蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用的制作方法

专利名称：蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及细菌及其应用，具体是指蛭弧菌在消除海产品及其养 殖水体中致病性弧菌的应用，特别适用于消除海产品食用或加工前、运输过程及其养殖水 体中的常见食物中毒弧菌。
背景技术：
致病性弧菌是引起人类海产品食物中毒最为常见的病原菌，常存在于海产品贝、鱼的 体表和体内中，在食物中毒中占有相当大的比率，主要引起急性胃肠炎，特别是副溶血弧 菌(Vibrioparahaemolyticus)等，其致病性强，发病急，传播快，感染源多，在人群中流 行的持续时间长。
已有研究表明，约有9种常见弧菌可引发人类食物中毒。副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、河弧菌(V.fluvialis)等能引起胃肠炎，而创伤弧菌(V. vulnificus)、 溶藻弧菌(V. alginolyticus)、拟态弧菌(V.mimicus)、辛辛那提弧菌(V. cincinnatiensis)
等引起伤口感染和败血症肠道外感染。近些年，由这些致病性弧菌所引起的肠道疾病、传 染病和食物中毒发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均超过沙门氏菌食物中毒，跃 居细菌性食物中毒事件的首位，成为影响食品安全的重要因素，引起广泛的关注。为此， 世界各国对海产品的进出口及食品卫生检疫中的弧菌含量都有相当严格的规定。如何快
速、准确的检测出食品中弧菌，如何清除弧菌进而预防由其引起的食源流行性疾病成为近 年来研究的热点。如今己有一套较成熟的弧菌检测方法，但检测发现有弧菌该如何消除之， 则仍没有一套有效的消除方法，仅美国一名学者曾研究过应用蛭弧菌于消除食品中病源 菌，阐明蛭弧菌在食品卫生安全方面的应用价值。随着生物技术的发展，釆用适当的生物 净化因子以清除海产品中食源性致病弧菌，将是未来有效预防由其所引发的肠道疾病、传 染病及食物中毒的趋势。
而海产品是其食源性感染最为重要的传播媒介，人多因食用污染细菌而又未经良好加 工的海产品而引起食物中毒。海产品所携带的致病性弧菌，除了引发人类食物中毒外，也
可引发海产品本身在养殖期间的病害问题。为了控制鱼类弧菌病害，养殖r家不得不使用 抗生素，如此又导致渔药的残留。药物的残留以及弧菌的超标，给我国水产品的出口带来 了障碍。
如果能在海产品被食用或加工前、甚至在养殖期间先进行致病性弧菌的消除工作，则 一方面可以减少或消除食物中毒的机率，减少或消除药物残留的可能，提高产品质量安全 系数，保护消费者的健康，另一方面也可为海产品的加工提供优质原材料和加工上的便利， 为出口创汇提供强有力的保障。如此既能避免每年所发生的众多的海产品食物中毒事件， 又可为顺畅的国际贸易护航。
处理海产品的工作，在国内，目前主要集中在检测方法和技术的研发上，在国外，除 了在检测方法和技术的研究外，也刚开始应用各种物理或化学手段以减少或消除海产品所 携带的病菌。
对于致病性弧菌的清除，目前国内外均仍然采用物理或化学药物的方法，但物理或化 学药物的方法均存在较明显的缺点，而且还只能应用于食品的加工过程，难以扩展到海产 品的养殖过程，而研究生物的方法清除食用海产品及其养殖水体中致病性弧菌，就能为"从 养殖到餐桌"的全过程提供一种安全有效的新技术。

发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，通过开发适合于海产品致病性弧菌 的生物消除技术，提供一种蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用。 为了达到上述目的，本发明的主要技术方案如下
蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，应用方法包括以下具体歩骤 及其条件
歩骤一蛭弧菌的分离纯化
对采集的海水或底泥进行预处理，接种增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒双层平板，在含 宿主菌的双层平板上出现噬菌斑，挑取不断扩大的单斑，再按微生物学方法液体增殖培养、 双层平板检验，再次挑取不断扩大的单斑，并重复若干次，至单噬菌斑传代形成形状、大 小、透明度均一致的噬菌斑为一株蛭弧菌纯菌株，按同一时间内单斑大小计，可分离出2 株蛭弧菌纯菌株，所述蛭弧菌于2008年1月13日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典
型培养物保藏中心保藏，Scfe〃oW6ho w.BDJOl保藏编号为CCTCC NO: M 208011和 5&〃oW^/0取BDJ02保藏编号为CCTCC NO: M 208012。
步骤二蛭弧菌浓缩液的制备
将2株蛭弧菌分别进行发酵培养，分别制成浓度为10" (^pfu/ml的蛭弧菌浓縮 液，待用；
步骤三蛭弧菌在消除海产品食用前及其养殖水体中致病性弧菌的应用
在污染了致病性弧菌的食用海产品和/或其养殖水体中加入步骤二制备的蛭弧菌浓 縮液，使蛭弧菌的浓度至少达到102pfu/ml。
所述应用方法采用2株蛭弧菌混合使用或分别独立使用，2株蛭弧菌混合使用效果更佳。
所述应用方法特别适用于消除食用或加工前海产品携带的致病性弧菌，应用时蛭弧菌
最佳浓度范围为104 1012pfu/ml。
所述应用方法还适用于消除海产品运输过程中的致病性弧菌，应用时蛭弧菌最佳浓度 范围为1()3 10"pfu/ml。
所述应用方法还适用于消除海产品养殖水体中的致病性弧菌，应用时蛭弧菌最佳浓度 范围为102-106pfu/ml。
