。在一个实施方式中，细胞在天然状态下不产生所述多肽。不过，细胞可包含使得产生的所述多肽的量发生改变的非内源性基因。本发明的重组多肽包括尚未自产生它们的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统中分离的多肽，也包括在此类细胞或无细胞系统中产生并随后自至少某些其他成分中纯化出来的多肽。术语"多肽"和"蛋白质"通常可互换使用。多肽的百分比相同性通过GAP(NeedlemanandWunsch,1970)分析(GCG程序)确定，其中缺口创建罚分=5，而缺口延伸罚分=0.3。查询序列长度为至少15个氨基酸，且GAP分析在至少15个氨基酸的区域比对两个序列。更优选地，查询序列长度为至少50个氨基酸，且GAP分析在至少50个氨基酸的区域比对两个序列。更优选地，査询序列长度为至少IOO个氨基酸，且GAP分析在至少100个氨基酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，查询序列长度为至少250个氨基酸，且GAP分析在至少250个氨基酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析比对两个序列的全长。在此，"生物学活性"片段是本发明的多肽的一部分，其保持该全长多肽的所定义的活性，即具有去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性。生物学活性片段可以是任何长度，条件是它们保持所定义的活性。优选地，生物学活性片段保持全长蛋白质活性的至少10%。就所定义的多肽/酶而言，可以理解高于上述数值的百分比相同性是优选的实施方式。因此，在适用的情况下，就最小的百分比相同性数值而言，优选地所述多肽/酶包含这样的氨基酸序列，其与相应的指定SEQIDNO具有至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90°/。、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、且甚至更优选地至少99.9%的相同性。就本发明的酰基辅酶AA5去饱和酶而言，这是首次证实动物的去饱和酶可产生5-十六碳烯酸和5-十八碳烯酸并以酰基辅酶A脂肪酸作为底物。就本发明的酰基辅酶AA12去饱和酶而言，这是首次通过动物天然产生的酶证实了A12去饱和酶活性。此外，这是首次证实去饱和酶可产生亚油酸并以酰基辅酶A脂肪酸作为底物。本发明的多肽的氨基酸序列突变体可通过在本发明的核酸内引入合适的核苷酸改变或通过体外合成所需多肽而制备。此类突变包括，例如，氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可通过缺失、插入和取代的组合而获得最终的构建体，条件是最终的肽产物具有所需的特征。29可通过本领域所知的任何技术制备突变的(改变的)肽。例如，可对本发明的多核苷酸进行体外诱变。此类体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适的载体内，将载体转化到"增变株(mutator)"菌株如大肠杆菌(五.XL-1red(Stmtagene)内并将转化的细菌增殖合适的代数。在另一个实例中，对本发明的多核苷酸进行DNA重排，参见Harayama(1998)。可采用在此所述的技术容易地筛选源自突变的/改变的DNA的产物以确定它们是否具有去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性。在设计氨基酸序列突变体时，突变的位置和突变的性质取决于要修饰的特征。可单个地或系列地修饰突变位点，例如通过(l)先选择保守性氨基酸进行取代，然后根据所得结果进行更加激进的选择，(2)缺失靶残基，或(3)在邻近被定位的位点处插入其他残基。氨基酸序列缺失通常为大约1至15个残基，更优选地大约1至10个残基，且典型地为大约1至5个连续的残基。取代突变是去除多肽分子内的至少一个氨基酸残基并在该处插入一个不同的残基。取代诱变的最感兴趣的位点包括那些被鉴定为是活性位点的位点。感兴趣的其他位点是那些在各种菌株或物种之间均相同的特定残基。这些位置可能对生物学活性十分重要。这些位点，特别是那些具有至少3个其他同等保守的位点的序列内的位点，优选地以相对保守的方式进行取代。表1在"示例性取代"一栏给出了此类保守性取代。表h示例性取代<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在优选的实施方式中，与天然存在的多肽相比，突变体/变体多肽具有1或2或3或4个保守性氨基酸改变。表1给出了保守性氨基酸改变的详情。在优选的实施方式中，所述的改变不出现于以下一或多个基序中AGAHRLW、SETDAD、FFFSHVG、QKKY、NSAAH、GEGWHNYHH、PWDY和GWAY。在一个特别优选的实施方式中，以下每一个基序中均不出现所述改变AGAHRLW、SETDAD、FFFSHVG、QKKY、NSAAH、GEGWHNYHH、PWDY和GWAY。本领域人员能够理解，可以合理地预期此类少数的改变不会改变在重组细胞内表达的所述多肽的活性。此外，如果需要，可以取代或添加的形式将非天然氨基酸或化学氨基酸类似物引入本发明的多肽。此类氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、ct-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、J3-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者氨基酸例如卩-甲基氨基酸、Ccx-甲基氨基酸、Not-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。本发明也包括在合成过程中或合成之后被差异性修饰的本发明的多肽，例如通过生物素化、苄化作用、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生作用、蛋白裂解、连接于抗体分子或其他细胞配体等等。这些修饰可提高本发明的多肽的稳定性和/或生物活性。可以多种形式产生本发明的多肽，包括产生和回收天然多肽、产生和回收重组多肽以及化学合成所述多肽。在一个实施方式中，如下产生分离的本发明的多肽，在有效产生所述多肽的条件下培养能够表达所述多肽的细胞，并回收所述多肽。用于培养的优选的细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但不限于，允许多肽产生的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效的培养基指的是可将细胞培养于其中以产生本发明的多肽的任何培养基。该培养基典型地包含具有可同化的碳源、氮源和磷酸源以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养物如维生素的水性培养基。本发明的细胞可培养于常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定板和培养皿中。可在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量进行培养。此类培养条件是本领域人员熟知的。多核苷酸"分离的多核苷酸"指的是这样的多核苷酸，其通常已经与天然状态下与之结合或连接的那些多核苷酸序列分离。优选地，分离的多核苷酸至少60%、更优选地至少75%、且更优选地至少90%不含与之天然结合的其他成分。此外，术语"多核苷酸"在此与术语"核酸分子"、"基因"和"mRNA"互换使用。术语"外源性"当涉及多核苷酸时指的是，当所述多核苷酸存在于细胞或者无细胞表达系统中时，与其天然状态相比，所述多核苷酸的量发生改变。在一个实施方式中，所述细胞天然条件下不包含所述多核苷酸。不过，所述细胞可包含导致所编码的多肽产生的量发生改变的非内源性多核苷酸。本发明的外源多核苷酸包括尚未与它们存在于其中的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统中的其他成分分离的多核苷酸，也包括在此类细胞或无细胞系统中产生并随后自至少某些其他成分中纯化出来的多核苷酸。外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的一段连续的核苷酸，或是包含由来自不同来源的(天然存在的和/或合成的)两或多段连续的核苷酸连接形成的单一多核苷酸。典型地，此类嵌合多核苷酸至少包含编码本发明的多肽的开放读框，该开放读框可操纵地连接于适合在感兴趣的细胞中驱动所述开放读框转录的启动子。"多核苷酸"指的是寡核苷酸、多核苷酸或或任何片段。其可以是基因组来源的或合成的DNA或RNA、双链的或单链的、并可与糖类、脂质、蛋白质或其他物质组合以行使在此所述的特定活性。多核苷酸的百分比相同性通过GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)确定，其中缺口创建罚分=5，而缺口延伸罚分=0.3。查询序列长度为至少45个核苷酸，且GAP分析在至少45个核苷酸的区域比对两个序列。优选地，查询序列长度为至少150个核苷酸，且GAP分析在至少150个核苷酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，查询序列长度为至少300个核苷酸，且GAP分析在至少300个核苷酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析比对两个序列的全长。就所定义的多核苷酸而言，可以理解高于上述数值的百分比相同性是优选的实施方式。因此，在适用的情况下，就最小的百分比相同性数值而言，优选地所述多核苷酸包含这样的多核苷酸序列，其与相应的指定SEQIDNO具有至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、且甚至更优选地至少99.9%的相同性。本发明的多核苷酸可在严格性条件下与编码本发明的多肽的多核苷酸选择性杂交。在本文中，在严格性条件下指的是(l)采用低离子强度和高洗涤温度，例如，0.015MNaCl/0.0015M拧檬酸钠/0.1%NaDodS04，500C;(2)杂交过程中采用变性剂例如甲酰胺，例如，50。/。(vol/vol)甲酰胺含0.1%牛血清白蛋白，0.1%Ficoll，0.1%聚乙烯吡咯垸酮，50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)含750mMNaCl，75mM拧檬酸钠，42GC;或(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M拧檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1%焦磷酸钠，5x登哈特溶液，超声处理的鲑精DNA(50g/ml)，0.P/。SDS和10。/。硫酸葡聚糖，42QC，在0.2xSSC和0.1。/。SDS中。与天然存在的分子相比，本发明的多核苷酸可具有一或多个突变，其可以是核苷酸残基的缺失、插入、或取代。突变体可以是天然存在的(即分离自天然来源)或合成的(例如，通过在上述核酸上进行定点诱变或DNA重排)。因此，本发明的多核苷酸显然可以是天然存在的或重组的。本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或其中任一的衍生物。所述寡核苷酸的最小长度是寡核苷酸与本发明的多核苷酸的互补序列之间形成稳定杂交体所需的长度。优选地，寡核苷酸的长度为至少15个核苷酸、更优选地至少18个核苷酸、更优选地至少19个核苷酸、更优选地至少20个核苷酸、甚至更优选地至少25个核苷酸。本发明的寡核苷酸可用作，例如，鉴定核酸分子的探针，或产生核酸分子的引物。用作探针的本发明的寡核苷酸典型地缀合于标记物，例如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。重组载体本发明的一个实施方式包括重组载体，其包含至少一种本发明的分离的本发明的核苷酸分子，所述核苷酸分子插入至能够将所述多核苷酸分子输送至宿主细胞内的任何载体内。所述载体含有异源多核苷酸序列，即所述多核苷酸序列天然情况下不与本发明的核苷酸分子邻近，且优选地其所来源的物种不同于所述多核苷酸分子所来源的物种。载体可以是RNA或DNA，真核细胞的或原核细胞的，且典型地是转座子(例如参见美国5,792,294)、病毒或质粒。一类重组载体包含可操纵地连接于表达载体的本发明的核苷酸分子。术语"可操纵地连接"指的是多核苷酸分子插入至表达载体内的方式使得转化至宿主细胞内之后所述分子能够表达。在本文中，表达载体是DNA或RNA载体，其能够转化宿主细胞并实现特定多核苷酸分子的表达。优选地，表达载体还能够在宿主细胞复制。表达载体可以是原核细胞的或真核细胞的，且典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞内有功能(即，指导基因表达)的任何载体，宿主细胞包括细菌、真菌、内寄生物、节肢动物细胞、动物细胞和植物细胞。本发明的特别优选的表达载体可指导基因在酵母和/或植物细胞内表达。具体而言，本发明的表达载体含有调控序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和与重组细胞具有相容性并控制本发明的核苷酸分子表达的其他调控序列。具体而言，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录起始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏物序列。合适的转录控制序列包括能够在至少一种本发明的重组细胞中起作用的转录控制序列。各种各样的此类转录控制序列是本领域人员已知的。特别优选的转录控制序列是那些在植物中具有转录指导活性的启动子，根据所使用的植物或其部分，可以是组成型的或具有阶段和/或组织特异性。植物启动子包括，但不限于，表现组成型表达的启动子，例如花椰菜花叶病病毒(CaMV)的35S启动子，果实特异性表达启动子，例如来自番茄的聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子。本发明的重组分子还可含有(a)分泌信号(g卩，信号节段核酸序列)，以便使得已经表达的本发明的多肽能够自产生所述多肽的细胞分泌，和/或(b)融合序列，其导致本发明的核酸分子以融合蛋白的形式表达。合适的信号节段的实例包括能够指导本发明的多肽的分泌的任何信号节段。优选的信号节段包括，但不限于，黄花烟草(Mco"a憩"ecton'")信号肽(美国5,939,288)、烟草延伸信号、大豆油质蛋白油体结合蛋白信号。此外，可将本发明的核酸分子结合于将所编码的多肽导向蛋白体的融合节段，例如遍在蛋白融合节段。重组分子还可包括位于本发明的核酸分子的核酸序列周边和/或内部的干扰序列和/或非翻译序列。宿主细胞本发明的另一个实施方式包括重组细胞，其包含用一或多种本发明的重组分子转化的宿主细胞。可通过任何方法将多核苷酸分子转化至细胞内，所述方法可将多核苷酸分子插入至细胞内。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、微注射、脂染、吸附和原生质体融合。重组细胞可保持单细胞状态或可生长为组织、器官或多细胞生物体。经转化的本发明的核苷酸分子可保持在染色体外或可整合至被转化(即，重组)细胞的染色体内的一或多个位点，使得其能够被表达。用于转化的合适的宿主细胞包括任何可用本发明的多核苷酸转化的细胞。本发明的宿主细胞可内源性地(即，天然地)具有产生本发明的多肽的能力，或可在经至少一种本发明的核苷酸分子转化之后能够产生所述多肽。本发明的宿主细胞可以是任何能够产生至少一种本发明的蛋白质的细胞，并包括植物细胞、细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫和节肢动物细胞。优选地，宿主细胞是植物细胞、节肢动物细胞或酵母细胞。节肢动物细胞的非限制性实例包括昆虫细胞，例如草地夜蛾OS/ocfoptera戶"g^Wa)(Sf)细胞，如Sf9、Sf21、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞和果蝇S2细胞。可用作本发明的宿主细胞的细菌细胞的实例是聚球藻属C^恥c/w"w)也称集胞藻属(办"ec/zoc^&)物种，例如细长聚球藻C^"ec/20cocc^35细胞可以是适合于发酵方法的生物体。在本文中，术语"发酵方法"指的是任何发酵方法或包括发酵步骤的方法。发酵方法包括，但不限于，用于生产以下物质的发酵方法醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、甲叉丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和C02);抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、P-胡罗卜素)；和激素。发酵方法还包括消费性酿酒业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如发酵乳产品)、皮革业和烟草业所使用的发酵方法。优选的发酵方法包括醇类发酵方法，这是本领域人员所熟知的。优选的发酵方法是厌氧发酵方法，这是本领域人员所熟知的。合适的发酵细胞，典型地是微生物，能够将糖例如葡萄糖或麦芽糖直接或间接发酵为(即转化为)所需的发酵产物。发酵微生物的实例包括真菌生物体，例如酵母。在本文中，"酵母"包括酵母属物种，酿酒酵母，卡尔酵母(Sacc^ra/^casca/^^gera/力、假丝酵母属物种、克鲁维酵母属物种(义/"vera/^casspp.)、毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、木霉属物种、斯氏油脂酵母(h》omycM"wfe力和解脂耶氏酵母(Fa;roWa印o/^ca)。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。