专利名称：：荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物
技术领域：
的方法，尤其是一种荒漠苔藓Tortuladesertorum及其生物结皮快速增殖方法。背景资料土壤生物结皮在干旱_半干旱地区分布广泛，特别是在维管植物难以生存地区，对当地土地资源维持和生态环境保护具有重要意义。生物结皮有以下几方面主要功能固氮作用，为荒漠植物和土壤微生态系统提供氮素；把金属螯合态转变为植物可吸收形态；提高土壤积聚能力，降低风蚀和沙土流失；构建一个粗糙表面，从而可以捕获水分或者养分含量丰富颗粒。这些功能决定了其在沙漠修复和植被管理当中重要作用。但沙漠生物结皮极易遭受破坏，一旦遭到破坏，会加速沙漠化进程。根据结皮大小，一块完整结皮自然恢复时间从几年到十几年不等，周期漫长。苔藓是几种生物中最高形式，苔藓结皮代表结皮进化最高水平，进一步改良，有可能在上面产生更高级植物；如果苔藓结皮退化，则会转变为其他形式结皮如藻结皮，甚至转变为沙漠，因此苔藓结皮是沙漠向土壤过渡标志，可以作为沙漠环境条件改善与否指示物。如果能人工快速培养出大量的荒漠苔藓材料，经过驯化后与其他的工程手段相结合，势必能够在荒漠地区荒漠化治理和生态重建方面起到重要作用。用于城市绿地和高尔夫球场等功能区的生物材料多为草坪。在北方干旱-半干旱地区维持草坪往往需要人工浇灌，造成地下水资源的严重浪费。这主要是因为高等植物如高大乔木、草类，99%的水分通过蒸散消耗而损失掉，仅1%的水分用于光合作用。而相对低等的苔藓植物，特别是荒漠苔藓植物，在其长期进化过程中已经形成抗御水分丧失的外在结构和适应极端干燥的代谢机制，其在生长过程中需要非常少量的水分就可以维持自身的生长和繁殖，并且全部的水分来自空气当中，因此非常适合用于干旱-半干旱地区城市绿化。如果能提高其生长速度并用于城市绿地建设，就能降低草坪耗水量，从而减轻城市供水压力。经对现有技术的文献检索发现，中国专利(申请)号为200310125467.0的专利提供一种被培育的苔藓耐干燥性优良、且在苔藓培育其间易形成群落的苔藓培育片，和使用该苔藓培育片的结构绿化方法。该专利所用的生物材料为日本砂藓(RacomitriumjaponicumDozyetMolk.)、硬叶砂藓(RacomitriumbarbuloidesCard.)和灰藓(HypunumplumaeformeWils.)三种非荒漠地区生长的耐干苔藓，其采用整个配子体种植在纸张、纤维碎末上，施加肥料后形成一般的苔藓结皮，没有涉及荒漠苔藓培养，而该专利获得的苔藓结皮仅能够用于相对湿润地区墙体绿化或者其他场所绿化，不能用于干旱地区或者荒漠地区生态修复。进一步检索中，尚未发现通过组织培养、简单无机培养基进行荒漠苔藓及其生物结皮的快速繁殖的报道。有鉴于此，加上我国当前沙漠化及城市沙尘暴情势加剧，三北防护林部分区域实效和严重耗费地下水资源，荒漠苔藓繁殖技术突破及苔藓结皮构建方法在生态保护方面显得格外重要。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于干旱地区绿化、荒漠化治理的苔藓及其生物结皮快速增殖方法，解决荒漠苔藓自然繁殖速度缓慢技术难题，为干旱-半干旱地区城市绿化和荒漠化治理提供可行的生物材料。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤步骤l:荒漠环境采集的干燥荒漠苔藓TortuladesertorumBroth.