所述致病性弧菌是指副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫 氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和河弧菌。
本发明与现有技术相比具有如下优点
1、 本发明蛭弧菌在消除海产品携带的致病性弧菌的应用效果显著
本发明蛭弧菌在消除海产品食用或加工前、运输过程及其养殖水体中致病性弧菌的应 用效果显著，以牡蛎、南美白对虾和鲈鱼为例，如图1至图9所示，致病性弧菌均有较高
的消除率。特别是2株蛭弧菌混合使用时，消除率均达99%以上。
2、 在食用前用蛭弧菌消除海产品中致病性弧菌安全性好
蛭弧菌消除海产品中致病性弧菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌 的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完 宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作用。不仅可提高消费者生食 海产品的安全系数，保护消费者的健康，也为海产品的绿色加工生产提供保障。
3、 将本发明应用于海产品运输过程中，方便、安全且效果好
海产品在运输过程中采用蛭弧菌来消除致病菌可防止水质恶化、提高存活率，特别有 利于减少或消除化学药物如抗生素的残留，确保海产品的优质。
4、 适合推广应用于海产品的养殖过程
在养殖期间即进行致病性弧菌的消除工作，特别有利于减少或消除化学药物如抗生素 的残留，确保海产品的优质，从根本上避免海产品食物中毒事件的发生，为出口创汇提供 强有力的保障。蛭弧菌对海产品养殖水体中致病性弧菌的消除试验的效果如图8、图9所 示，养殖水体中致病性弧菌也可控制在10cfu/ml以内。
5、本发明为消除海产品所携带的食源性致病性弧菌提供一种新的方法，并适合推广 应用于海产品食用、加工前的预处理、运输过程及其养殖全过程，特别有利于减少或消除 化学药物如抗生素的残留，确保海产品的优质，从根本上避免海产品食物中毒事件的发生， 为出口创汇提供强有力的保障。


图1为施用1株蛭弧菌(BDJ01)处理食用前牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，副溶血弧 菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌浓度对数值-时间图2为2株蛭弧菌合用处理食用前牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，副溶血弧菌、溶藻弧 菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌浓度对数值-时间图3为2株蛭弧菌合用处理食用前牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，辛辛那提弧菌、哈维 氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌浓度对数值-时间图4为施用1株蛭弧菌(BDJ02)处理运输过程中牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，辛辛 那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌浓度对数值-时间图5为2株蛭弧菌合用处理运输过程中牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，副溶血弧菌、溶 藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌浓度对数值-时间图6为2株蛭弧菌合用处理运输过程中牡蛎、南美白对虾和鲈鱼时，辛辛那提弧菌、 哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌浓度对数值-时间图7为1株蛭弧菌(BDJ01)用于牡蛎、南美白对虾和鲈鱼养殖水体时，溶藻弧菌、 副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌、拟态弧菌浓度对数值-时间图8为2株蛭弧菌合用于牡蛎、南美白对虾和鲈鱼养殖水体时，副溶血弧菌、溶藻弧 菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌浓度对数值-时间图9为2株蛭弧菌合用于牡蛎、南美白对虾和鲈鱼养殖水体时，辛辛那提弧菌、哈维 氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌浓度对数值-时间图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式并不仅限于此，所述副 溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈 维氏弧菌、创伤弧菌和河弧菌等致病性弧菌同时出现均有效，但为实验结果及图表数据表 达清晰，九种常见致病性弧菌采用任意几种组合的表达。
实施例1
蛭弧菌在消除食用前海产品携带的致病性弧菌的应用，海产品以牡蛎、南美白对虾和
舻鱼为例，应用方法包括以下具体步骤及其条件 步骤一蛭弧菌的分离纯化
对采集的海水或底泥进行预处理，接种增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒双层平板，在含 宿主菌的双层平板上出现噬菌斑，挑取不断扩大的单斑，再按微生物学方法液体增殖培养、 双层平板检验，再次挑取不断扩大的单斑，并重复若干次，至单噬菌斑传代形成形状、大 小、透明度均一致的噬菌斑为一株蛭弧菌纯菌株，按同一时间内单斑大小计，分离出蛭弧 菌纯菌株。