商品化的酵母包括，例如RedStar/LesaffreEthanolRed(获自RedStar/Lesaffre,USA)、FALI(获自Fleischmann'sYeast，其是BurnsPhilpFoodInc.,USA的分机构)、SUPERSTART(获自Alltech)、GERTSTRAND(获自GertStrandAB，Sweden)和FERMIOL(获自DSMSpecialties)。可采用重组DNA技术来提高转化的多核苷酸分子的表达，例如提高操控宿主细胞内多核苷酸分子的拷贝数、所述多核苷酸分子的转录效率、所得转录产物的翻译效率、以及转录后修饰的效率。可用于增加本发明的核苷酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将多核苷酸分子可操纵地连接于高拷贝数质粒，将多核苷酸分子整合至一或多个宿主细胞染色体中，给质粒添加载体稳定序列，置换或改进转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)，置换或改进翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgamo序列)，改进本发明的核苷酸分子以符合宿主细胞内的密码子使用情况，以及去除使转录产物不稳定的序列。转基因植物术语"植物"在本文中作为名词指的是整个植物，但作为形容词使用时指的是存在于植物中的、自植物获得的、来源于植物的或与植物有关的任何物质，例如，植物器官(例如，叶、茎、根、花)、单个的细胞(例如，花粉)、种子、植物细胞等等。本发明所提供的或者预期可用于本发明的植物包括单子叶植物和双子叶植物。在优选的实施方式中，本发明的植物是农作物植物(例如，谷类和豆类、玉蜀黍、小麦、马铃薯、木薯(tapioca)、稻、蜀黍、粟、木薯、大麦、或豌豆)或其他豆科植物。可种植植物用于产生可食用的根、块茎、叶、茎、花或果实。植物可以是蔬菜或观赏植物。本发明的植物可以是玉黍蜀(Zeawqyj)、芸苔(甘蓝型油菜(5nxw/ca"a/ws)，Bra5^fcarapassp.)、亚麻(Ziww附MwYarilss/mw附)、紫花首稽(A/ec^'cagoj""v")、矛§(Oyz"saf/va)、黑麦(Seca/ecera/e)、蜀泰OSbrg/mmSorg/mwvw/gare)、向曰奏(i/WcmAus"朋—、小麦(7>7'//"附aeWvww)、大丑(G7少c7,"e、烟草(A^co"'a"(3fafc"cw附)、马铃墓(iSo/a"w附ft^erosw附)、花生(/^rac/z/s./z>pogaea)、棉花(Coyjj/z'柳/w>^w/,)、蕃著(丄o/W7oea6"to加)、木薯(Mam7wfescw/e"to)、助卩啡(Co/kspp.)、挪子(Cocos"w"y^ra)、凤梨(^4w朋acomosw"、树矛露(C7/7-wsspp.)、可可(7Tzeo6raw"cacao)、茶(Came〃/ase"e"w》、香蕉spp.)、轉梨(户enseaamen'cawa)、无花果(F/cwscaw'ca)、番石權(/^(i/w/wg呵'flfva)、芒果(Ma"gzyb-zW/ca)、撤揽(O/eaewrc;paea)、木瓜(C/capa/aya)、腰果(^"ac"rt^'m附oc"Vfew/a7^)、夏威夷果(Afacfl(i"w/a/wferg/7》//fl)、杏仁(/Vw"wsfl，g(ia/m力、糖用甜菜(&tovw/g"Ws)、燕麦、或大麦。在优选的实施方式中，植物是被子植物。在一个实施方式中，植物是油料种子植物，优选地是油料种子农作物植物。在本文中，"油料种子植物"是用于从植物的种子中商品化生产油的植物物种。油料种子植物可以是油料种子油菜(例如芸苔)、玉蜀黍、向日葵、大豆、蜀黍、亚麻(亚麻子)或糖用甜菜。此外，油料种子植物可以是其他的芸苔属(^^m/cw)、棉花、花生、罂粟、芥菜、蓖麻子、芝麻、红花，或产生坚果的植物。植物在其果实中可产生高水平的油，例如橄榄、油椰子或椰子。本发明可使用的园艺植物是莴苣、菊苣、或芸苔属蔬菜，包括甘蓝、椰菜、或花椰菜。本发明可用于烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、番茄或胡椒。在另一个优选的实施方式中，用于产生本发明的转基因植物的非转基因植物(特别是在其种子中)产生的油具有低于20%、低于10%或低于5%的18:2脂肪酸和/或具有低于10%或低于5%的18:3脂肪酸。在本发明中，转基因植物包括这样的植物(以及所述植物的部分或细胞)及其子代，它们已经通过重组技术进行了遗传学修饰以便在所需的植物或植物器官内产生至少一种本发明的多肽。可通过本领域已知的技术产生转基因植物，这些技术例如可参见A.Slater等，PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants,OxfordUniversityPress(2003)禾口P.ChristouandH.Klee，HandbookofPlantBiotechnology,JohnWileyandSons(2004)。在优选的实施方式中，转基因植物对于已经被引入的每个基因(转基因)均是纯合子，这样其子代的所需表型不会出现分离。转基因植物对于引入的转基因也可以是杂合子，例如，在从杂交种子生长而来的Fl子代中即是如此。此类植物可具有一些优点，例如例如本领域熟知的杂种优势。转基因植物还可包含参与产生LC-PUFA的额外的转基因，例如，但不限于，A6去饱和酶、A9链延长酶、A8去饱和酶、A6链延长酶、对20:3底物具有活性的A5去饱和酶、(D-去饱和酶、A9链延长酶、A4去饱和酶、A7链延长酶和/或多聚乙酰合酶途径成员。此类酶的实例是本领域已知的并包括WO05/103253中所述的那些(见例如，WO05/103253的表1)。转基因植物中的本发明的多核苷酸可组成型表达于所有的发育阶段。根据所使用的植物或植物器官，多肽可以阶段特异性的方式表达。此外，多核苷酸可以组织特异性表达。本发明可使用已知或被发现能够在植物中表达编码感兴趣的多肽的基因的调控序列。所用调控序列的选择取决于感兴趣的靶植物和/或靶器官。可从植物或植物病毒获得此类调控序列或者是化学合成此类调控序列。此类调控序列是本领域人员熟知的。适用于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的多种载体已被公开，例如参见Po而els等，CloningVectors:ALaboratoryManual,1985，supp.1987;WeissbachandWeissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989;禾卩Gelvin等，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990。典型地，植物表达载体包括，例如，受5'和3'调控序列转录调控的一或多个克隆的植物基因和显性选择标记物。此类植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，调控区控制诱导型或组成型表达、环境调控型或38发育调控型表达、或细胞或组织特异性表达)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点、和/或多腺苷酸化信号。已经公开了在植物细胞内具有活性的多种组成型启动子。用于在植物中进行组成型表达的合适的启动子包括，但不限于，花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病病毒(FMV)35S、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、来自核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶小亚基的光诱导型启动子、稻的细胞质磷酸丙糖异构酶启动子、拟南芥的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合酶和章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合体启动子和叶绿素a/p结合蛋白基因启动子。这些启动子已经用于构建在植物中表达的DNA载体；参见，例如PCT出版物WO8402913。所有这些启动子均已用于构建可在植物中表达的各类重组DNA载体。为了在植物的源组织例如叶、种子、根或茎中进行表达，优选地，本发明所用的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。为此，可为基因选择多种具有组织或细胞特异性或增强型的启动子。文献报导的此类启动子的实例包括豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、小麦的叶绿体果糖-l，6-二磷酸酶启动子、马铃薯的核光合ST-LS1启动子、拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡糖淀粉酶(CHS)启动子。以下启动子也被报导在具有光合作用活性的组织中具有活性，东方落叶松(丄Wx/an'c^)的核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶启动子、松Cab基因Cab6的启动子、小麦Cab-l基因启动子、菠菜Cab-l基因启动子、稻Cab1R基因启动子、玉蜀黍的丙酮酸-正磷酸双激酶(PPDK)启动子、烟草LhcbP2基因的启动子、拟南芥Suc2蔗糖-H^协同转运子启动子、菠菜的类囊体膜蛋白基因启动子(PsaD，PsaF,PsaE,PC，FNR，AtpC，AtpD,Cab，RbcS)。叶绿素a/p-结合蛋白的其他启动子也可用于本发明，例如白芥菜CS/"";^"/6")LhcB基因和PsbP基因的启动子。应答于环境、激素、化学品和/或发育信号而被调控的各种植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达RNA-结合蛋白基因，包括受到以下调控的启动子(l)热；(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子、玉蜀黍RbcS启动子)；(3)激素，例如脱落酸类；(4)致伤(wounding)(例如W皿I);或(5)化学制品，例如茉莉酮酸甲酯、水杨酸、类固醇激素、醇、Safeners(WO9706269);或者使用(6)器官特异性启动子也是有利的。为了在植物的库组织(sinktissues)中表达，例如在马铃薯的块茎、番茄的果实、或大豆、芸苔、棉花、玉蜀黍、小麦、稻和大麦的种子中表达，本发明所用的启动子优选地在这些特异性组织中具有相对高的表达。已知多种具有块茎特异性或增强型表达的基因启动子，包括I类patatin启动子、马铃薯块茎ADPGPP基因启动子(大和小亚单位)、蔗糖合酶启动子、包括22kD蛋白质复合物和蛋白酶抑制剂的主要块茎蛋白的启动子、颗粒结合型淀粉合酶基因(GBSS)的启动子以及其他I和II类patatin启动子。其他启动子也可用于在特定组织例如种子或果实中表达蛋白质。可使用J3-伴大豆球蛋白启动子或其他种子特异性启动子例如napin和菜豆球蛋白启动子。用于玉蜀黍胚乳表达的特别优选的启动子是稻的谷蛋白基因启动子，更具体而言是Osgt-l启动子。适合用于在小麦中表达的启动子实例包括ADPglucosepyrosynthase(ADPGPP)亚单位的启动子、颗粒结合型及其他淀粉合酶的启动子、分支酶和脱支酶的启动子、胚发生-高丰度蛋白的启动子、麦醇溶蛋白的启动子、和麦谷蛋白的启动子。稻中的此类启动子的实例包括ADPGPP亚单位的启动子、颗粒结合型及其他淀粉合酶的启动子、分支酶的启动子、脱支酶的启动子、蔗糖合酶的启动子、和谷蛋白的启动子。特别优选的启动子是稻的谷蛋白Osgt-l基因启动子。大麦中的此类启动子的实例包括ADPGPP亚单位的启动子、颗粒结合型及其他淀粉合酶的启动子、分支酶的启动子、脱支酶的启动子、蔗糖合酶的启动子、大麦醇溶蛋白的启动子、胚球蛋白的启动子、和糊粉特异性蛋白的启动子。还可使用根特异性启动子。所述启动子的实例是酸性壳多糖酶基因启动子。还可使用已经得到鉴定的CaMV35S启动子的根特异性亚结构域来实现在根组织中的表达。在一个特别优选的实施方式中，启动子在脂肪酸和油进行生物合成的组织和器官中指导表达，特别是种子细胞例如胚乳细胞和发育的胚的细胞。合适的启动子是油料种子油菜napin基因启动子(美国5,608,152)、蚕豆(F/da/a6a)USP启动子(Baumlein等，1991)、拟南芥油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(尸/zo^o/ww/gan》的菜豆球蛋白启动子(美国5,504,200)、芸苔属Bce4启动子(WO91/13980)或豆球蛋白B4启动子(Baumlein等，1992)和在单子叶植物例如玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性的表达启动子。合适的著名启动子是大麦lpt2或lptl基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)或WO99/16890所述的启动子(大麦的大麦醇溶蛋白基因的启动子、稻的谷蛋白基因的启动子、稻的oryzin基因的启动子、稻的醇溶谷蛋白基因的启动子、小麦的麦醇溶蛋白基因的启动子、小麦的谷蛋白基因的启动子、玉蜀黍的玉米醇溶蛋白基因的启动子、燕麦的谷蛋白基因的启动子、蜀黍kasirin基因的启动子、黑麦的黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他启动子包括Broun等(1998)和美国20030159173所述的启动子。可从选定的启动子衍生出5'非翻译前导序列以表达本发明的多核苷酸的异源基因序列，需要的话还可对其进行修饰以便增加mRNA的翻译。如何优化转基因的表达可参见Koziel等(1996)的综述。5'非翻译区也可得自植物病毒RNA(烟草花叶病病毒、烟草刻蚀病毒、玉蜀黍矮花叶病病毒、紫花苜蓿花叶病病毒等等)、合适的真核细胞基因、植物基因(小麦和玉蜀黍叶绿素^结合蛋白基因前导区)、或合成的基因序列。本发明不限于其中所述非翻译区衍生自伴随启动子序列的5'非翻译序列的构建体。前导序列也可衍生自无关的启动子或编码序列。可用于本发明的前导序列包括玉蜀黍Hsp70前导区(美国5,362,865和美国5，859，347)和TMVco元件。转录的终止是通过嵌合载体内与感兴趣的多核苷酸可操纵地连接的3'非翻译DNA序列而实现的。重组DNA分子的3'非翻译区含有多腺苷酸化信号，其在植物中的作用是导致在RNA的3'端添加腺嘌呤核苷酸。3'非翻译区可得自在植物细胞中表达的各种基因。常用的是胭脂碱合酶3'非翻译区、豌豆的小亚单位核酮糖二磷酸羟化酶(Rubisco)基因的3'非翻译区、大豆的7S种子贮藏蛋白基因的3'非翻译区。含有聚腺苷酸化信号的土壤杆菌(々ra^改n'wm)肿瘤诱导型(Ti)质粒基因的3'转录的非翻译区也是合适的。已经公开了4种常规的方法用于将基因直接输送至细胞内(l)化学方法(Graham等，1973);(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，1980);电穿孔(参见，例如，WO87/06614，美国5,472,869，5,384,253,WO92/09696和WO93/21335);和基因枪(参见，例如，美国4,945,050和美国5，141,131);(3)病毒载体(Clapp，1993;Lu等，1993;Eglitis等，1988);和(4)受体介导的机制(Curiel等，1992;Wagner等，1992)。可使用的加速方法包括，例如，微粒轰击等等。将转化核酸分子输送至植物细胞内的方法的一个实例是微粒轰击。该方法的综述见Yang等，Particle轰击TechnologyforGeneTransfer,OxfordPress,Oxford,England(1994)。非生物学颗粒(微粒)可包被上核酸并通过推进力输送至细胞内。示例性的颗粒包括含钨、金、铂等的颗粒。其除了是可重复性地转化单子叶植物的有效手段之外，微粒轰击的特别优势还在于，既不需要分离原生质体，也不需要对土壤杆菌感染的易感性。通过加速而将DNA输送至玉蜀黍细胞内的方法的一个示例性实施方式是生物弹道学a-颗粒输送系统，其能够驱动包被有DNA的颗粒通过一个屏，例如不锈钢或Nytex屏，到达以悬浮培养的玉黍蜀细胞所覆盖的滤膜表面上。适合用于本发明的颗粒输送系统是氦加速枪PDS-1000/He，可自Bio-RadLaboratories获得。为进行轰击，可将悬浮的细胞浓縮于滤膜上。将含有待轰击细胞的滤膜放置在距微粒停止板下方合适的距离处。需要的话，还可在枪和待轰击细胞之间放置一或多个屏。或者，可将不成熟的胚或其他耙细胞设置在固相培养基上。待轰击细胞放置在距微粒停止板下方适当距离处。如果需要，还可在加速装置和待轰击细胞之间放置一或多个屏。通过在此所述的技术可获得1000或更多个瞬时表达标记物基因的细胞焦点。轰击后48小时焦点内表达外源基因产物的细胞数量在一到10个，平均为一到3个。在轰击转化中，可优化轰击前培养条件和轰击参数，以产生最大数量的稳定转化体。轰击的物理学和生物学参数对于该技术均十分重要。物理因素涉及操控DNA/微粒沉淀物或影响大颗粒或微粒的飞行和速率的因素。生物学因素包括涉及在轰击之前和轰击后即刻对细胞的操控步骤、调节耙细胞的渗透压以便减轻与轰击相关的损伤、以及转化DNA的性质，例如是线性化DNA还是完好的超螺旋质粒。轰击前操控被认为对于成功转化未成熟胚而言是特别重要的。在另一个替代性实施方式中，可稳定转化质体。在高等植物中转化质体的已知方法包括用颗粒枪输送含有选择标记物的DNA并通过同源重组将DNA导向质体基因组(美国5,451,513，美国5,545,818，美国5,877,402，美国5,932479，和WO99/05265)。因此，预期可以的是，可通过在小规模的研究中调整轰击参数的各个方面以便充分优化条件。特别希望调整的是物理参数，例如间隙距离、飞行距离、组织距离和氦气压力。还可通过改变影响受者细胞的生理学状态并因此可影响转化和整合效率的条件以使得降低损伤因素最小化。例如，可调节渗透压状态、组织水合和受者细胞的亚培养阶段或细胞周期以达到最佳转化。根据在此公开的内容，本领域人员知晓如何进行其他常规的调整。土壤杆菌介导的转移是将基因引入植物细胞的广泛适用的系统，这是因为DNA可被引入完整的植物组织内，从而不需要从原生质体产生完整的植物。