配子体的活性恢复；步骤2:荒漠苔藓快速繁殖上述活性恢复材料的叶片与基体分离，将分离后的叶片植入载有固体培养基的培养皿中进行培养，得到该荒漠苔藓培养材料；步骤3:荒漠苔藓结皮构建分离步骤2得到的苔藓配子体叶片，将分离后的叶片在载有固体培养基的培养皿中培养，然后将培养出的原丝体移栽至载有河沙的培养皿中，改变培养温度，再培养形成完整的苔藓结皮；步骤2和3中培养基选择Knop培养基或者培养液，其组成为1.0g/LCa(N03)24H20、0.25g/LKH2P04、0.12g/LKCl、0.25g/LMgS047H20以及微量FeCl36H20。步骤4:苔藓生物结皮微组装与抗性驯化步骤3中培育出的苔藓结皮压入培养盘中，放置在室内环境中，喷水保持湿润，使其蔓延生长成片状；上述步骤1是将干燥的苔藓样品以完全复水方式复活48小时。上述步骤1中复水温度控制在0°C-4°C，光照强度〈20WnolnT2s—1PPFD，光照周期8小时。上述步骤2中培养条件具体为温度分别为白天20。C、黑夜1(TC，湿度控制在65%-80%，光照强度为85-120Mmolm—2s_1PPFD。上述步骤2中，培养光周期设定为16小时，培养周期为2个月。上述步骤3中在载有固体培养基的培养皿中培养，其培养条件具体为温度分别为白天20。C、黑夜1(TC，湿度控制在65%-80%，光照强度为85-120陶olra—2s—ipPFD，培养时间为一个月。上述步骤3中改变培养温度，是指将培养温度从白天2(TC和黑夜l(TC改变为白天25。C和黑夜15'C，再培养一个月。上述步骤3中培养基质是砂粒、砂土混合物，其中砂和土的质量比>2。上述步骤2或3中所涉及的苔藓材料无消毒处理、培养基中不含糖或者激素。上述步骤4中驯化光照强度按照lOOPmolm—2s—'PPFD，150Wnolm—2s—'PPFD，250Mmolm—2s—1PPFD，400Mmolm—2s—'PPFD依次递增。本发明的有益效果荒漠苔藓及其生物结皮具有抗干旱、耗水量小、固氮、抗风沙以及降低水土流失等生态作用，快速增殖技术可以推进苔藓植物在干旱-半干旱地区城市绿地和沙漠化修复中的应用，具有显著的生态意义。从结皮产生周期上，一块完整的荒漠苔藓结皮，依靠自然生长条件需要10年左右的时间才能够形成；实验室内培养，仅需要2-3个月时间就能够形成一片初始荒漠苔藓结皮，改变了荒漠苔藓结皮依赖恶劣自然环境自我繁殖现状，为荒漠苔藓在荒漠地区土壤沙漠化人工修复应用提供基础。荒漠苔藓结皮不同于草坪，仅需要空气相对含水量在30%以上就可以生长，无须人工灌溉，以北京地区为例，草坪更换为苔藓结皮单位面积将节约水量约120毫米。图1是荒漠苔藓配子体复水方式示意图其中图A为10(F。空气复水，图B为滤纸复水，图C为完全复水。具体实施方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实例l:荒漠苔藓配子体活力恢复对荒漠苔藓从干燥的环境中复活方法参见图1。其中图A为100%空气复水，图B为滤纸复水，图C为完全复水。用带盖子敞口烧瓶装入1/4-1/3体积去离子水a，将干燥苔藓配子体c放入尼龙网b后悬挂在液体上方，该复水方法为100%空气复水；将干燥苔藓c放置在湿滤纸d复水，该方式为接触式滤纸复水；将干燥苔藓完全浸没于去离子水a中为完全复水方式。按照公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm测定叶绿素荧光，其中Fm/Fv为最大叶绿素荧光，F0为暗适应光量子产量，Fm为最大光量子产量。