可分离出2株蛭弧菌纯菌株，并命名其为BDJ01菌株和BDJ02菌株；进行特异性16S rRNA基因的PCR扩增反应和基因测序，获得其部分序列分别为8Ubp禾D 774bp，其 GenBank登陆号(accession number)分别为EF011103和EF094471:
菌株BDJ01
LOCUS BDHSH06 16S 811 bpGenBank accession number: EF011103
ORIGIN 5，
1 CAAGTCGAACCGAGAAANGCCNTTNCGGGG TGGAGTACAG TGGCGCACGG GTGAATAACG
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CGGGGCTCAA CCCCGAAACT
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LOCUS BDH12 16S 774 bp GenBank accession number: EF094471
ORIGIN 5'
1 gtggcgcacg nntnantaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcggga 61 aaccggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 121 ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgtatc attagcttgt tggtggggta acggcctacc 181 aaggctacga tgattaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg 241 tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc 301 agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 361 ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggctaac 421 tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 481 aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaatc tcggggctca accccgaaac 541 tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 601 taaaatccgt agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 661 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 721 gtaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgccccccn tccagtgacc gaaa 所述蛭弧菌于2008年1月13日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏 中心保藏，5&〃ov/Z)n'o 5p.BDJ01保藏编号为CCTCC NO: M 208011禾卩^fe〃ow力n'o 取BDJ02保藏编号为CCTCC NO: M 208012。
步骤二蛭弧菌浓縮液的制备
从双层平板上挑取单斑蛭弧菌，与副溶血弧菌浓縮液混合后加入到含有DNB培养基 的三角锥瓶中，恒温摇床250rpm， 28。C培养24h。培养物经过5000rpm、 4。C离心20min， 取上清液，再16000rpm、 4。C条件下离心20min，弃上清液，加入适量DNB液体培养基 重新悬浮蛭弧菌沉淀物，分别制成浓度为1()H l(^pfu/ml的蛭弧菌浓縮液。
步骤三蛭弧菌对食用海产品携带的致病性弧菌的消除实验
(1) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟 态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯氏弧菌(Vibrio furnissii)，麦奇尼科夫氏弧菌(Vibrio metschnikovii)， 辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)、哈维氏(Vibrio harveyi)，仓ll 伤弧菌(Vibrio vulnificus)和河弧菌(Vibrio fluvialis)的制备
用碱性蛋白胨水培养基摇床培养，160rpm、 28'C培养12 16h分别增殖上述弧菌， 培养液经5000rpm、 4'C离心20min，弃上清液，沉淀菌体用盐度为15%。的无菌海水重新 悬浮，使其浓度为109cfu / ml。
(2) 蛭弧菌对食用前海产品携带的致病性弧菌的消除试验
试验容器为25L的水族箱，分为试验和对照两大系列。试验用水为海水，每个水族 箱注入16L海水。试验所用牡蛎平均体长为3.9X1.9cm，重10.21g;南美白对虾平均体 长为12.1cm，重12.5g;鲈鱼平均体长为24cm，重400g。每个水族箱放牡蛎、南美白对 虫下和舻鱼各10只。试验期间水温为27'C。 3个水族箱作为对照系列，仅加致病性弧菌， 不加蛭弧菌。试验系列中，3个水族箱为一组，加入一定量的蛭弧菌浓缩液，使其达到一 个预定的蛭弧菌终浓度。如此共有5个不同梯度的蛭弧菌终浓度，即104pfu/ml、 106pfu /ml、 108pfu/ml、 1010pfu/ml和1012pfu/ml。