使用土壤杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域熟知的(参见，例如，美国5,177,010，美国5,104,310，美国5,004,863，美国5，159，135)。此外，T-DNA的整合是相对精确的过程，其极少产生重排。待转移的DNA区域由边界序列限定，干预DNA通常被插入至植物基因组内。现代土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中复制，便于操控(Klee等，In:PlantDNAInfectiousAgents,HohnandSchell,eds.,Springer-Verlag:NewYork,pp.179-203(1985)。此外，土壤杆菌介导的基因转移载体的技术进步改善了载体内的基因排列和限制性位点，有助于构建能够表达各种多肽编码基因的表达。已经公开的载体具有便利的多连接物区域，其侧翼为启动子和多聚腺苷酸化位点，用于指导插入的多肽编码基因的表达，这适合本发明的目的。此外，既可使用含有未弱化的(armed)Ti基因的土壤杆菌也可使用Ti基因弱化的(disarmed)土壤杆菌进行转化。在可有效进行土壤杆菌介导的转化的那些植物品种中，该方法由于具有方便且明确的基因转移特性，因此是首选。采用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物典型地含有位于一条染色体上的单个基因座。此类转基因植物可被称为所添加的基因的半合子。更优选的转基因植物是所添加的基因的纯合子；即，转基因植物含有两个所添加的基因，一对染色体的每一条的相同基因座上具有一个基因。可通过用独立的隔离的转基因植物(含有单个的所添加的基因)进行有性繁殖(自花授粉)，使所得种子发芽，并分析所得植物中的感兴趣的基因，从而获得纯合子转基因植物。还要理解，两种不同的转基因植物可杂交产生含有两种独立地分离外源基因的子代。合适子代的自花授粉可产生两种外源基因均为纯合子的植物。也预期了与亲代植物进行回交以及与非转基因植物进行异系杂交，以及营养体繁殖。常规采用的对不同性状和作物的其他育种方法可参见Fehr，In:BreedingMethodsforCultivarDevelopment,WilcoxJ.ed.，AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWis.(1987)。可采用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合的方法实现植物原生质体的转化。如何将这些系统应用于不同植物品种取决于自原生质体再生出特定植株的能力。自原生质体再生谷类的示例性方法已被公开(Fujimura等，1985;Toriyama等，1986;Abdullah等，1986)。还可采用其他的细胞转化方法，包括但不限于通过以下方法将DNA引入植物直接将DNA转移至花粉，直接将DNA注射至植物的繁殖性器官，或直接将DNA注射至未成熟胚的细胞内随后对干燥的胚进行再水化。从单个植物原生质体转化体或各种转化的外植体再生、发育和栽培出植物是本领域熟知的(Weissbach等，In:MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,SanDiego,Calif.,(1988)。这种再生和生长方法典型地包括以下步骤选择转化的细胞，培养个体化细胞历经从胚发育至有根的小植株阶段的通常阶段。转基因胚和种子的再生类似。得到的转基因的有根的苗随后栽植在合适的植物生长培养基例如土壤中。含有外来的外源基因的植物的发育或再生是本领域熟知的。优选地，再生的植物自花传粉以产生纯合子转基因植物。或者，将得自再生的植物的花粉与由具有重要农艺价值的株系的种子长成的植物进行杂交。反过来，可使用来自这些重要株系的植物的花粉给再生的植物授粉。可采用本领域人员熟知的方法栽培含有所需外源核酸的本发明的转基因植物。主要采用根癌土壤杆菌(^gro6a"en'Mmfwm^/"flc/em)转化双子叶植物以及获得转基因植物的方法已经用于棉花(美国5，004,863，美国5,159,135,美国5,518,908);大豆(美国5,569,834,美国5，416，011);芸苔属(美国5,463,174);花生(Cheng等，1996);和豌豆(Grant等，1995)。转化谷类植物例如小麦和大麦以便通过引入外源核酸而在植物中引入遗传变异以及用于从原生质体或未成熟的植物胚再生植物的方法是本领域熟知的，参见例如，加拿大专利申请No.2,092,588、澳大利亚专利申请No61781/94、澳大利亚专利No667939、美国专利No.6,100,447、国际专利申请PCT/US97/10621、美国专利No.5,589,617、美国专利No.6,541,257，其他方法参见专利说明书W099/14314。优选地，通过根癌土壤杆菌介导的转化方法产生转基因小麦或大麦植物。携带所需核酸构建体的载体可被引入组织培养的植物或外植体的可再生的小麦细胞内、或合适的植物系统例如原生质体中。可再生的小麦细胞优选地来自未成熟胚、成熟胚、来自它们的愈伤组织、或分生组织的盾片。为了证实转基因细胞和植物内存在转基因，可采用本领域人员己知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。根据产物的性质，可通过多种途径检测转基因表达产物，包括免疫印迹和酶分析。在不同植物组织中定量蛋白质表达和检测复制的一种特别有用的方法是使用报告基因，例如GUS。一旦获得转基因植物，可使之生长产生具有所需表型的植物组织或部分。可收获植物组织或植物部分和/或收集种子。种子可用作来源用于生长出具有所需特性的额外的植物、组织或部分。转基因非人类动物"转基因非人类动物"指的是动物而非人类，所述动物含有同一物种或品种的野生型动物所不具有的基因构建体("转基因")。在此所述的"转基因"具有生物
技术领域：
内的通常含义，且包括这样的遗传学序列，所述序列是经重组DNA或RNA技术产生或改变的且已经被引入至动物细胞内。转基因可包括来源于动物细胞的遗传学序列。典型地，转基因已经通过人为操作引入至动物内，例如，通过转化，但也可通过本领域人员所知的任何方法。产生转基因动物的技术是本领域熟知的。该方面的通用教科书是Houdebine，Transgenicanimals—GenerationandUse(HarwoodAcademic,1997)。异源DNA可被引入至例如哺乳动物的受精卵内。例如，可通过微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、反转录病毒感染或其他手段转化全能或多能干细胞，然后将转化的细胞引入胚胎，并使胚胎发育为转基因动物。在高度优选的方法中，使用含义所需DNA的反转录病毒感染发育的胚胎，并自感染的胚胎产生转基因动物。不过，在最优选的方法中，合适的DNA被共注射至前核或胚胎的细胞质内，优选地在单个细胞阶段，并使胚胎发育为成熟的转基因动物。z产生转基因动物的另一方法涉及通过标准的方法将核酸微注射至原核期卵内。然后培养被注射的卵，随后转移至假孕受者的输卵管内。还可通过核移植技术产生转基因动物。采用这种方法，用质粒稳定转染来自供者动物的成纤维细胞，该质粒整合有置于调控序列控制下的感兴趣的45结合结构域或结合区的编码序列。然后将稳定的转染体与去核的卵母细胞融合，培养并转移至雌性受者内。饲料(Feedstuffs)本发明包括可用作饲料的组合物。在本发明中，"饲料"包括供人类或动物摄入(包括用于胃肠道和/或胃肠外摄入)的任何食物或制品，当其进入肌体后，(a)用于营养或强健组织或提供能量；和/或(b)保持、恢复或支持足够的营养状态或代谢功能。本发明的饲料包括婴儿和/或幼儿的营养组合物。本发明的饲料包含，例如，本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵方法的产物、或本发明的组合物，以及合适的载剂。术语"载剂"取其最为广泛的含义，涵盖具有或不具有营养价值的任何成分。本领域人员能够理解，载剂必须适合于用于词料(或以足够低的浓度使用)，以便其不会对摄入所述饲料的生物体产生有害作用。本发明的伺料包含使用本发明的方法、细胞或植物直接或间接产生的油、脂肪酸酯或脂肪酸。组合物可以是固体或液体的形式。此外，组合物可包括可食用的常量营养物、维生素、和/或矿物质，它们的量符合特定的需要。这些成分的量可以变化，这取决于组合物是用于正常个体还是用于具有特殊需求的个体，例如患有代谢性疾病和类似情况的个体。具有营养价值的合适的载剂的实例包括，但不限于，常量营养物例如可食用的脂肪、糖类和蛋白质。此类可食用的脂肪的实例包括，但不限于，椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油和甘油一酸酯和甘油二酯。此类糖类的实例包括(但不限于)葡萄糖、食用乳糖、和水解淀粉。此外，可用于本发明的营养组合物中的蛋白质的实例包括(但不限于)大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳乳清、或这些蛋白质的水解产物。至于维生素和矿物质，以下物质可添加至本发明的词料组合物中钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素A、E、D、C、和复合B。其他的此类维生素和矿物质也可添加。用于本发明的饲料组合物的成分可以是半纯化来源的或纯化来源的。半纯化来源的或纯化来源的指的是通过对天然材料进行纯化而制备的物质或通过从头合成而制备的物质。本发明的饲料组合物也可添加至食物中，即使是在不需要饮食增补的情况下也可以。例如，组合物可添加至任何类型的食物中，包括(但不限于)人造黄油、改性黄油、奶酪、乳、酸奶、巧克力、糖果、点心、色拉油、烹饪用油、烹饪用脂肪、肉、鱼和饮料。酵母属物种用于酿造啤酒和葡萄酒以及烘焙，特别是烘制面包。酵母是植物提取物的主要成分。酵母也用作动物feed的添加剂。显然，可产生遗传工程化的酵母菌株使之适合于合成在此所述的LC-PUFA。这些酵母菌株随后可用于食品以及葡萄酒和啤酒酿造，以便提供具有增加的脂肪酸含量的产P叩o此外，根据本发明产生的脂肪酸或经转化后含有并表达对象基因的宿主细胞也可用作动物食物增补剂，以改变动物组织或乳的脂肪酸组成，使之更适合人类或动物摄入。此类动物的实例包括羊、牛、马等等。此外，本发明的饲料还可用于水产业以提高供人类或动物摄入的鱼的脂肪酸水平。组合物本发明还包括组合物，特别是药物组合物，所述组合物包含一或多种采用本发明的方法产生的脂肪酸和/或所得的油。药物组合物可包含一或多种脂肪酸和/或油，连同标准的、熟知的、非毒性药用可接受的载剂、佐剂或载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乙醇、多元醇、植物油、湿润剂或乳状液，例如水/油乳状液。组合物可以是液体或固体形式。例如，组合物的形式可以是片剂、胶囊、可摄入的液体或粉末、注射形式、或局部用药膏或乳剂。可通过例如保持分散体系所需要的粒径和通过使用表面活性物质而保持合适的流动性。还可加入等渗剂，例如，糖、氯化钠等等。除了此类惰性修饰剂之外，组合物还可包括佐剂，例如湿润剂、乳化和混悬剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。混悬液除了含有活性化合物之外还包含混悬剂，例如乙氧基异硬脂醇(ethoxylatedisostearylalcohols)、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、班脱土、琼脂、和黄芪胶或这些物质的混合物。可通过采用本领域熟知的技术制备固体剂量形式例如片剂和胶囊。例如，根据本发明产生的脂肪酸可压成片剂，其中使用常规的片基例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，联合使用的有粘合剂例如阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶，崩解剂例如马铃薯淀粉或褐藻酸，以及润滑剂例如硬脂酸或硬脂酸镁。可通过将这些赋形剂连同抗氧化剂和相关的脂肪酸装入白明胶胶囊而制备胶对于静脉施用，可将根据本发明产生的脂肪酸或其衍生物掺入至商品化的配制品中。特定脂肪酸的典型剂量是0.1mg至20g，每天摄入1至5次(高达每日100g)，且优选地在每天大约10mg至大约1、2、5、或10g的范围内(一次或分多次摄入)。本领域已知，每天需要最少大约300mg的脂肪酸，特别是LC-PUFA。不过，应该理解任何量的脂肪酸对对象均可能是有益的。本发明的药物组合物的可能的施用途径包括，例如，胃肠道(例如口服和直肠)和胃肠外。例如，可口服或直肠施用液体制备物。此外，可将均质的混合物完全分散至水中，在无菌条件下与生理学可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或推进物混合物，形成喷剂或吸入剂。待施用于患者的组合物的剂量可由本领域人员确定，这取决于多种因素，例如患者的体重、患者的年龄、患者的总体健康状况、患者的既往病史、患者的免疫状态等等。此外，本发明的组合物可用于化妆品。其可添加至已有的化妆品组合物中一般形成混合物，或是将根据本发明产生的脂肪酸用作化妆品组合物中的唯一的"活性"成分。油的产生可采用本领域常规使用的技术来提取、加工和分析由本发明的细胞、植物、种子等产生的油。典型地，植物种子经熟化、压榨和提取以产生粗制油，然后进行脱胶、精制、脱色和除味。通常，种子压碎技术是本领域已知的。例如，给油料种子喷水使之变软，并使之含水量升高至，例如8.5%，使用间隙设置为0.23至0.27mm的平滑滚筒将其制成薄片。根据种子的类型，在压碎之前可以不加水。加热可使酶失活，且有助于细胞进一步破坏，使油滴凝结，并使蛋白质凝聚，所有这些均有助于提取加工。通过螺旋压搾机可使得大部分种子油释放出来。从螺旋压搾机排出的饼随后进行溶剂提取，例如以己垸，使用伴热柱(heattracedcolumn)。或者，压榨工序所产生的粗制油可通过沉降罐，其上部具有槽状金属丝网引流构造，以去除压榨工序过程中随油而挤出的固形物。净化的油再通过板框式滤器，以去除任何残余的微小固形颗粒。如果需要，自提取工序所回收的油可与净化的油混合以产生掺合的粗制油。将溶剂从粗制油中去除后，将压榨部分和提取部分混合饼对其进行常规的油加工过程(即，脱胶、碱法净化、脱色和除味)。可通过向粗制油中添加浓磷酸进行脱胶，将不可水合的磷脂转化为可水合形式，并螯合存在的少量金属。通过离心将胶与油分离。可通过添加足量的氢氧化钠溶液滴定全部脂肪酸并移除所形成脂肪酸盐，以精制油。可通过在真空条件下将油加热至260°C并以0.1ml/分钟/100ml油的速度缓慢向油中引入蒸汽而进行除味。喷射30分钟后，将油在真空中冷却。典型地，油被转移至玻璃容器并充入氩气，然后冷藏。如果油量有限，则可置于真空条件下，例如Parr反应器内，并加热至260°C，加热时间与用于除味所需的时间一样。这一处理可改善油的颜色并去除绝大部分的挥发性物质。抗体本发明还提供针对本发明的多肽或其片段的单克隆或多克隆抗体。因此，本发明还提供用于产生针对本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。术语"特异性结合"指的是抗体能够结合本发明的蛋白质而不结合其他己知的去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶样多肽。在本文中，术语"表位"指的是本发明的多肽内与抗体发生结合的区域。表位可被施用于动物以产生针对该表位的抗体，不过，本发明的抗体优选地特异性结合完整多肽情况下的表位区域。如果需要多克隆抗体，可用免疫原性多肽免疫选定的动物(例如小鼠、兔、山羊、马等等)，免疫原性多肽例如是SEQIDNO.'16至30、73至78、80和134所示的那些。收集被免疫动物的血清，并按照已知的步骤进行处理。如果含多克隆抗体的血清含有针对其他抗原的抗体，则可通过免疫亲和色谱纯化多克隆抗体。产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了制备此类抗体，本发明还提供本发明的肽或其片段，其与在动物中用作免疫原的另一种肽发生半抗原化。本领域人员还可容易地制备针对本发明的多肽的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的通用技术是已知的。可通过细胞融合而建立产生抗体的永生细胞系，其他的技术例如为使用癌基因DNA直接转化B淋巴细胞，或是用Epstein-Barr病毒进行转染。可针对各种性质筛选单克隆抗体；即，针对同种型和表位亲和力进行筛选。另一种替代性的技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中，例如噬菌体在其表面表达具有大量互补决定区(CDR)的scFv片段。该技术是本领域熟知的。在本发明中，除非另有说明，术语"抗体"包括完整抗体的片段，所述片段仍保留与靶抗原的结合活性。此类片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及单链抗体(scFv)。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体，例如参见EP-A-239400。本发明的抗体可结合于固相支持物和/或在合适的容器内与合适的试剂、对照、说明等包装成试剂盒。在一个实施方式中，本发明的抗体具有可检测标记物。可用于直接测定抗体结合的可检测标记物的实例包括放射性标记物、荧光团、染料、磁珠、化学发光物、胶体颗粒等。可用于间接测定结合的标记物的实例包括酶，其底物可提供颜色或荧光产物。可检测标记物的额外的实例包括共价结合的酶，在加入合适的底物后，所述酶能够提供可检测产物信号。适合用于缀合物的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。在不能商购的情况下，可通过本领域人员已知的技术容易地产生此类抗体-酶缀合物。进一歩的示例性可检测标记物包括生物素，其以高亲和力结合抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素；可用于荧光激活的细胞分选仪的荧光染料(例如藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和德克萨斯红)；半抗原；等等。优选地，可检测标记物允许在光度计板内直接测定例如生物素。此类标记的抗体可用于本领域已知的技术来检测本发明的多肽。实施例实施例1一鉴定赤拟谷盗(7WZ)0//,cwto"w附)基因组的去饱和酶在2005年底，使用ClustalX程序(Thompson等，1997)比对了64份公开的全长昆虫去饱和酶蛋白质序列。根据序列比对选择出高度保守的肽序列(HNYHHAYPWDYKAAEIGMPLNSTASLIRLCASLGWAYDLKSV(SEQIDNO:31))，并用于通过TBLASTN程序(Altschul等，1997)搜索赤拟谷盗基因组。根据这一分析，鉴定了15种去饱和酶样序列，将它们命名为Tribdesatl(编码序列为SEQIDNO:l，氨基酸序列为SEQIDNO:16)、Tribdesat2a(编码序列为SEQIDNO:2，氨基酸序列为SEQIDNO:17)、Tribdesat2b(编码序列为SEQIDNO:3，氨基酸序列为SEQIDNO:18)、Tribdesat2c(编码序列为SEQIDNO:4，氨基酸序列为SEQIDNO:19)、Tribdesat3(编码序列为SEQIDNO:5，氨基酸序列为SEQIDNO:20)、Tribdesat4(编码序列为SEQIDNO:6，氨基酸序列为SEQIDNO:21)、Tribdesat5(编码序列为SEQIDNO:7，氨基酸序列为SEQIDNO:22)、Tribdesat6a(编码序列为SEQIDNO:8，氨基酸序列为SEQIDNO:23)、Tribdesat6b(编码序列为SEQIDNO:9，氨基酸序列为SEQIDNO:24)、Tribdesat7a(编码序列为SEQIDNO:IO，氨基酸序列为SEQIDNO:25)、Tribdesat7b(编码序列为SEQIDNO:ll，氨基酸序列为SEQIDNO:26)、Tribdesat8(编码序列为SEQIDNO:12，氨基酸序列为SEQIDNO:27)、Tribdesatl0(编码序列为SEQIDNO:13，氨基酸序列为SEQIDNO:28)、Tribdesatll(编码序列为SEQIDNO:14，氨基酸序列为SEQIDNO:29)和Tribdesat12(编码序列为SEQIDNO:15,氨基酸序列为SEQIDNO:30)。根据克隆和相应cDNA的测序结果，对上述序列中的Tribdesat2a、2b、2c、3、4、5、6a、8、10、11、12进行了修正(见实施例2-5)。然后在Softberry(http:〃www.softberrv.com/cgi-bin/programs/gfin/fgenesh)中对各个重叠群进行基因预测程序。测试了果蝇、按蚊、秀丽隐杆线虫(C.e/ega旭)和马来丝虫(^n^/am"/"少fl)的参数的预测去饱和酶基因的能力。对于每一个基因预测，将这些蛋白质针对NCBI数据库中的所有蛋白质进行BLASTP分析，以确定它们是否类似于去饱和酶。除了使用按蚊参数的TribdesatlO，按蚊和果蝇参数均没有对去饱和酶给出正确的预测。对于一些去饱和酶，用于预测秀丽隐杆线虫或马来丝虫的基因的参数预测到类似于去饱和酶的基因。对于去饱和酶中的3种，使用任何默认参数的预测均未预测到去饱和酶基因(Tribdesat4、Tribdesat7a和Tribdesat7b)。对于去饱和酶基因(2组重叠群)中未能使用基因预测程序预测的3种，将基因组区域针对NCBI数据库中的所有蛋白质进行BLASTX比较。注意到了类似于去泡和酶的基因组片段最5'的区域，并将上游DNA序列进行硅片上(/"w7/co)翻译，并观测检查甲硫氨酸残基。以此作为蛋白质序列的起始甲硫氨酸。以相似的方式检查类似于去饱和酶的基因组片段3'区域的终止密码子。观测检查每一这些蛋白质序列的所有的去饱和酶保守基序(表2)。对于Tribdesat4，无法合理预测蛋白质的N端或C端，因为这些区域的基因组序列不完整。还检查了每一蛋白质序列是否存在3个"组氨酸盒"(His盒)，它们是所有去饱和酶中高度保守的基序。这些盒中的组氨酸残基被认为参与结合去饱和酶活性所需的铁原子。表3列出了这些蛋白质的His盒以及来自C7ww/z'og"^^/"gw6Wj(见实施例5)的其他两个His盒的氨基酸位置和序列，已经根据对cDNA克隆的分析(实施例2-5)修正了预测的蛋白质序列。表2-所鉴定的拟谷盗属氨基酸序列中存在(A/)或不存在(X)的保守性去饱和酶基序(注序列中的基序可能与相应的保守性序列基序不完全相同)。保守性序列基序鉴定的基因预测的蛋白质大小(氨基酸)1234568Tribdesatl348々VX々Tribdesat2a320V々々々々Tribdesat2b297々々-々々々々Tribdesat2c321VVV々々々Tribdesat3286VXVVTribdesat5353々VV々々Tribdesat6a350々V々々々丁ribdesat6b289VXXVXX々X丁ribdesat8374VVVVV々VTribdesatlO366々VVV々々々Tribdesatl1323V々々VVVTribdesatl2455VVVVV基序的共有氨基酸序列1,AGAHRLW(SEQIDNO:104);2，SETDAD(SEQIDNO:105);3,FFFSHVG(SEQIDNO:106);4,QKKY(SEQIDNO:107);5，NSAAH(SEQIDNO:108);6，GEGWHNYHH(SEQIDNO:109);7,PWDY(SEQIDNO:110);8，GWAY(SEQIDNO:111)。表3—拟谷盗属和士兵甲虫(soklierbeetle)去饱和酶序列中组氨酸盒的氨基酸位置和序列。各盒编号对应于基序的第一个氨基酸残基在蛋白质内的位置。第一HIS盒第二HIS盒第三HIS盒Tribdesat190;HRLWTH(SEQIDNO:112)109;HRVHH(SEQIDNO:116)249;HNYHH(SEQIDNO:121)Tribdesat2a60;HRLWSH(SEQIDNO:113)97;HRAHH(SEQIDNO:117)238;HNYHHTribdesat2b62;HRLWAH(SEQIDNO:114)99;HRIHH240;HNYHHTribdesat2c55;HRLWAH92;HRVHH233;HNYHHTribdesat365;HRLWAH102;HQVHH(SEQIDNO:118)243;HNYHHTribdesat496;HRLWSH133;HRVHH274;HNYHHTribdesat588;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHHTribdesat6a88;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHHTribdesat6b15;HRLWAH52;HRLHH(SEQIDNO:119)189;WISYH(SEQIDNO:122)Tribdesat7a57;HRLWSH94;HRAHH234;HNYHHTribdesat893;HRLWAH130;HRVHH271;HNYHHTribdesat1075;HRLWAH112;HRVHH254;HNYHHTribdesat1177;HRLYSH(SEQIDNO:115)114;HRQHH(SEQIDNO:120)255;HNYHHTribdesat12104;HRLWAH141;HRVHH282;HNYHHCL1(SEQIDNO:73)88;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHH(SEQIDN0:74)88;HRLWSH125;HRVHH265;HNYHH实施例2—Tribdesat4的克隆本发明人尝试了在cDNA上进行反向PCR以获得Tribdesat4,这是因为我们无法从基因组序列预测出该基因的起点或终点。如下合成第一链混合533fil幼虫RNA(24pg)、100pmol各种寡核苷酸引物(Clontech)，SmartIVOligo5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3，(SEQIDNO:32);和CDS/3'(5'ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN)(N=A，G，C或T;V=A,G或C(SEQIDNO:33))。72°C温育2分钟，随后立即冰上冷却。向管中的内容物加入2nl5X第一链缓冲液(Powerscript;CIontech),1^1DTT(20mM)，lpldNTP混合物(各种dNTP终浓度为200pM)和1^1Powerscript反转录酶(Clontech)。第一链cDNA合成在42。C进行l小时，随后立即冰上冷却。加入NaOH(lnl，25mM),68。C温育3分钟。测定用量的第一链合成物(6pl)与5pi10XAdvantage2Buffer(Clontech),ljul50XdNTP混合物，lplCDS/5oligo(5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT;Clontech(SEQIDNO:34))，lplCDS/3oligo,1^150XAdvantage2Polymerase混合，使得终体积为50pl。然后对混合物进行如下温度方案72°C/10分钟；95°C/1分钟；然后3循环的95。C/15秒，68。C/8分钟。在1%琼脂糖凝胶上分离测定用量(5W)的样品以确认扩增发生。然后以Sfil在50°C消化样品2小时，使用QIAgenPCR纯化试剂盒按照生产商的说明除去限制性酶。洗脱的样品稀释后用于连接，以保证发生分子内连接而非分子间连接。消化后的DNA(0.5pg)稀释于500pl连接混合物并在16。C温育过夜。连接物用糖原沉淀浓縮(150ng糖原，1.4ml冰冷的95%乙醇，-80°C，2小时)，随后离心沉淀DNA(12000g,20分钟)。DNA重悬于10pl无菌水。使用lpl这种沉淀的DNA进行反向PCR反应，反应包括5^110XAdvantage2PCRBuffer(Clontech),10pmolDesat4GSP1(5，ATTATGAGCGGATCGGCTTCCAAGTC(SEQIDNO:35),10pmolDesat4GSP2(5'CGAAACAATTTGGAATTCGTTTTGGG(SEQIDNO:36)，200|iM的各种dNTP,1^150XBDAdvantage2Polymerase和无菌水，终体积为50pl。PCR条件如下95°C/1分钟，然后30个循环的95。C/30秒，68°C/3分钟，然后68。C/3分钟。1%琼脂糖凝胶分离测定用量(5yl)的PCR产物。发现了单一条带，并克隆入pGEM-T-Easy。测序插入体，发现其含有Tribdesat4的绝大部分5'端和Tribdesat4的完整的3，端。然后将现有的Tribdesat45'端与已有的来自赤拟谷盗的EST序列进行BLASTN分析。从该分析中鉴定了一个EST(AccessionNo.DT795463)，并鉴定了该5'端的其余部分。针对Tribdesat4编码区的5'和3'端设计引物并用于RT-PCR反应以获得全长的Tribdesat4。RT-PCR反应包括25pl2X反应混合物(Invitrogen)，37ngRNA,1SuperscriptIIRT/PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen),100pmol的各种引物，加无菌水至50nl。反应条件如下50°C/30分钟，94°C/2分钟，然后35个循环的94。C/30秒，55。C/l分钟，72。C/l分钟，然后72。C/5分钟。测定用量样品在1%琼脂糖凝胶上电泳。获得了单一条带(约lkb讲克隆入pGEMTEasy。对插入体进行测序，并鉴定为全长cDNA。SEQIDNO:6显示的是该cDNA的编码区的核苷酸序列。实施例3—从成体拟谷盗属RNA中扩增去饱和酶序列采用Trizol法(Invitrogen)提取赤拟谷盗(TC4株)甲虫RNA。100mg的成体甲虫在1mlTrizol试剂中匀浆，混合物在25°C温育5分钟，随后在样品中加入200pl氯仿。手摇混合物15秒，然后25。C静置3分钟。离心分离有机层和水层(12，000g，15分钟，4°C)。将上面的水层转移至新的管中，并加入500pi异丙醇沉淀RNA。25°C温育10分钟后，4°C离心沉淀RNA，12,OOOg/10分钟。RNA沉淀以75%乙醇洗漆一次然后空气干燥10分钟。RNA随后溶解于30pl的无Rnase水中。RNA具有明显的棕色着色，采用用于RNA净化(QIAgen)的RNeasy小方案进一步纯化，按照生产商的说明进行。对10种去饱和酶序列(Tribdesatl，2a，2b，3，5，6a，6b，8，10和ll)进行RT-PCR扩增反应。向各样品加入25^2X反应混合物(Invitrogen)，37ngRNA，1nlSuperscriptIIRT/PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen),100pmol的各种引物，加无菌水至50pl。反应条件如下50°C/30分钟，94°C/2分钟，然后35循环的94。C/30秒，55°C/1分钟，72°C/1分钟，然后72。C/5分钟(PCR条件55/72)。测定用量的各种样品在1%琼脂糖凝胶上电泳。采用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAgen)纯化含有大约lkb的单一扩增产物的样品(Tribdesatl,3,5,6a,10，ll)并克隆至pGEMTEasy(Promega)。采用标准的分子生物学技术(Sambrook等，1989)将连接混合物转化至大肠杆菌DH10B。检查含有插入体的克隆的DNA序列。图1至5显示了基因预测与Tribedesat2b,3,6b，10和11的RT-PCR产物之间的比较。根据基因组序列预测的序列与观察到的cDNA序列显然有着不同，在一些情况中，这应该是根据基因组序列预测编码序列不正确引起的，在其他情况中，一些差异，例如单核苷酸多态性，可能是昆虫群体内存在的基因的不同等位基因引起的。还采用上述Trizol法提取赤拟谷盗幼虫RNA。按照上述方法RT-PCR反应扩增6种去饱和酶序列(Tribdesat2a，2b,2c,6b,8和12)。第一轮PCR后没有观察到任何扩增产物，所以将对反应体系进行第二轮PCR。在Tribdesat2b、Tribdesat2c、Tribdesat12和Tribdesat8样品中观察到大约1kb的扩增产物。使用QIAquick胶回收试剂盒(QIAgen)自琼脂糖凝胶提取产物并克隆至pGEMTEasy(Promega)。检查含有插入体的克隆的DNA序列。图1和3分别给出基因预测与得到的Tribdesat2b和6b的RT-PCR产物的基因之间的比较。实施例4一从士兵甲虫(T/^w/Zog^//^/wg^nV)扩增去饱和酶基因片段房,战伊,谱力殺泡浙斷疑采用拟谷盗属所使用的上述Trizo1法自100mg成年雄性C./wg^ni甲虫提取RNA。使用InvitrogenSuperscriptII和polyT弓|物(5、TTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQIDNO:81))合成cDNA。该polyT引物(100pmol)、RNA(2pl)和无RNase水的终体积为15.5pl，70。C温育IO分钟然后冰上冷却。向其中加入10XPCRBuffer(2.525mMMgCl2(2.5(^1)，10mMdNTP混合物(lpl)和0.1MDTT(2.5pl)。该混合物在42。C加热1分钟，随后加入SuperscriptII反转录酶(1pl)并将混合物在42°C放置50分钟。70°C灭活SuperscriptII反转录酶15分钟，用1^1RNaseH(2单位，30分钟，37°C)降解RNA。PCR反应洗脱含有1pldNTP(200^M各种dNTP)，5pi10xThermoPolBuffer(NEB),1.5F2(5、TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG(SEQIDplcDNA，0.1U7^DNA聚合酶(NEB)，加无菌水至50pl。PCR条件如下最初在94°C变性3分钟，然后30个循环的94°C/15s，48eC/30s，72°C/2分钟，最后延伸72°C/5分钟。1.5%琼脂糖凝胶分离测定用量的样品，观察到大约400bp的条带。使用QIAgenQIAquickPCR纯化试剂盒按照生产商的说明纯化PCR反应并克隆入pGEMTEasy(Promgea)。通过DNA序列分析检查到大约30个含有插入体的克隆。总共鉴定到3个独特的去饱和酶序列，相应于CL6(SEQIDNO:75)、CL7(SEQIDNO:76)和CL8(SEQIDNO:77)。iT谱微:f^伊鹏鄉去柳餅度如上提取RNA并合成cDNA。按照与上述相同的方法使用简并引物F2/R2禾QClu—f(5、GCNCAYMGNYTNTGGGCNCA(SEQIDNO:84))/Clu-r(5、AANRYRTGRTGGTAGTTGIG(SEQIDNO:85))(见表4)对雌性成体RNA进行2次简并PCR。观察到大约400bp(F2/R2)和550bp(Clu_f/Clu—r)的扩增产物并将它们克隆至pGEMTEasy。PCR扩增并分析来自经F2/R2转化的70个集落的各个插入体，PCR引物为T7(5、TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:86》和SP6(5、ATTTAGGTGACACTATAG(SEQIDNO:87))。由于与去饱和酶具有序列相似性的经测序的来自雄性士兵甲虫组织的克隆中有大约70°/。是CL6，因此使用限制性酶及^1消化PCR产物以除去CL6克隆。在获得的70个PCR产物中，仅有20个没有被it^I消化。所得到的去饱和酶片段是CL7、CL8以及一种新的独特的去饱和酶片段，称为CL9。使用雌性成体RNA和引物Clu一f/Clu一r进行的另一简并PCR反应得到了16个另外的克隆并得到了它们的核苷酸序列，将这些序列与前面的克隆进行比较，并将其中之一命名为CL1。表4一用于分离C.的内部去饱和酶片段的RNA的组织来源和简并弓<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>切取雄性和雌性混合群体的防卫腺组织。