试验时，在相应的水族箱中加入上述步骤三(1)制备好的副溶血弧菌、溶藻弧菌、 拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌，使其浓度分别达到1.0X104cfu/ml，然 后将牡蛎、南美白对虾和鲈鱼放入其中适应后，再在试验系列水族箱中加入不同量的蛭弧 菌浓縮液，使它们达到不同的蛭弧菌终浓度。弧菌的特异性检测均采用实时荧光定量PCR 检测。施用l株蛭弧菌(BDJ01)对食用海产品中副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗 尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌的消除试验效果如图1所示。图1中一翻一为试验系列中 弗尼斯氏弧菌浓度对数值曲线，_ —为试验系列中麦奇尼科夫氏弧菌的浓度对数值曲 线，一A —为试验系列中拟态弧菌的浓度对数值曲线， 一鲁一为试验系列中副溶血弧菌浓 度对数值曲线，一X—为试验系列中溶藻弧菌的浓度对数值曲线。图1中均为试验系列中
最低蛭弧菌终浓度组(104pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组 的消除效果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样(水族箱) 的平均值。
从图1中可知，致病性弧菌的初始浓度均为1.0X104cfu/ml。开始添加蛭弧菌后， 试验系列中最低蛭弧菌终浓度组(104pfu/ml)的各弧菌浓度均呈下降趋势。实验结果表 明，应用l株蛭弧菌(BDJ01)对以上弧菌迸行消除时，副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧 菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌的消除率分别为98.00%、 99.21%、 96.84%、 92.06%、 94.99%。由图可知单用1株蛭弧菌(BDJ01)可在一定程度上消除食用海产品携带的致病 性弧菌。
实施例2
2株蛭弧菌合用消除食用前牡蛎、南美白对虾和鲈鱼携带的副溶血弧菌、溶藻弧菌、 拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌和麦奇尼科夫氏弧菌，其他步骤同实施例l。图2中一B—为试 验系列中弗尼斯氏弧菌浓度对数值曲线， 一命一为试验系列中麦奇尼科夫氏弧菌的浓度对 数值曲线，一A —为试验系列中拟态弧菌的浓度对数值曲线， 一拳一为试验系列中副溶血
弧菌浓度对数值曲线，一X—为试验系列中溶藻弧菌的浓度对数值曲线。图2中均为试验 系列中最低蛭弧菌终浓度组(104pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭 弧菌组的消除效果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样(水 族箱)的平均值。
从图2中可知，致病性弧菌的初始浓度均为1.0X104cfu/ml。开始添加蛭弧菌后， 试验系列中各弧菌浓度均呈下降趋势。实验结果表明，应用2株蛭弧菌对以上致病性弧菌 进行消除，副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌的消除 率分别为99.98%、 99.99%、 99.96%、 99.89%、 99.94%。本实施例与实施例1比较可知， 2株蛭弧菌混用致病性弧菌的消除效果明显优于单用1株蛭弧菌(BDJ01)。
实施例3
2株蛭弧菌合用消除食用前牡蛎、南美白对虾和鲈鱼携带的辛辛那提弧菌、哈维氏弧 菌、创伤弧菌、河弧菌，其他步骤同实施例l。图3中一國一为试验系列中哈维氏弧菌浓 度对数值曲线， 一令一为试验系列中河弧菌的浓度对数值曲线，一A —为试验系列中辛辛 那提弧菌的浓度对数值曲线， 一參一为试验系列中创伤弧菌浓度对数值曲线。图3中均为 试验系列中最低蛭弧菌终浓度组(104pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓 度蛭弧菌组的消除效果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样 (水族箱)的平均值。
从图3中可知，致病性弧菌的初始浓度均为1.0X104cfu/ml。开始添加蛭弧菌后， 试验系列中各弧菌浓度均呈下降趋势。实验结果表明，应用2株蛭弧菌对以上弧菌进行消 除，辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌的消除率分别为99.98%、 99.94%、 99.99%、 99.96%。
实施例4
采用与实施例1相同的方法，施用1株蛭弧菌(BDJ02)消除海产品牡蛎、南美白对 虫下和舻鱼运输过程中辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌。试验系列中，3个 水族箱为一组，加入一定量的蛭弧菌浓縮液，使其达到一个预定的蛭弧菌终浓度，如此共 有5个不同梯度的蛭弧菌终浓度，即103pfu/ml、 106pfu/ml、 108pfu / ml、 1010pfu/ ml和10"pfu/ml。消除试验效果如图4所示，图4中一B —为试验系列中哈维氏弧菌浓 度对数值曲线， 一令一为试验系列中河弧菌的浓度对数值曲线，一A —为试验系列中辛辛 那提弧菌的浓度对数值曲线， 一參一为试验系列中创伤弧菌浓度对数值曲线。图4中均为 试验系列中最低蛭弧菌终浓度组(103pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓 度蛭弧菌组的消除效果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样 (水族箱)的平均值。
实验结果表明，弧菌的初始浓度均为lX104cfu/ml。试验系列中弧菌浓度均保持下 降趋势。辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌的消除率分别为96.02%、 87.41%、 97.49°/。、 94.99%。由图4可知施用1株蛭弧菌(BDJ02)对消除海产品运输过程中的致病 性弧菌有效，但消除率略低。
实施例5
采用与实施例1相同的方法，施用2株蛭弧菌消除海产品牡蛎、南美白对虾和鲈鱼运 输过程中副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌和麦奇尼科夫氏弧菌，其它实 施条件与实施例4相同，加入不同浓度的蛭弧菌浓縮液，使其达到一个预定的蛭弧菌终浓 度。消除试验效果如图5所示，图5中一圆一为试验系列中弗尼斯氏弧菌浓度对数值曲线， 一令一为试验系列中麦奇尼科夫氏弧菌的浓度对数值曲线，一A —为试验系列中拟态弧菌 的浓度对数值曲线， 一參一为试验系列中副溶血弧菌浓度对数值曲线，一X—为试验系列 中溶藻弧菌的浓度对数值曲线。图5中均为试验系列中最低蛭弧菌终浓度组(10、fu/ml) 中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组的消除效果更好，为简便起见，故不 再在图中表示。所有数据均为三个平行样(水族箱)的平均值。实验结果表明，致病性弧菌的初始浓度均为lX104cfu/ml。试验系列中弧菌浓度一 致保持下降趋势。比较各弧菌的初始浓度与第7h的终浓度可知均有较高的消除率，副溶 血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌和麦奇尼科夫氏弧菌的消除率分别为99.97%、 99.99%、 99.94%、 99.80%、 99.90%。由图5可知施用2株蛭弧菌基本上可以有效清除海 产品运输过程中的致病性弧菌。
实施例6
采用与实施例1相同的方法，施用2株蛭弧菌消除海产品牡蛎、南美白对虾和鲈鱼运 输过程中辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌。其它实施条件同实施例4，加 入不同浓度的蛭弧菌浓縮液，使其达到一个预定的蛭弧菌终浓度。消除试验效果如图6 所示，图6中一B —为试验系列中哈维氏弧菌浓度对数值曲线， 一命一为试验系列中河弧 菌的浓度对数值曲线，一A —为试验系列中辛辛那提弧菌的浓度对数值曲线， 一參一为试 验系列中创伤弧菌浓度对数值曲线。图6中均为试验系列中最低蛭弧菌终浓度组(103pfu /ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组的消除效果更好，为简便起见， 故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样(水族箱)的平均值。
实验结果表明，弧菌的初始浓度均为lX104cfu/ml。试验系列中弧菌浓度均保持下 降趋势。辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌的消除率分别为99.98%、 99.92%、 99.99%、 99.95%。图6所示施用2株蛭弧菌基本上可以有效清除海产品运输过程中的致 病性弧菌。比较实施例4的实验结果，可知施用2株蛭弧菌对海产品运输过程中的致病弧 菌的清除效果明显优于单用l株蛭弧菌(BDJ02)。 实施例7
蛭弧菌在消除海产品养殖水体中致病性弧菌的应用，海产品以牡蛎、南美白对虾和鲈 鱼为例。
将养殖水池(125L)分为试验和对照两大系列。试验用水为海水，每个水池注入100L。 其它实施条件同实施例l。试验系列中，3个水池为一组，加入一定量的蛭弧菌浓縮液， 使其达到一个预定的蛭弧菌终浓度，如此共有3个不同梯度的蛭弧菌终浓度，即102pfu /ml、 104pfu/ml禾卩106pfu/ml。
施用1株蛭弧菌(BDJ01)消除牡蛎、南美白对虫下和舻鱼养殖水体中溶藻弧菌、副溶 血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌、拟态弧菌，釆用与实施例1相同的方法。消除 试验效果如图7所示，图7中一B —为试验系列中哈维氏弧菌浓度对数值曲线，_令_为 试验系列中拟态弧菌的浓度对数值曲线，一A—为试验系列中河弧菌的浓度对数值曲线，
一參一为试验系列中副溶血弧菌浓度对数值曲线，一X—为试验系列中创伤弧菌的浓度对 数值曲线，一O—为试验系列中溶藻弧菌的浓度对数值曲线。图7中均为试验系列中最低 蛭弧菌终浓度组(102pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组的消 除效果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样的平均值。
从图7中可知，弧菌的初始浓度均为102cfu/ml水平。试验系列中各弧菌浓度亦呈 现下降趋势，应用1株蛭弧菌(BDJ01)对以上弧菌进行消除时，溶藻弧菌、副溶血弧菌、 哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌、拟态弧菌的消除率依次为90.00%、 80.05%、 60.19%、 84.15%、 74.88%、 68.38%。