首先去除头和翅鞘。剩下的组织分为两部分一一腹部样品和防卫腺组织。如上提取RNA并合成cDNA。如下3组不同引物组合用于简并PCR:Clu—f/Clu一r、F2/Clu—r和XRF2b(5TTYTTYTWYKCNCAYATGGGNTGG(SEQIDNO:88))/Clu一r。在1.5%琼脂糖凝胶上分析后，仅在使用XRF2b/Clu一r组合的样品中观察到预期大小的条带。其他两对引物甚至在60个循环的PCR之后均未观察到任何扩增产物。使用QIAgenQIAquickPCR纯化试剂盒纯化所得到的PCR产物并克隆至pGEM-T-Easy。通过测序分析检查了11个克隆。得到的新的去饱和酶基因片段命名为CL3和CL5。CL5内部片段似乎含有残余的内含子，因为测定到这样一个部分，其与去饱和酶没有密切的序列相似性，而且影响了读码框，插入终止密码子。5、浙J、WC五议莸淳全长,身/家唐基于每一上述克隆的简并引物结合位点内的序列设计了用于5，-和3'-RACE的引物(表5)。表5—用于5、和3、RACE的引物(5，至3')<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>根据生产商的说明，使用ClontechCreatorSMARTSystem用来自腹部或防卫腺组织的RNA获得了5、和3'RACE产物。寡核苷酸引物SmartIV(5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG(SEQIDNO:97))和CDS鹏、(5、ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_iN;N=A,G,C或T;N-产A,G或C(SEQIDNO:98))用于反向转录PCR。5、RACE反应使用引物CDSV5、AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQIDNO:99)和CLXfront引物。3、RACE反应使用引物CDS111/3、PCR和CLXend。通过集落PCR筛选克隆的插入体。用DNA序列分析检查所有产生预期条带(~350bp)的克隆。首先检查DNA序列与去饱和酶的序列相似性。使用来自内部序列即5、RACE和3、RACE产物的序列信息在硅片上汇编全长序列，并检查以ATG作为起始并终止于终止密码子的且翻译后具有去饱和酶的全部基序(表2)的开放读框。实施例5—分离全长的C.fag^Ws去饱和酶cDNA按照生产商的说明，使用Invitrogen的一步法RT-PCR试剂盒和PCR条件55〃2(见上)获得CL1和其他去饱和酶样序列的全长cDNA克隆。使用的弓l物是GGTACCATGCCACCCAACGCCCAC(SEQIDNO:100)和GAATTCTCACTTTTGTTTGTGAGT(SEQIDNO:101)。使用QIAgen的QIAquickPCR纯化试剂盒，按照生产商的说明纯化大约1kb的条带，并克隆至pGEM-T-Easy。获得阳性克隆并通过DNA序列分析进行检查。验证序列后，以限制性酶消化含有去饱和酶cDNA的pGEM-T-Easy克隆，以切下插入体，在1%琼脂糖凝胶上分离，切下lkb的片段并以QIAquick胶回收试剂盒(QIAgen)纯化，用于克隆至酵母表达载体，例如pYES2(见下)。实施例6—分离C77aM//ogyfl^i^wo6!7&fas的去饱和酶基因C7;a"fogwflte"。Zu7/o加伍〃.cfeoM)是另——禾中士兵甲虫，其类似于C/wg"Z^j但通常较小且在澳大利亚东南部分布较少。这些甲虫与蛾例如拟谷盗属的关系不密切，实际上它们在昆虫纲内离得很远。采用上述的Trizol法提取C.woMWus成体的RNA。使用Invitrogen的SuperscriptII试剂盒合成cDNA。进行3组简并PCR。第一组使用简并引物F2/Clu—r，第二组使用简并引物XRF2b/Clu—r，而第三组使用简并引物Clu一fClu一r。1.5%琼脂糖凝胶分离测定用量的各个反应产物，在前两组反应中观察到了条带。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAgen)将其纯化并克隆至pGEM-T-Easy。通过DNA序列分析检査来自第一组PCR的总共12个克隆以及来自第二组PCR的总共14个克隆。获得了3种独特的去饱和酶序列，它们的相应的来自C./"g"6^的直系同源物以及特征性基序(Knipple等(2002))在表6中给出。59表6—分离自C."o6///^^的内部去饱和酶片段及其在C./"gw6Wj中的相应的直系同源物。还显示了特征性基序和用于分离这些内部片段的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>用于分离CwWz7/w^的内部去饱和酶片段的第二种方法是使用特异于C.去饱和酶的引物。使用上述合成的cDNA作为模板，用CL6、CL7、CL9和CL1的特异性引物进行PCR。测定用量的各个反应产物经1.5%琼脂糖凝胶分离，用CL7、CL9和CLl-特异性引物观察到了条带，但用CL6或CL10引物没有观察到产物。使用QIAgenQIAquickPCR纯化试剂盒纯化CL7、CL9和CL1产物并克隆至pGEM-T-Easy。获得了阳性克隆并通过DNA序列分析检查。如实施例5所述，使用Invitrogen的一步法SuperscriptII反转录酶/Platinum『a《DNA聚合酶试剂盒从C./wM/af^RNA扩增到CL3禾nCL1直系同源物的全长cDNA序列。表7给出了使用的引物。对各个反应获得的克隆进行测序以确认各个cDNA性质。表7—用于获得选定的去饱和酶的全长C.朋6z7&加直系同源物的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>实施例7—从cDNA文库分离去饱和酶基因辦来^C./一Ws腐微恭柳c藩J乂庠采用上述方法提取C.lugubris腹部组织的RNA。采用InvitrogenCloneminer试剂盒按照生产商的说明构建cDNA文库。将部分文库转化至大肠杆菌DH10BElectroMax感受态细胞(Invitrogen)并在含25pg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上选择转化体。大约90%的克隆含有平均大小为1.5kb的插入体。通过PCR方法或使用来自上述克隆的探针通过杂交筛选从文库中鉴定并分离去饱和酶克隆。PO方法,遂廣粒c房^文库将其体积代表大约50个集落形成单位的质粒cDNA文库接种于含有300plLB并补充了50pg/ml卡那霉素的96孔板，37°C生长过夜并摇动。来自板中各孔的100^1的各个液体培养物汇集至1.5ml管中以得到8个"道汇集物(lanepools)"，比国内使用QIAquickminiprepspin试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明提取质粒。10h1的各个"道汇集物"洗脱物混合至1.5ml管中，产生"板汇集物"。使用基因特异性引物在各"板汇集物"上进行PCR筛选，并在1%TAE琼脂糖凝胶上电泳，以鉴定阳性板汇集物。一旦鉴定到阳性板，则在相应于阳性"板汇集物"的"道汇集物"上重复PCR筛选，并在1%TAE琼脂糖凝胶撒谎功能电泳，以鉴定阳性"道汇集物"，并在随后的筛选轮次中鉴定单个孔和各个集落，以分离阳性克隆。通过限制性酶消化和序列分析来分析含有感兴趣的基因的质粒。鄉微微桌驗效嫌透制备10倍系列稀释的cDNA文库(l-106)，并在补充了50pl/ml卡那霉素的LB琼脂上铺板，以确定在每个82mm培养皿内产生大约300-500个集落的稀释度。将合适稀释度的转化的细菌分布在补充了5(^g/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37。C温育过夜。将集落印在尼龙膜(Hybond-N+,AmershamBiosciences)上并按照集落杂交的标准方法进行处理。使用dNTP加生物素-dATP标记的去饱和酶基因片段和DNA聚合酶IKlenow片段，按照NEBlotphototope试剂盒(NewEnglandBiolabs)制备生物素标记的DNA探针。探针与膜在65°C(高严格性)或55°C(中等严格性)杂交过夜。按照Phototope-StardetectionKit手册(NewEnglandBiolabs)附录C中详述描述的对集落杂交的改进方法检测杂交的生物素化的DNA。将膜暴露于HyperfilmECL(Amersham61Biosciences)达1分钟，并按照AmershamBiosciences的建议手工处理。通过限制性酶消化和测序分析来分析阳性杂交克隆。实施例8—酵母表达载体构建和基因功能性分析在酿酒酵母中表达各个全长去饱和酶基因，以便使用酵母表达载体pYES2或pVT100-U(Vemet，T等1987)进行功能性表征。检查含有推定的去饱和酶基因的各个基因组区域的限制性核酸酶的识别位点。选择不切割基因组区域但有助于定向克隆至pYES2或pVT100-U内的限制性酶。设计针对预测的去饱和酶基因的最5'和3'区域的引物(表8)，各个引物的5'端具有限制性位点以便定向克隆。制备酵母载体DNA并以相应的限制性酶消化，然后以小牛肠道碱性磷酸酶(Roche)去磷酸化。去磷酸化后，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAgen)纯化消化的载体。将从胶中提取的含去饱和酶片段与消化的载体连接，连接物转化至大肠杆菌.DH10B，在含有100jig/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择转化体。通过限制性酶分析确认含有的插入体的克隆。表8—用于定向克隆至pYES2的引物，限制性位点以粗体字显示。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>3反向GAATTCTTAATAATCACAATCCCC(SEGIDNO:46)4正向AAGCTTATGACGGAAGGCAGCGATGAA(SEQIDNO:47)4反向GCGGCCGCTCAGTTAAAATCCTCCATTTT(SEQIDNO:48)正向GGATCCATGCCACCCTATGTGTCC(SEQIDNO:49)5反向GCATGCTTAATTAAAATCGTCAGA(SEQIDNO:50)6a正向GGATCCATGACACCAAATGCTTCA(SEQIDNO:51)6a反向GAATTCCTACGCACTCTTCCTATG(SEQIDNO:52)6b正向GGTACCATGCTAATCTTACTTTCC(SEQIDNO:53)6b反向CTCGAGCTAATGAAATTTTGAAGG(SEQIDNO:54)7a正向GGATCCATGTTTCAAACACCCATCGTCTGG(SEQIDNO:55)73反向CTCGAGTTATTGCCCAGTCCTCAAAACCCGCTT(SEQIDNO:56)7b正向GGATCCATGGTAGATTTGTTTTTG(SEQIDNO:57)7b反向GAATTCTTA丁TTTTGCAATTGTTT(SEQIDNO:58)8正向GGATCCATGGCTCCAAATTCGCTC(SEQIDNO:59)8反向GAATTCTTACAGTTCTTTGCTACT(SEQIDNO:60)0正向GGATCCATGTCGGCCCAGACCATT(SEQIDNO:61)10反向GAATTCTTAATCCTCCTTCCTGTT(SEQIDNO:62)11正向AAGCTTATGGGAGCGCTCAAACAA(SEQIDNO:63)"反向GAATTCTTAACCATTTGCCGTAAC(SEQIDNO:64)12正向GAATTCATGGCTCCTAATTTGCTAGGA(SEQIDNO:65)12反向CTCGAGTTAATCAAATTTCTCTCTACT(SEQIDNO:66)游表这教達伴斧众^"激^^艏寧^两种酿酒酵母宿主菌株用作pYES-衍生的构建体的受体。它们是S288C63(基因型MATa,SUC2gal2malmelflolflo8画lhapl(MortimerandJohnston(1986))和OLEl(his3Al，leu2A0，ura3A0，YMR272c::kanMX4)，其是编码A9-去饱和酶的基因的突变体，可用于互补性分析。5种酿酒酵母宿主菌株用作pVT-100衍生的构建体的受体。它们是S288C、OLE1和INVSCi(MATa，his3Dlleu2trpl-289ura3-52)、YPH499(MATa,ura3-52lys2-801—amberade2-101一ochretipl-A63hisl-A200leu2-Al)和ELO-l(MATahis3Mleu2A0metl5A0ura3A0AELOl)。转化过程中对这些菌株进行相同的处理，不同之处在于所有用于培养酿酒酵母0LE1的培养基中加入17:1(顺式-10-十七烯酸，1mM)和Tergitol(NP-40;1%)，而所有用于培养ELO-l的培养基中加入遗传霉素(200pg/ml)。为进行转化，将各个酿酒酵母菌株划种至YPD(20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，2%葡萄糖)并在30。C生长数日。使用Sigma酵母转化试剂盒按照生产商的说明进行转化。在SCMM-U琼脂平板(6.7g/1不含氨基酸的酵母氮基，1.92g/1不补充尿嘧啶的酵母合成缺陷培养基，2%葡萄糖和2%琼脂)上30。C选择转化体达5天。针对各个构建体对多个转化体进行选择，并测试是否存在质粒DNA。^化沐游緣"为了确认转化体内表达构建体的性质，使用Pierce(Illinois)的Y-DER酵母DNA提取试剂盒，按照生产商的说明从接种环量(loopfol)的培养物分离DNA。使用基因特异性反向引物和T7引物(载体引物)通过PCR分析分析并确认了的质粒存在。观察到了阳性条带，保留相应转化体用于进一步分析。微固/舰#丝取50微升培养于含顺式-10-十七烯酸(1mM)和1%Tergitol的SCMM-U的OLEl转化体，离心(13，000rpm，3ses)收集并重悬于50piYP(20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物)。重悬的混合物按1:10稀释，将20)al的各种混合物点样在含2%半乳糖的YP板上以诱导去饱和酶基因表达，将这些板在30。C温育3-5天。过程是否出现生长。含顺式-10-十七烯酸(1mM)和1%Tergitol的对照板用于确保酵母的活力。OLEl对拟谷盗属和花萤属去饱和酶的互补性测试结果如下。阳性互补见于Tribdesat2a、Tribdesat5、Tribdesat6a和Tribdesatll，后者具有滞后期。在Tribdesat2b和Tribdesat8观察到可能的弱互补。对Tribdesatl、Tribdesat2c、Tribdesat4、TribdesatlO、Tribdesat12、CL1和CL3没有观察到互补性。当异源性表达的基因表达功能性A9-或M1-去饱和酶时出现酵母的OLE1表型互补性，并导致产生棕榈油酸、油酸、或顺式-ll-硬脂酸等脂肪酸。因此，结论是，Tribdesat2a、Tribdesat5、Tribdesat6a和Tribdesatll是去饱和酶，它们能够使得OLEl酵母细胞的天然脂质去饱和以产生互补性脂肪酸之一，且因此它们类似于对C16:0或C18:0具有活性的A9去饱和酶、或对C18:0具有活性的All去饱和酶，而Tribdesatl、Tribdesat2c、Tribdesat4、TribdesatlO、Tribdesat12、CL1和CL3不太可能编码这些活性之一，且因此编码的可能是不太的去饱和酶。歸靴娜辦柳谱辨/縱邀衍生自菌株S288C或OLE1的酵母转化体接种于25ml合成的不含尿嘧啶的酵母用基本限定培养基(minimaldefinedmedium)(SCMM-U培养基)，含2%葡萄糖和为OLEl菌株额外添加的0.5mM顺式-ll-十七烯酸。接种物在30°C摇动生长24-48小时。确定培养物的OD600。为此，计算了在50ml诱导培养基中要获得0.4的OD600所需的培养物的量。取该量的接种培养物离心(1500xg离心5分钟，4。C)沉淀细胞。细胞重悬于10ml诱导培养基，即SCMM-U，含有2%半乳糖、1%棉子糖和0.5mM脂肪酸底物(添加至乙醇/20%Tergitol中)，并为OLEl衍生的转化体额外地添加了0.5mM顺式-ll-十七烯酸。各个培养物在30。C摇动生长24-48小时。随后取2ml或全部培养物，离心收集细胞后用于分析脂肪酸，如果需要可储存于-20。C。^存众游激#摩母楚攻應廣#分叛用1%Tergitol水溶液洗涤来自脂肪酸补料实验的酵母细胞，4°C1500xg离心5分钟。细胞沉淀(200-500mg)重悬于水，然后转移至玻璃试管并再次沉淀细胞。使用SavantSpeedVacPlusSC110A浓縮/干燥器去除细胞沉淀中的水。直接使用细胞沉淀或如下所述使用溶剂提取脂质。基于ModifiedFolchMethod(Protocol7，pp22-24,LipidAnalysis,HamiltonandHamilton,1992)提取脂质。以2ml氯仿/甲醇(2:1)提取脂质，并加入0.5ml的盐水，即0.9%w/vNaCl水溶液。充分漩涡混合该混合物。随后使之分层；当出现大量细胞碎片时将样品2500xg离心5分钟。去除并丢弃上层水相。底层溶剂层移至干净的玻璃试管。在氮气中干燥，30°C。分析之前先通过两种不同的甲基化方法对脂质进行衍生化。第一种是结合型脂肪酸的碱性甲基化，即脂肪酸存在于三酰基甘油或磷脂中，没有游离脂肪酸，该方法基于Christie(2003)的方法。脂质样品首先溶解于0.5ml己烷。加入60m1乙酸甲酷，随后是50pl甲醇钠(0.5M，溶于甲醇)。然后充分混合密封的试管，并置于50°C的加热块上达IO分钟。冷却5分钟之后加入一滴乙酸。样品在30°C的轻柔氮气流中干燥，溶解于200pl己烷并转移至小管，随后进行GC分析。第二种方法是对全部游离的和结合型脂肪酸进行酸性甲基化，基于Lewis等(2000)的方法。甲醇溶液，即2ml甲醇/盐酸/氯仿(10:1:1)，加至干燥的酵母沉淀或提取的脂质样品中。