实施例8
采用与实施例l相同的方法，采用2株蛭弧菌应用于海产品养殖，即处理牡蛎、南美 白对虾和鲈鱼养殖水体中副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌和麦奇尼科夫 氏弧菌。采用与实施例7相同的方法和实施条件，加入不同浓度的蛭弧菌浓縮液，使其达 到预定的蛭弧菌终浓度。消除试验效果如图8所示。图8中一B —为试验系列中弗尼斯氏 弧菌浓度对数值曲线，_令一为试验系列中麦奇尼科夫氏弧菌的浓度对数值曲线， 为试验系列中拟态弧菌的浓度对数值曲线，一參一为试验系列中副溶血弧菌浓度对数值曲 线，一X—为试验系列中溶藻弧菌的浓度对数值曲线。图8中均为试验系列中最低蛭弧菌 终浓度组(102pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组的消除效果 更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样的平均值。
从图8中可知，弧菌的初始浓度均为1(^cfii/ml水平。试验系列中各弧菌浓度亦呈 现下降趋势，应用2株蛭弧菌对以上弧菌进行消除时，副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、 弗尼斯氏弧菌和麦奇尼科夫氏弧菌的浓度在第7h均小于10cfu / ml。
实施例9
采用与实施例1相同的方法，采用2株蛭弧菌应用于海产品养殖，即处理牡蛎、南美 白对虫下和鲈鱼养殖水体中辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、河弧菌。采用与实施例 7相同的方法和实施条件，加入不同浓度的蛭弧菌浓縮液，使其达到预定的蛭弧菌终浓度。 消除试验效果如图9所示。图9中一B —为试验系列中哈维氏弧菌浓度对数值曲线，一 一为试验系列中河弧菌的浓度对数值曲线，一A —为试验系列中辛辛那提弧菌的浓度对数 值曲线， 一參一为试验系列中创伤弧菌浓度对数值曲线。图9中均为试验系列中最低蛭弧 菌终浓度组(102pfu/ml)中的弧菌浓度对数值曲线。由于其它高浓度蛭弧菌组的消除效 果更好，为简便起见，故不再在图中表示。所有数据均为三个平行样的平均值。
从图9中可知，弧菌的初始浓度均为10^fo/ml水平。试验系列中各弧菌浓度亦呈 现下降趋势，应用2株蛭弧菌对以上弧菌进行消除时，辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤 弧菌、河弧菌的浓度在第7h均小于10cfU / ml。
序列表如下-
<110>华南理工大学
<120>蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用
<140> 200810027132.8
<141> 2008-03-31
<160>2
<210> 1
<211>811
<212> DNA
<213>蛭弧菌种(Bdellovibriosp.) <220>
<221> 16S rDNA <222>(1)...(811) <223> n =a或g或c或t <400> 1
caagtogaac cgagaaangc cn加c鹏g tggagtacag tggcgcacgg gtgaataacg 60 cgtaggtgac gtgcctttta gtgggggaca acatcggg幼accggtgcta ataccgcata 120 agttaagcga cattgaaaaa gcttaagaaa gtgggcttcg gctcacgctg aaagatcggc 180 ctgcgtatca加gcttgtt ggtggggtaa cggcctacca aggctacgat gattaactgg 240 tctgagagga tgatc^tca cactggaact gagacacggt ccagactcct ac鹏aggca 300 gc^^gga atattgcgca atgggggaaa ccctgacgca gcaatgccac gtgagtg鄉360 aaggcccttg ggttgtaaag ctctgtecta tgggaagaac tgcattacgg ttaatacccg 420 tagtgtttga cggtaccata gaagaaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta 480 atacgga鹏tgcaagcgtt gttcggattt act鹏cgta aagcgcgcgc aggcggattg 540 gca^toaga t跑aaatct cggggctcaa ccccgaaact gcgtc每aaa ctatc喊ct 600 agagtctcat agggggcagg ggaatttcac gtgtaggggt aaaatccgta gagatgtgaa 660 ggaacacccg tggcgaaggc gcctgcctgg atgagcactg acgctg鄉c gcgaaagcgt 720
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<210>2
<211>774
<212>DNA
<213>蛭弧菌种(Bdellovibriosp.) <220>
<221> 16S rDNA <222> (1)...(774) <223> n =a或g或c或t <400>2