充分混合密封的试管，并置于90°c的加热块上达60分钟。冷却10分钟之后加入1ml的0.9%盐水(NaCl水溶液)。然后以0.3ml己垸提取甲基化的脂肪酸。将己烷层转移至小管内然后分析。通过GC和GCMS分析这些脂肪酸甲基酯(FAME)样品。使用配备有火焰离子化检测器(FID)和BPX70毛细管柱(长度30m，i.d.0.32mm，膜厚度0.25pm)的Varian3800气相色谱仪进行GC分析。以分流模式(splitmode)进行注射，使用氦气作为载体气体，初始柱温度为100°C。温度以3。C/分钟升高直至150°C，然后以5。C/分钟升高直至170°C，保持5分钟，随后以50。C/分钟升高直至255°C。使用类似的色谱条件进行GC/MS分析，但初始柱温度为60°C，以20。C/分钟升高直至H0。C，保持5分钟，然后以50。C/分钟升高直至255°C。使用TECPolarisQIonTrap或Varian1200SingleQuadrupole质谱仪进行检测。在50-400原子质量单位(amu)之间的全扫描模式中，以正电子撞击获得质谱，扫描速度为每秒2次。对应于色谱图中的各个峰的质谱被自动地与计算机化的NIST文库中的谱进行比较。这样便试验性地鉴定到那些与文库谱高精确度匹配并与真实标准品同时被洗脱下来或是以合理的保留时间被洗脱下来的测试谱。通过以下方法确认了脂肪酸的性质使用Yu等(1988)的方法将脂肪酸转化为其二甲基噁唑啉(DMOX)衍生物，并与Dobson和Christie(2002)及其中的参考文献所述的DMOX质谱进行比较。66縻草^^^劝虔丝i^f^"菜根据上述实验和表10(见下)的总结，得出如下结论7>肠犯&对长度为C10:0至C16:0的饱和脂肪酸碳链(当这些脂肪酸被补料至酵母转化体中时)具有A9去饱和酶活性。对14:0的活性最大，不过15-.0和16:0也是有效的底物。在酵母细胞中，其对18:0、20:0或更长的饱和脂肪酸没有可检测到的去饱和酶活性。该蛋白质的推定长度为320个氨基酸，并包括8个保守性去饱和酶基序和3个His盒(表3)。基于与已知的酰基辅酶A去饱和酶的序列同源性，推测该酶作用于酰基辅酶A底物。该酶因此被表征为豆蔻酰-辅酶AA9去饱和酶。7WMg^6浙7HM咖Gc是密切相关的蛋白质，基于使用BLOSUM62的总体比对，具有64%氨基酸序列相同性，它们分别从棕榈酸和硬脂酸催化产生5-十六碳烯酸和5-十八碳烯酸。它们因此被表征为作用于饱和底物C16:0和C18:0的A5去饱和酶。它们在酵母细胞中将C18:0转化为C18:1A5的转化效率是将C16力转化为C16:lAs的效率的两倍以上(表9)。在各种情况中，这些酶能够将至少8.0%的底物转化为产物，Tribdesat2b对C18:0则为至少40%。当补料至酵母细胞中时，没有检测到这些酶使C14或更短的底物(包括C14:0或C14:l,或C20或更长的底物(包括C20:0或C20:l^)去饱和。此外，这些酶没有去饱和单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸，包括C16:1A9、C18:1A9、C18:2或C18:3。这些蛋白质包括8个保守性去饱和酶基序和3个His盒(表3)，并与己知的酰基辅酶A去饱和酶具有序列同源性。它们因此被表征为硬脂酰-辅酶AA5去饱和酶。它们还具有棕榈酰-辅酶AA5去饱和酶活性。表9一表达Tribdesat2b或空pYes载体的酵母细胞(提供了0.5mM18:0)的脂肪<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>Cahoon等(2000)从白芒花(丄/w"a"^^)分离了编码一种A5去饱和酶的基因，该酶对C20:0的活性高于对C18:0或C16:0的活性，因此其不是在此所定义的硬脂酰-辅酶AA5去饱和酶。Sayanova等(2007)从^"emo"e/eve/〃d的种子中克隆了两种编码A5去饱和酶的基因，所述的酶对酰基辅酶A底物有活性。去饱和酶AL21对饱和底物和不饱和底物C16:0、C18:0禾BC20:2均有活性，而AL10仅对C20:2，n-6有活性。不过，AL21对不饱和底物的活性高于对饱和底物的活性，因此其不应该被认为是在此所定义的硬脂酰-辅酶AA5去饱和酶。当比较这些蛋白质的全长序列时，氨基酸序列的相同性程度为AL21与Tribdesat2b之间为25%;AL21与Tribdesat2b之间为27%;ALIO与Tribdesat2b之间为24%;ALIO与Trib2c之间为28%。因此，可以得出这样的结论，即植物的与昆虫的酰基辅酶A依赖性去饱和酶之间没有明显的同源性或几乎不具有同源性。7h'Z^g^d浙7WZ7^m/在酵母细胞中表现出A9去饱和酶的活件，它们主要且非常高效地作用于硬脂酸以产生油酸。它们还对棕榈酸具有某些活性，可产生棕榈油酸。当底物被补料至酵母细胞中时，没有检测到这些酶使C14或更短的底物(包括C14:0或C14:l,或C20或更长的底物(包括C20:0)去饱和。它们因此被表征为硬脂酰-辅酶AA9去饱和酶。7>驗』能够去饱和棕榈酸产生棕榈油酸，因此被认为是A9去饱和酶。没有检测到其在酵母细胞中对C14或更短的底物、或对C18:0或更长的饱和底物、或对单不饱和或多不饱和底物(包括C16:1A9、C18:1A9、C18:2或C18:3)具有去饱和酶活性。因此其似乎对棕榈酸具有特异性。该蛋白质的推定长度为374个氨基酸，并包括8个保守性去饱和酶基序和3个His盒(表3)。基于与已知的酰基辅酶A去饱和酶的序列同源性，推测该酶作用于酰基辅酶A底物。该酶因此被表征为棕榈酰-辅酶AA9去饱和酶。7WMey"W0对棕榈油酸和油酸晶示出A12去饱和酶活性，分别产生C16:2A9，412和C18:2A9，A12(LA)。在酵母细胞中转化油酸底物(至少30%被转化)的效率是转化棕榈油酸的大约2倍。没有观察到对C16:0、C18:0或更长的饱和底物、或C14或更短的底物(包括C14:l^)具有活性，因此该酶似乎象A12去饱和酶一样特异性作用于连接于辅酶A的长度为C18和C16的A9-单不饱和底物。该蛋白质的推定长度为366氨基酸，并包括8个保守性去饱和酶基68序和3个His盒(表3)。基于与已知的酰基辅酶A去饱和酶的序列同源性，推测该酶作用于酰基辅酶A底物。因此该酶被表征为油酰-辅酶AA12去饱和酶。其还显示出棕榈油酰-辅酶AA12去饱和酶活性。认为这是第一个被表征为编码这样一种酶的基因。7W6血"〃7对链长为C14:0至C24:0的饱和底物显示出A9去饱和酶活性，观察到其对C22:0(称为山嵛酸或二十二酸)和C24:0(称为木蜡酸或二十四烷酸)具有最大的转化效率。因此，该酶被认为是二十四酰-辅酶AA9去饱和酶，不过其也具有二十二酰-辅酶AA9去饱和酶活性。CX7对棕榈油酸和油酸显示出A12去饱和酶活性，分别产生C16:2A9'A12和LA，这与TribdesatlO的活性谱相同，但其活性不如TribdesatiO那样有效。m对C14:0显示出有效的去饱和作用活性，产生C14:1气没有检测到该酶对C12:0或C16:0的活性，因此其似乎是特异性的豆蔻酰-辅酶AA9去饱和酶。其对单不饱和底物例如C12:1A5或C20:l没有活性。基于与已知的酰基辅酶A去饱和酶的序列同源性，推测该酶作用于酰基辅酶A底物。该酶因此被表征为豆蔻酰-辅酶AA9去饱和酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>实施例9一将去饱和酶基因克隆至Gateway入门载体pENTRll为了构建功能性基因或待在Gateway入门载体中测试的基因，用限制性酶消化含有全长基因序列的pGem-T-Easy构建体，以切下插入体。在1%琼脂糖凝胶上分离，并使用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen)，按照生产商的说明纯化大约lkb片段的DNA。制备Gateway入门载体pENTR11(Invitrogen)并用所需的限制性酶消化，并用小牛肠道碱性磷酸酶(Roche)去磷酸化。基因片段与载体连接并转化至大肠杆菌菌株JM109。在含50吗/ml卡那霉素的LB琼脂平板上选择转化体。通过限制性酶和序列分析确认含有插入体的克隆。獰去齒浙艨基茵克蘑至Ga^w^^游载沐以建J表这克虔选定两种表达系统，SF9昆虫细胞和拟南芥，并为它们各自选择Gateway表达载体。对于SF9昆虫细胞，选择pDEST8，并在LB上筛选DH10Bac转化体，该LB补充了卡那霉素(50ng/ml)、庆大霉素(7ng/ml)和四环素(10pg/ml)、Bluo-gal(100吗/ml)和IPTG(40pg/ml)。为转化拟南芥，选择二元载体pXZP391(CSIROPlantIndustry),并在补充了壮观霉素(50pg/ml)的LB上筛选转化体。制备含基因插入体的pENTRll克隆和合适的pDEST载体，并按照生产商(GatewayLRclonase酶混合物，Invitrogen)的说明进行LR重组反应。为了pXZP391，将所得重组混合物转化至大肠杆菌菌株JM109(Invitrogen)，或为了pDEST8，将所得重组混合物转化至大肠杆菌菌株DH10Bac(Invitrogen)。通过限制性酶分析和使用载体特异性引物的序列分析确认了含有正确插入体的转化体。实施例IO—用重组杆状病毒产生昆虫去饱和酶或acetylenase采用上述Gateway重组方法将Tribdesat2b和CL3基因克隆至pDest8载体(Invitrogen)。通过热休克法用pDest8克隆转化感受态DH10Bac细胞(Invitrogen)。在LB琼脂上筛选转化体，所述LB含卡那霉素、四环素和庆大霉素(分别为50叫/mL、10jiig/mL和7ng/mL)和适当浓度的IPTG和Xgal，并在此培养基上再次划线接种以便纯化。一旦DH10Bac中出现了重组事件，则使用M13正向和反向引物鉴定重组杆粒(现称为pFastbac)，以便集落筛选71DH10Bac细胞中的pFastbac内的2b和CL2插入体。阳性克隆产生大约3kb的条带。挑选没有任何空载体污染迹象(空载体可观察到300bp的产物)的克隆用于下面的用途。将含有具有2b和CL2插入体的pFastbac质粒的转化体在LB培养基(含抗生素)上生长过夜。使用的是改进的碱性裂解质粒分离方案，按照Bac-to-BacExpressionSystem手册上生产商的说明进行。分离的DNA溶解于40pL的1XTE缓冲液，pH8.0，并采用Nanodrop分光光度计定量，4。C储存。存籴虔^潘應Sf9(草地夜蛾卵细胞系)细胞接种于6孔组织培养板，9乂105个细胞/孔，每孔2mL的SF900II无血清培养基(Invitrogen)。允许细胞在孔的表面粘附2小时，27。C。为进行各个转染，将l)ig纯化的杆粒DNA稀释于聚苯乙烯管中的100uL的无添加Grace's培养基(Invitrogen)中。6pL的Cellfectin⑧试剂(Invitrogen)稀释于聚苯乙烯管中的100jiL的无添加Grace's培养基中。然后将DNA和Cellfectin⑧试剂混合并室温温育30分钟。在温育DNA:脂质复合物时，以2mL的无添加Grace's培养基洗涤细胞一次，然后去除培养基。将0.8mL的无添加Grace's培养基加入至DNA:脂质复合物，混合然后添加至洗涤的SF9细胞中。转染在27°C进行5小时。将DNA:脂质复合物从细胞移除，并加入2raL的SF900H。细胞在27。C温育，直至出现明显的感染迹象。一-旦细胞表现出被感染，通过将细胞培养基在20°ClKrpm离心5分钟收集病毒。将净化后的细胞培养基转移至管中，储存于4°C。这称为Pl病毒原液。r撒拔竊碰用Sf9细胞接种25cm4咅养瓶，1Xl(^个细胞/mL，共5mL培养基。用Pl病毒原液感染细胞，感染复数(MOI)为0.1病毒颗粒/细胞，按照5乂106个细胞/mL估计。27。C48小时后，细胞表现出感染迹象，如上所述收集细胞培养基。这称为P2病毒原液。然后用P2原液产生P3原液。细胞接种于75cm2培养瓶中，lXl()6个细胞/mL，共15mLSF卯OII培养基，以MOI为0.1病毒颗粒/细胞进行感染，按照5X10S个细胞/mL估计。27。C48小时后，细胞表现出感染迹象，如上所述收集细胞培养基。这称为P3病毒原液。72为了确定各个P3原液的确切滴度，进行TCID5。(组织培养物感染剂量)。96孔板中每孔接种3X1()S个细胞。细胞在27。C温育过夜。制备10倍稀释的病毒直至10'8。50pL的10-3-10'8稀释物各加入至8个孔中。将TCID5()在27。C温育7天。评价各孔病毒感染是阳性还是阴性。确定病毒滴度后即可以已知的感染复数(MOI)感染SF9细胞。取感染的细胞并真空干燥。使用前述的直接酸性甲醇试剂获得感染了表达Tribdesat2b的构建体的昆虫细胞的脂肪酸甲基酯，并通过GC/MS进行分析。GC/MS痕量和色谱显示，与SF9对照相比，表达Tribdesat2b的SF9产生C16:1A5和C18:1A5。经构建体转导的昆虫细胞内的C16:0至C16:ld5的转化效率为16.9%，而C18:0至C18:ld5的转化效率为29.7%。这些数据证实了从表达Tribdesat2b的酵母细胞得到的数据，因此可得出结论，该基因编码对C16:0和C18:0底物具有活性的A5-去饱和酶，且对后者的活性较大。因此其基本上确定编码硬脂酰-辅酶AA5-去饱和酶，以往还没有报道发现克隆的基因上具有这种活性。类似地，也预期另一种去饱和酶在昆虫细胞中具有活性。实施例ll一在植物中表达拟谷盗属和花萤属基因如上所述将拟谷盗属TribdesatlO和2b基因克隆至pENTRll，随后重组至植物表达载体pXZP391中，后者用于表达置于分离自甘蓝型油菜(^ra^/c"朋，"的种子特异性napin启动子(Fpl)(Stalberg等，1993)控制下的编码区插入体。将表达质粒转化至根癌土壤杆菌AGL1，并用于通过植物转化法(inplanta)转化至缺乏A12-去饱和酶活性的拟南芥fad2/fael双突变体内。喷涂接种植物3-4周后收集种子并在选择性培养基上铺板。在含有40mg/L卡那霉素和100mg/L特美汀的MS培养基上鉴定Tl转化的植物并转移至温室花盆中。气相色谱法分析来自Tl植物的T2种子的脂肪酸组成。图6所示数据证实了TribdesatlO在拟南芥中具有A12去饱和酶活性，因为在fad2/fael突变体植物中从油酸产生了LA。縫鹏鹏盧微郷微柳表这Tribdesat2b、CL1和CL2编码区以"有义"方向克隆至植物表达载体pVEC8(Wang等，1997)中，置于调控序列CaMV35S启动子和章鱼碱合酶转录终止/多腺苷酸化信号(Gleave，1992)的控制下，这可在绝大多数植物组织中造成的转基因强组成型表达。通过土壤杆菌介导的叶组织转化(Horsch等，1985)将转基因引入至烟草内，并在含潮霉素的培养基上筛选转基因细胞系。基于潮霉素抗性筛选转基因植物细胞，该抗性由pVEC8衍生载体内的/2/^抗性标记物基因赋予。培养转化的烟草株以产生愈伤组织或再生为整个植物，这取决于筛选和生长培养基内的植物激素方案(MurashigeandSkoog，1962;Horsch等，1985)。通过在愈伤组织诱导性植物激素(0.5mg/L吲哚乙酸(IAA)和0.05mg/L激动素)上筛选而产生未分化转基因烟草愈伤组织，愈伤组织维持在琼脂平板上。首先通过加入苗诱导性植物激素(100jLig/LN-6-苄基腺嘌呤(BAP)禾卩500ng/LLIAA)在苗诱导性培养基上筛选转基因材料而产生分化的烟草植物。在该培养基上生长3周后，从叶盘切下单个的烟草顶体(apices)，并再次铺板于含根诱导性植物激素(50ng/LIAA)的根诱导性培养基上。根的形成再需要3周。根据需要，选择转基因材料，即愈伤组织或整个植物，用于分析。还使用LRclonase将Tribdesat2b基因重组至植物表达载体pXZP393(CSIROPlantIndustry)内，置于组成型CaMV35S启动子的控制下。所得表达质粒pXZP384被转化至AGL1内，并用于如上所述植物转化至烟草的叶子内。通过GC和GC-MS分析转基因烟草叶和种子的脂肪酸组成，以显示因添加新的去饱和酶活性而造成的脂肪酸组成的改变。实施例12—从美洲蟋蟀克隆去饱和酶基因一些昆虫被认为具有A12-去饱和酶活性，但尽管20年间付出了大量的努力，迄今尚未分离到编码这种酶的基因。直至本发明之前仍不清楚这方面不成功的原因。一种已知具有A12-去饱和酶活性的昆虫是美洲蟋蟀，即普通蟋蟀。在最初试图克隆美洲蟋蟀A12-去饱和酶基因时，所使用的一组简并引物AdD12Des-Fl(5'-TTGTTCTGTGTGGGTCAYGAYTGYGGWCA(SEQIDNO:127》和AdD12Des-Rl(5'-GTGATGGGCGACGTGACYGTYKGTRAT(SEQIDNO:128)是基于拟南芥A12-去饱和酶FAD2(P46313)、秀丽隐杆线虫(a^"or/wM/fee/eg^w)A12-去饱和酶FAT-2(AAF63745)和A15-去饱和酶FAT-1(L41807)的保守性组氨酸盒I和组氨酸盒III区域(相应于FAT-2的LFCVCHDCGH(氨基酸残基88-97)和ITNGHVAHH(氨基酸残基291_299))而设计的。不过，尽管反复尝试并反复改变条件，但使用美洲蟋蟀脂肪体总74RNA和这组引物进行的RT-PCR反应均未能扩增到任何特异性产物，这提示美洲蟋蟀编码A12-去饱和酶的基因可能与植物或线虫A12-去饱和酶基因具有很低的同源性。考虑了一种不同的方法来克隆美洲蟋蟀A12-去饱和酶基因。基于来自包J舌纟工带巻蛾(/4rg>rotoew/ave/wf/"awa)(AAF44709)、家蚕(5owAy;cwon〕(BAD18122,AAF80355)、苹浅褐巻蛾(五p^/^ospos加'加"a)(AAK94070)、烟夜蛾(//e/fcoverpaaww/0(AAM28484，AAM28483)、谷实夜蛾(AAF81787，AAF81788)、家蝇(MuycadoweWca)(AAN31393)、亚洲玉米螟(OsW"/a/w"acafc)(AAL27034，AAL32060,AAL35746)、欧洲玉米螟(O.