gtggcgcacg nntnantaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcggga 60 aaccggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 120 ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgtatc attagcttgt tggtggggta acggcctacc 180 鄉gctacga tgattaactg gtctgagagg atgatoagtc acactggaac tgagacacgg 240 tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatg鹏gaa accctgacgc 300 agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 360 ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggctaac 420 tccgtgccag cagccgcggt aatacgg鄉gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 480 aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaate tcggggctca accccgaaac 540 tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 600 taaaatccgt agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 660 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720 gtaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgccccccn tccagtgacc gaaa 77权利要求
1、蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，应用方法包括以下具体步骤及其条件步骤一蛭弧菌的分离纯化对采集的海水或底泥进行预处理，接种增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒双层平板，在含宿主菌的双层平板上出现噬菌斑，挑取不断扩大的单斑，再按微生物学方法液体增殖培养、双层平板检验，再次挑取不断扩大的单斑，并重复若干次，至单噬菌斑传代形成形状、大小、透明度均一致的噬菌斑为一株蛭弧菌纯菌株，按同一时间内单斑大小计，可分离出2株蛭弧菌纯菌株；步骤二蛭弧菌浓缩液的制备将2株蛭弧菌分别进行发酵培养，分别制成浓度为1011～1013pfu/ml的蛭弧菌浓缩液，待用；步骤三蛭弧菌在消除海产品食用前及其养殖水体中致病性弧菌的应用在污染了致病性弧菌的食用海产品和/或其养殖水体中加入步骤二制备的蛭弧菌浓缩液，使蛭弧菌的浓度至少达到102pfu/ml。
2、 根据权利要求1所述的蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，其特征在于所述应用方法采用2株蛭弧菌混合使用或分别独立使用。
3、 根据权利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应 用，其特征在于所述应用方法用于消除食用或加工前海产品携带的致病性弧菌，应用时 蛭弧菌浓度范围为104 1012pfu/ml。
4、 根据权利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应 用，其特征在于所述应用方法还用于消除海产品运输过程中的致病性弧菌，应用时蛭弧 菌浓度范围为1()3 10"pfu/ml。
5、 根据权利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，其特征在于所述应用方法还用于消除海产品养殖水体中的致病性弧菌，应用时蛭弧菌浓度范围为102 106pfu/ml。
6、 根据权利要求1所述的蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，其特征在于所述致病性弧菌是指副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、弗尼斯氏弧菌、麦奇尼科夫氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和河弧菌。
全文摘要
本发明公开了蛭弧菌在消除海产品及其养殖水体中致病性弧菌的应用，在污染了致病性弧菌的海产品和/或养殖水体中加入蛭弧菌浓缩液，使蛭弧菌的浓度至少达到10²pfu/ml。海产品食用前、运输过程以及养殖水体中应用本法时，蛭弧菌浓度范围分别为10⁴～10¹²pfu/ml、10³～10¹¹pfu/ml、10²～10⁶pfu/ml。采用生物方法，安全清除食用前和/或运输过程中海产品所携带的致病性弧菌99％以上；而其养殖水体中致病性弧菌也可控制在10cfu/ml以内。本发明适合于海产品食用或加工前的预处理、运输过程及其养殖过程，特别有利于减少或消除化学药物如抗生素的残留，从根本上避免海产品食物中毒事件的发生。
文档编号A01N63/00GK101356927SQ20081002713
公开日2009年2月4日 申请日期2008年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者娟 李, 李春霞, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学