(AAF44710，AAL35330，AAL35331)、粉纹夜蛾(AAB92583,O44390:AAD03775)等物种的55种昆虫脂肪酸酰基辅酶AA9-、A10-、All-和A14-去饱和酶之间所共有的氨基酸序列同源性，设计了简并引物(AdD12Des-F25，-TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG(SEQIDNO:129)和AdD12Des-R25，誦TGRTGGTAGTTGTGVHANCCCTC(SEQIDNO:130))以试图克隆昆虫A12-去饱和酶基因，所述引物针对的是这些去饱和酶的两个保守区(FFFS/AHI/VGW(SEQIDNO:131)和EGY/W/FHNYHH(SEQIDNO:132)，对应于红带巻蛾A9-去饱和酶AAF44709的氨基酸残基145-152和263-270)。出乎预料的是，RT-PCR从美洲蟋蟀脂肪体总RNA中扩增到一个趋异性的360bp的去饱和酶样序列，连同另一种与已知的美洲蟋蟀A9-去饱和酶G^D9D化AF338466)的一部分相同的去饱和酶基因片段。使用GeneRacerKit(Invitr。gen)快速扩增cDNA末端和该360bp片段内部的序列得到一个1597bp的cDNA序列，命名为A/D72Z)es(SEQIDNO:133)，其编码一种357个氨基酸残基的肽(SEQIDNO:134)。将v4JD9Dw、A/D/2Des和7HMesaf川的cDNA序列各自克隆至酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，分别产生质粒pXZP277、pXZP282和pYES2-Trib10。将质粒pYES2、pXZP277、pXZP282和pYES2-Trib10转化至酿酒酵母o/e/株的细胞内，o/W株含有A9-去饱和酶敲除突变(Stukey等，1990)，以便测试该突变是否被互补并由此提示存在A9-去饱和酶活性。除非细胞内表达A9-去饱和酶，否则酵母WW细胞需要补充不饱和脂肪酸例如C16:l"以维持生长，这是互补测试的基础。在补充0.5mMC16:l^和1%NP-40的缺陷培养基(SD-Um)琼脂板上筛选o/W细胞的转化体。携带上述质粒的酵母o/W转化体首先生长在30°C的补充了0.5mMC16:l"和1%NP-40的YPD培养基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，直至OD6Q。大约为1.0。然后将样品调整至OD6。。为1.0，1:10系列稀释，并取1^L测定用量的各个稀释物点样在YPG琼脂平板上，该板与YPD培养基相同，不同之处在于前者含有2%半乳糖而不是葡萄糖，以诱导pYES2衍生的载体的基因表达。30。C培养2天后观察细胞的生长。美洲蟋蟀A9-去饱和酶在o/e/细胞内的表达明显互补了o/W表型，而美洲蟋蟀^ZD"Das的表达没有形成互补，说明其在酵母细胞内不具有A9-去饱和酶的功能。表达赤拟谷盗A12-去饱和酶的o/"细胞仅在存在添加的C17:l时才在YPG板上生长。这些数据证实，克隆的」^D"Z)m或7WWera/M基因不编码A9-去饱和酶家族的另一成员。还将这些表达质粒转化至酿酒酵母S288C细胞，这是一种普通的实验室酵母菌株。如Zhou等(2006)所述从酵母细胞提取脂肪酸甲基酯(FAME)并分析。酵母脂肪酸甲酯的气相色谱法(GC)证实，与仅具有pYES2载体的细胞(图7B)相比，.J^)72C^在酿酒酵母中的表达分别从C18:l和C16:l产生了新的二烯脂肪酸C18:2和C16:2(图7A)，这一点通过与纯(318:2^'12标准品具有相同的保留时间和质谱而得到证实。通过4，4-二甲基噁唑啉衍生物的GC-质谱法(FayandRichli，1991)证实，C16:2和C18:2产物的双键的位置位于A9和A12位，在m/z196和208,236和248之间间隔12个原子质量单位(图2C)。这些二烯的产生证实^aO/2Z)m和7WWera//0编码作用于C16:l^或C18:lA9的A12-去饱和酶。当表达于酵母菌株o/e7的细胞内时，赤拟谷盗A12-去饱和酶从C18:1产生C18:2的转化率为30.5%,从C16:l产生C16:2的转化率为16.0%(表11)，说明该酶偏向于C18底物而非C16底物。细胞内的底物脂肪酸水平同步降低。表ll一表达位于pYES2中的赤拟谷盗去饱和酶Tribdesat10的酵母o/e/细胞的脂肪酸组成(占总脂肪酸的％)，补料C16:1或C18:1底物，与空pYES2载体对照相比。__脂肪酸组成(占总脂肪酸的％)_12:014:015:016:016:117:016:217:118:018:118:2pYES2+C18:l3.02.20.741.70.20.6010.916.923.80Tribdesatl0+C18:l3.32.31.043.20.10.808.618.015.76.9pYES2+C16:l3.92.90.742.520.60.509.119.40.40Tribdesatl0+C16:l4.23.10.843.614.70.62.87.821.90.40美洲蟋蟀和赤拟谷盗A12-去饱和酶蛋白质编码区也被克隆至植物表达载体，分别产生质粒pXZP375和pXZP376，受控于种子特异性启动子(Stalberg等，1993)。如Zhou等(2006)所述通过根癌土壤杆菌将这些表达质粒引入拟南芥/"d2^e7双突变体(Smith等，2003)的组织，产生转化的植物。基本如前所述进行种子FAME的GC分析。表12显示了一个实例，经编码美洲蟋蟀A12-去饱和酶的^必WDm基因转化的6个转基因株有效产生了C18:2，产生的水平为种子油中总脂肪酸的至少42%，而C18:3为至少20%，两者在种子中均自C18:l产生。由于拟南芥/"d2^^/双突变体仍具有野生型A15-去饱和酶(FAD3)，因此，推测该酶在存在C18:2的情况下将其转化为C18:3。因此，这些转基因株产生的C18:3也是美洲蟋蟀A12-去饱和酶将C18:l转化为C18:2的产物，并代表了美洲蟋蟀A12-去饱和酶的产物。这一结果证实了所克隆的基因的A12-去饱和酶活性，并且是第一次在转化的细胞证实重组昆虫A12-去饱和酶。表12—/"c/2^^/双突变体内表达美洲蟋蟀AdD12Des的转基因拟南芥种子的脂肪酸组成(占总脂肪酸的％)。__样品C16:0C16:lC18:0C18:lC18:2C18:3C20:0C20:lfad2/fael*4.90.52.0990.210.22.060.00.35EY16.330.02.4626.6140.0724.53痕量痕量EY65.272.4885.933.742.470.11痕量EY72.90.044.729.123.30.0EY132.30.043.131.023.60.0EY153.90.025.446.224.60.0EY204.160,00.0555.8119.2021.11痕量痕量*fad2/fael对应于对照(未转化的)植物代表性酰基辅酶A或酰基脂质去饱和酶蛋白质序列的系统发生分析显示，AdD12Des和TribdesatlO的氮基酸序列与其他酰基辅酶A去饱和酶成簇(图9的右侧；图10)。用于本分析的昆虫去饱和酶的登记号和物种为AdD9，美洲蟋蟀AAK25796;AdD12，美洲蟋蟀SEQIDNO:(SEQIDNO:135);BmDl(Ml，家蚕AAF80355;BmDll，家蚕BAD18122;DmD9，黑腹果蝇(Dmsop/7flwe/a"ogosfer)CAB69054;MdD9，家蝇AAN31393;OnD9，欧洲|玉米螟AAF44710;OnDl1，欧洲玉米螟AAL35331;OnD14，欧洲玉米螟AAL35330;PoD9，尸/awotoWr/xAAF73073;PoD10，尸.octoAAG54077;TcD9A，赤拟谷盗XP—969607;TcD9B，赤拟谷盗XP—966962;TcD12,赤拟谷盗Tribdesat10(SEQIDNO:28);TnD9，粉纹夜蛾AAB92583;TnDll，T."/O44390;其他动物的去饱和酶AcD12-15，卡氏棘阿米巴04c朋f/zamo&acosfe〃am7)ABK15557;CeD12，秀丽隐杆线虫AAF63745;RnD9，褐家鼠(iaW^"orveg!'cws)P07308;细菌去饱和酶N36D9，Nostocsp,36CAF18423ANoD9，Nostocsp.PCC7120(加6a簡簡.a臉)BAA03434;NoD9，Nostocsp.PCC7120BAA03435;SyD9，集胞藻属PC6803BAA03982;SyD12，集胞藻属PC6803P20388;真菌去饱和酶LkD12，丄flc/w"ceaWwyven'BAD08375;MaD9，高山被孢霉(Mom'e/^/^a/p/加)BAA759W;Y1D12，解脂耶氏酵母(7謂油—一ca)CAJ81209;ScD9，酿酒酵母P21147;植物去饱和酶AtD9，拟南芥AAK76592;AtD12—FAD2(ERA12-去饱和酶)，拟南芥P46313;AtD12—FAD6(质体A12-去饱和酶)，拟南芥P46312;PgD9，白云杉(尸&eag/做c力AAM12238)。D9、D10、Dll、D12和D14分别指A9-、△10-、All-、A12-和A14-去饱和酶。AdD12Des和Tribdesat10的全长氨基酸序列与形成另一主要簇的优势酰基脂质去饱和酶的细菌A9-去饱和酶或植物、真菌和动物的A12-去饱和酶仅显示出很低的相同性(最高达23%)(图4左侧)。AdD12Des和Tribdesat10与来自其他动物、植物或真菌的A12-去饱和酶具有低水平的相同性这一点是特别出乎预料的。相反，AdD12Des与包括昆虫A9-去饱和酶(包括家蟋和赤拟谷盗(redflourbeetle)的那些酶)形成不同的一簇，这提示其可能是从A9-去饱和酶基因进化而来。AdD12Des的氨基酸序列这些酶的相同性程度分别为65.2%、55.2%、55.5%、53.5%、53.5%、55.3%、59.4%和53.6%，分别对应于来自美洲蟋蟀AF338466、黑腹果蝇CAB69054、家蝇AAN31393、欧洲玉米螟AAF44710、户.AAF73073、赤拟谷盗XP—969607、赤拟谷盗XP—966962和r.m'AAB9258的昆虫A9-去饱和酶。具体而言，AdD12Des在序列上与来自相同物种的A9-去饱和酶蛋白相对接近，具有大约65%的氨基酸相同性。由于TribdesatlO在系统发生树上出现在与包括拟谷盗属A9-去饱和酶(与78之具有高达48%的相同性)在内的其他酰基辅酶A去饱和酶不同的一个分支上，因此其可能是从昆虫A9-去饱和酶基因独立进化而来的。如图3的数据所示，当在酵母中表达时，AdD12Des对中链饱和脂肪酸C14:0和C15:0保留了低水平的A9-去饱和活性。图3A显示了仅表达pYES2载体的酵母细胞内的脂肪酸谱的部分GC图，而3B显示了表达pXZP282的酵母细胞内的脂肪酸谱，其具有额外的C14:l和C15:l峰。不过，在表达TribdesatlO的酵母内没有观察到A9-去饱和活性。这些发现提示，这两种昆虫A12-去饱和酶是从远古去饱和酶独立分开的。同样值得注意的是，来自秀丽隐杆线虫和卡氏棘阿米巴的其他动物A12-去饱和酶与植物A12-去饱和酶的相关性比与昆虫A12-去饱和酶AdD12Des和TribdesatlO的相关性更密切(与拟南芥A12-去饱和酶FAD2分别具有27.2%和38.6%的氨基酸序列相同性，或与美洲蟋蟀AdD12Des分别具有11.6%和11.1%的氨基酸序列相同性)。为了测试克隆的美洲蟋蟀A12-去饱和酶是使用酰基辅酶AC18:l而非酰基-PCC18:l作为底物，在酵母S288C细胞中表达了pXZP282中的来自美洲蟋蟀的A12-去饱和酶基因。编码FAD2的拟南芥M2-去饱和酶基因编码区也克隆至pYES2，得到构建体pXZP279，并表达于S288C作为对照基因，作为已知是酰基-PC型酶的植物A12-去饱和酶的一个实例。在存在C"标记的C18:l(5xl06dpm)的情况下接种酵母转化体培养物，并在2、5和30分钟，以及1、6和24小时后收集细胞。为得到最佳结果，使用玻璃珠继而反复通过组织研磨器而裂解细胞。如Domergue等(2005)所述提取结合于辅酶A的脂肪酸，转化为FAME并通过银染-薄层色谱(TLC)进行分离。诱导期间加至培养基中的油酸立即出现于酰基辅酶A、PC和TAG级份中。观察到拟南芥FAD2从30分钟开始在酰基辅酶A级份中积聚标记的C18:2产物。与此不同的是，最早在加入底物后2分钟即观察到蟋蟀去饱和酶将标记的C18:l转化为C18:2，说明该酶使用酰基辅酶A作为底物。因此，AdD12Des，以及推测TribdesatlO,均是酰基辅酶A油酰A12-去饱和酶类型，而不是酰基-PC油酰A12-去饱和酶。此前未曾鉴定到编码前一类型的A12-去饱和酶的基因。预期在此所述的昆虫酰基辅酶AA12-去饱和酶的克隆过程会刺激进一步发现其他的新的昆虫多不饱和脂肪酸去饱和酶基因，并将对昆虫脂肪酸代谢产生更多的认识。可通过基因敲除突变体来研究该基因在昆虫发育和生理学中的作用。这些A12-去饱和酶基因的表征还会更多地揭示昆虫去饱和酶从祖先基因的进化过程。最后，这会增加我们对脂肪酸去饱和酶之间的序列一底物类型关系的了解，因为膜结合型昆虫A12-去饱和酶被认为是利用酰基辅酶A底物(Cripps，等1990)，而膜结合型植物A12-去饱和酶则利用磷脂酰胆碱(PC)作为底物(StymneandAppelqvist，1978)。'"乙33，s'(S86I)'IB13q涵H.S8-9厶911。uip3io泡spuat工(8661)buibXbxbh'996-1%乙￡I0！8Pwui3ipo!apssuifeooz)，^obh■(uopuo]'iibh^ireuKfeq;3'(uo卩!pgpu乙)5poqpueHP!d门3q工'(s犯1!p3)0661).1"psuojsuno'8SS寸W:SI'd3HIPOlUBid(S66I).IBl31朋JD'6"-9￡r々SX3opj!A("61)，pureqBj￡)Y0乙i-SOn'0乙X3oio!8iBin。3i。pM'(Z66I)sabsiqt^:ssww31am11n33nss!丄itrew(^861)'IB^Bjmu〖ftid['eS6t7乙:乙外sj邻"S83d(6661)7psips阿86-68/CqcfeiScnBuioJio](1661)nPRIP现Xbj[卞I9墨809:9S3nb!rap3}0!g(8861).Psmi3￡t￡t_9￡:WH'XS010u1p3丄pireaoxrapsp!d!qj;o]Biunofiresdomg(乙OOZ)"ISPHCDP116uosqoQ卞9￡'nS33ii3psiB3!uraipo!gwspuai丄(厶861)PI3s3iBqou3~asa-06卜￡补'68￡'fnraipo旧(SOO。.FP3ngj3uioa卞S"1:￡，丄，'咖h(2661)pi，o'V八'e!jpirex3!v'ssai(jSHSV'sdcuoavsuu！ss3j3cuj'('p3):pyirejf.〖iq'9§￡卞$￡'d'P!。V。no脂八suo!iB3!iddvpsppv-9niB八q3识(9661)tras>[j3C[p现snj3dn3'Wt^-d7乙:tsuw丄upfJ3doosuraq3f(S86I)Pp3〖quicu3.SS6-￡S6:"tmimuoouraiQ3。su13q3f0861)，p"qu10j3917'8"'syCqdoj8ui3ipo!axpiy(0661)Psdd!_o，u!:rad.，(￡661)dd可:)'2fl'J3,3p!jg'ssai(j化o叫丄'uo!i!papj￡'sp〖d!jos!sy(iBUBBJttp叫spueuo卩b3卯u3p！'uo!iRrecfos'uo阿os!:s!sXiBuyp!d!i(￡002)叩s!jq;^"9_￡S9:SI'd3^IPO(966I)FP3u3q;38817-6Z>:22IPO(086I)FP"cfec)'8811I掘11:68VSnPSP呵卿ckwj(乙66t)I它13'uooq^'k3掘Xg。I。—J阿d(0002)IBp'UOOl|b30I2-I0Z:￡I'f,d(麵).IB13unojg6￡￡￡Z:ZJT(Z66I)'I它PupimnBg'A外-6S廿:SZ乙u3￡>'ow(1661)，pupiumE8￡"-6U:61S3HP!d!l'3ojd(1861)I胸pus!urepBg《2sppv3!3ionN(Z_66I)，Pimpsiv'左80I:17yC3oiouip3io诏(9861)^13qBunpqvKleimanandSpencer(1982)JAmOilChemSoc59，29-38,Knippleetal.(2002)Genetics162:1737-1752.Kozieletal.(1996)PlantMol.Biol.32:393-405.Leeetal.(1998)Science280:915-8.Lewisetal.(2000)JMicrobiolMethods43:107-116.Luetal.(1993)J.Exp.Med.178:2089-2096.MortimerandJohnston(1986)Genetics113:35-43.Motoetal.(2004)ProcNatlAcadSciUSA101:8631-8636.MurashigeandSkoog(1962).PhysiologiaPlantarum15，473-477.MurataandWada(1995)Biochem.J.308:1-8.NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453.Qiuetal.(2001)PlantPhysiol125:847-855.Rodriguezetal.(2004)InsectBiochemMolBiol34:1315-1328.Sayanovaetal(2007)PlantPhysiology144:455-467.Serraetal.(2006)InsectBiochemMolBiol36:822-825.ShanklinandCahoon(1998)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641.Simopoulos(2000)PoultryScience79:961-970.Smith(1971)Prog.Chem.FatsotherLipids11:137-177.Smithetal.2003.Planta217,507-516.Stalbergetal.(1993)PlantMolecularBiology23,671-683.Stukeyetal.1990.JBiolChem265,20144-20149.StymneandAppelqvist(1978).EurJBiochem90,223-229.Thompsonetal.(1997)NucleicAcidsRes.25:4876-4882.Toriyamaetal.(1986)Theor.Appl.Genet.205:34.Trautwein(2001)Eur.J.LipidSci.Technol.103:45-55.vandeLooetal.(1995)ProcNatlAcadSciUSA.92:6743-7.Vernetetal.(1987)Gene，52:225-233.Wagneretal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6099-6103.Wangetal.(1997)TheJournalofGenetics&Breeding51:325-334.Whittleetal.(2005)JBiolChem.280:28169-76.Yuetal.(1988)Lipids23:804-810.Zhouetal.(2006)PlantScience170，665-673.8权利要求1.真核细胞，其包含编码多肽的外源核酸，所述多肽是(i)包含SEQIDNO16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO16至30、73至78、80和/或134中的一或多个序列具有至少50％相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有选自去饱和酶、结合酶、环氧化酶和羟化酶活性中的一或多种活性。2.权利要求l的真核细胞，其中所述多肽包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中的一或多个序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。3.权利要求1或2的真核细胞，其中所述多肽可分离自鞘翅目或直翅目昆虫。4.权利要求3的真核细胞，其中所述昆虫是拟谷盗属、花萤属或蟋蟀的物种。5.权利要求1至4中任一项的真核细胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:28、73禾tl/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA12去饱和酶活性。6.权利要求1至4中任一项的真核细胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA5去饱和酶活性。7.权利要求1至4中任一项的真核细胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有酰基辅酶AA9去饱和酶活性。8.真核细胞，其包含编码酰基辅酶AA12去饱和酶的外源核酸。9.权利要求8的真核细胞，其中所述酰基辅酶AA12去饱和酶包含(i)SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:28、73禾B/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，和域(iii)i)或ii)的生物学活性片段。10.权利要求8或9的真核细胞，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞而言，其含有水平升高的16:2^12和/或18:2^12脂肪酸。11.权利要求8至IO中任一项的真核细胞，其含有水平升高的与辅酶A酯化的16:2化"2和/或18:2卑12脂肪酸。12.真核细胞，其包含编码酰基辅酶AA5去饱和酶的外源核酸，其中所述去饱和酶对18:0和/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A14中的任意一个、两个、三个或全部。13.权利要求12的真核细胞，其中所述酰基辅酶AA5去饱和酶包含(i)SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:18或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。14.权利要求12或13的真核细胞，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞而言，其含有水平升高的16:n卩/或18:lAs脂肪酸。15.权利要求12至14中任一项的真核细胞，其含有水平升高的与辅酶A酯化的16:1"和域18:Ias脂肪酸。16.真核细胞，其包含编码酰基辅酶AA9去饱和酶的外源核酸，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。17.权利要求16的真核细胞，其中所述酰基辅酶AA9去饱和酶包含(i)SEQIDNO:23或SEQIDNO:74的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:23或SEQIDNO:74具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。18.权利要求16或17的真核细胞，相对于缺乏所述外源核酸的相应真核细胞，其含有水平升高的14:1A9。19.权利要求16至18中任一项的真核细胞，其含有水平升高的与辅酶A酯化的14:1A9。20.权利要求1至19中任一项的真核细胞，其是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。21.权利要求20的真核细胞，其在植物或植物种子内。22.权利要求21的真核细胞，其中所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。23.用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28的关联比其与SEQIDNO:135的关联更密切，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸分子之前的该细胞或无细胞表达系统是否被改变，以及(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。24.用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:28、73、和减134中的一或多个序列具有至少50%的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸分子之前的该细胞或无细胞表达系统是否被改变，以及(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。25.权利要求23或24的方法，其中步骤(iv)包括选择编码酰基辅酶AA12去饱和酶的核酸分子。26.权利要求23至25中任一项的方法，其中所述改变的脂肪酸组成含有水平升高的16:2""12和/或18:2A9，A12。27.用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18和/或19中的一或多个序列具有至少50%的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(Hi)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸之前的所述细胞或无细胞表达系统是否被改变，和(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。28.权利要求27的方法，其中步骤(iv)包括选择编码酰基辅酶AA5去饱和酶的核酸分子，其中所述去饱和酶对18:0和/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A"a"中的任意一个、两个、三个或全部。29.权利要求27或28的方法，其中所述改变的脂肪酸组成含有水平升高的16:lAs和/或18:1A5脂肪酸。30.用于鉴定参与改变脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多个序列具有至少50°/。的相同性，(ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中具有活性的细胞或无细胞表达系统，(iii)确定脂肪酸组成相对于导入所述核酸之前的所述细胞或无细胞表达系统是否被改变，和(iv)任选地，选择改变所述脂肪酸组成的核酸分子。31.权利要求30的方法，其中步骤(iv)包括选择编码酰基辅酶AA9去饱和酶的核酸分子，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。32.权利要求30或31的方法，其中所述改变的脂肪酸组成含有水平升高的14:1A9。33.权利要求23至32中任一项的方法，其中所述多肽是昆虫多肽或其突变体。34.基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA12去饱和酶。35.权利要求34的多肽，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:28、73和/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。36.基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA5去饱和酶，其中所述去饱和酶对18:0和/或16:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A"中的任意一个、两个、三个或全部。37.权利要求36的多S太，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:18和/或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和减(iii)i)或ii)的生物学活性片段。38.基本上纯化的多肽或重组多肽，其是酰基辅酶AA9去饱和酶，其中所述去饱和酶对14:0底物的活性高于其对与辅酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和域18:0。39.权利要求38的多肽，其中所述多肽是(i)包含具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:74的氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:17和/或SEQIDNO:74中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。40.基本上纯化的多肽或重组多肽，其是(i)包含SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多个序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中所述多肽具有选自去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性的一或多种活性。41.权利要求40的多肽，其中所述多肽包含与SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多个序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。42.权利要求34至41中任一项的多肽，其中所述多肽可分离自鞘翅目或直翅目昆虫。43.权利要求40至42中任一项的多肽，其中所述多肽对脂肪酸的A2至△15位之任一位置处的碳-碳键具有去饱和酶活性。44.权利要求43的多肽，其中所述脂肪酸是C16或C18脂肪酸。45.权利要求34至44中任一项的多肽，其是还包含至少一种其他多肽序列的融合蛋白。46.分离的和/或外源多核苷酸，其包含(i)选自SEQIDNO:l至15、67至72、79和133中的任一核苷酸序列，(ii)编码权利要求34至45中任一项的多肽的核苷酸序列，(iii)与SEQIDNO:l至15、67至72、79和/或133中的一或多个序列具有至少50。/。相同性的核苷酸序列，和/或(iv)在严格性条件下与(i)至(iii)之任一序列杂交的序列。47.包含权利要求46的多核苷酸的载体。48.权利要求47的载体，其中所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。49.一种细胞，其包含权利要求34至45中任一项的重组多肽、权利要求46的外源多核苷酸和/或权利要求47或48的载体。50.权利要求49的细胞，其是植物、真菌、酵母、细菌或动物细胞。51.产生权利要求34至45中任一项的多肽的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达权利要求46的多核苷酸。52.权利要求51的方法，还包括分离所述多肽。53.转基因非人类生物体，其包含权利要求1至22、49或50中任一项的细胞。54.权利要求53的生物体，其是转基因植物。55.包含权利要求1至21、49或50中任一项的细胞的种子。56.—种油，其产自或得自权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求53或54的转基因非人类生物体、或权利要求55的种子。57.权利要求56的油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1A5，其中所述油中的18:1^的总量与18:0的总量之比在100:1禾Q1:2之间，且其中所述油的脂肪酸包含低于10c/。(w/w)的20:lAs。58.权利要求56或57的油，且其中所述油的C18脂肪酸有至少43%是18:1A5。59.权利要求56至58中任一项的油，其中所述油的脂肪酸包含占所述油的总脂肪酸的百分比为至少3.0。/。(w/w)的18:1A5。60.权利要求56至59中任一项的油，其中所述油包含占所述油中的总脂肪酸的百分比为低于10。/。(w/w)的18:3A9，A12，A15(ALA)。61.权利要求56至60中任一项的油，其中所述油是通过从油料种子中提取油而得到的。62.—种油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1A5，其中所述油中的18:1"的总量与18:0的总量之比在100:1和1:2之间，且其中所述油的脂肪酸包含低于10。/。(w/w)的20:1A5。63.—种油，其包含脂肪酸，其中所述油的C18脂肪酸有至少43%是18:1A5。64.—种油，其包含脂肪酸，所述脂肪酸包含占所述油的总脂肪酸的百分比为至少3.0。/。(w/w)的18:1A5。65.权利要求64的油，其包含占所述油中的总脂肪酸的百分比为低于100/0(w/w)的18:3A9'A12，A15(ALA)。66.—种脂肪酸，其产自或得自权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求53或54的转基因非人类生物体、或权利要求55的种子。67.产生含不饱和脂肪酸的油的方法，所述方法包括从权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求53或54的转基因非人类生物体、或权利要求55的种子中提取油。68.—种组合物，其包含权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求34至45中任一项的多肽、权利要求46的多核苷酸、权利要求47或48的载体、权利要求56至65中任一项的油或权利要求66的脂肪酸。69.包含权利要求56至65中任一项的油或权利要求66的脂肪酸的饲料、化妆品或化学制品。70.进行去饱和酶反应的方法，所述方法包括将与辅酶A酯化的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸底物与权利要求34至45中任一项的多肽相接触。71.基本上纯化的抗体或其片段，其特异性结合权利要求34至45中任一项的多肽。72.治疗或预防能从PUFA中获益的疾病的方法，所述方法包括给对象施用权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求34至45中任一项的多肽、权利要求46的多核苷酸、权利要求47或48的载体、权利要求56至65中任一项的油、权利要求66的脂肪酸和/或权利要求69的饲料。73.权利要求72的方法，其中所述疾病是心律失常、血管成形术、炎症、哮喘、银屑病、骨质疏松、肾结石、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合征、注意力缺陷多动症、囊性纤维化、苯丙酮尿症、单相抑郁症、攻击性敌意、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿尔茨海默氏病、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板聚集、消化道出血、子宫内膜异位、经期前综合征、肌痛脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼病。74.权利要求1至21、49或50中任一项的细胞、权利要求34至45中任一项的多肽、权利要求46的多核苷酸、权利要求47或48的载体、权利要求56至65中任一项的油或权利要求66的脂肪酸和/或权利要求69的饲料在制备用于治疗或预防能从PUFA中获益的疾病的药物中的用途。全文摘要本发明涉及具有去饱和酶、结合酶、环氧化酶和/或羟化酶活性的酶，所述的酶可用于合成脂肪酸的方法中。文档编号A01H5/10GK101578363SQ200780040245公开日2009年11月11日申请日期2007年8月29日优先权日2006年8月29日发明者A·格林,C·C·伍德,I·霍恩,K·格洛弗,K·达姆切夫斯基,S·P·辛格,V·S·哈利托斯,周雪荣申请人:联邦科学技术研究组织;粮食研究发展公司