荧光的测定结果，完全复水30分钟后刺叶墙藓叶片最大叶绿素荧光为0.651，接近稳定后最大值0.695，表明配子体光合作用能力短时间内已经完全恢复，证明完全复水方式最适合荒漠苔藓活性恢复；其它两种复活方式极易造苔藓干配子体死亡，复活率低。实例2:荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖繁殖体确定荒漠苔藓快速增殖的实验材料主要采用了配子体的各部分如顶芽、配子体基部以及按照生长时间划分的黄叶、黄绿叶、绿叶和幼叶，各组织的再生潜力参见表l。除碎片无法计算外，其它组织的原丝体都有发生，顶芽产生最大面积的原丝体。就单个配子体产生的新芽数目而言，利用顶芽和配子体基部培养单株最高产芽16个，利用碎片单株产芽量仅0.4，但是利用离体叶片单株产芽达200个，远高于其他两种方式，因此离体叶片是荒漠苔藓快速增殖的最佳选择。表1外植体对荒漠苔藓再生能力影响(平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实例3:荒漠苔藓及其结皮快速增殖环境因素确定培养温度是荒漠苔藓快速增殖的一个重要影响因素，按照荒漠苔藓原生长地温度变化情况，设定了两种昼夜温度20°C(白天)和15。C(黑夜)、25°C(白天)和15'C(黑夜)，评价温度梯度对荒漠苔藓再生潜力的影响参见表2。较低温度2(TC/1(TC培养原丝体面积达到1.28cm2，与25TVl5r下原丝体面积极显著差异；较高温度25'C/15'C产生了4.26个芽，显著高于前者，从而高温下生物量也远高于低温条件，证明适度高温利于促进新芽的产生，低温利于原丝体的培育。表2不同培养温度对荒漠苔藓刺叶墙藓绿叶再生能力影响(平均值)再生潜力昼夜温度20°C/10°C昼夜温度25。C/15。C原丝体发生面积(cm2)1.28±0.120.53±0.15新芽个数1.33±0.254.26±1.14生物量(mg)1.55±0.323.07±0.49培养湿度、光照周期和光照强度是决定荒漠苔藓人工快速增殖以及是否能够推广至干旱地区绿化的重要因素，通过正交试验设计，最终确定最适合荒漠苔藓快速人工增殖的相对湿度为60-85%，光照强度在60Mmolm_2s—'和光周期为16h。方差分析结果表明，相对湿度和光照周期对荒漠苔藓人工培育具有显著影响，特别是相对湿度低于30%或者高于90%对原丝体发育产生显著负影响，但是在北方干旱-半干旱地区，全面绝大多数天数室外空气湿度可以维持在30-70%之间，非常适合荒漠苔藓的生长。另外，光照强度不同水平间对荒漠苔藓生长没有显著差异，表明荒漠苔藓具有非常广泛的光适应性，用于构建城市绿地存在可能性。实例4:荒漠苔藓快速增殖方法选择完全复水的离体绿叶作为繁殖体，植于含有Knop固体培养基表层(Kn叩培养基组成为1.0g/LCa(N03)2■、0.25g/LKH2P04、0.12g/LKC1、0.25g/LMgS047H20以及微量FeCl36H20，1.2%的琼脂)的玻璃培养皿中，轻压使叶片基部埋于培养基内，用封口胶密封。培养温度设定在昼夜温度分别为25°C(白天)和15。C(夜晚)，光周期为16h，培养一个月后可得到大量原丝体，培养2个月后得到大量的配子体幼体。实例5:荒漠苔藓生物结皮构建构建荒漠苔藓结皮是荒漠苔藓用于干旱地区绿地和荒漠化地区生态修复的重要一个环节。荒漠苔藓的人工快速增殖特征的研究发现，荒漠苔藓在20°C(白天)和1(TC(夜晚)中、琼脂固体培养基上可以产生更大面积的原丝体，在25'C(白天)和15°C(黑夜)中、沙砾或沙土培养基中可以产生更多的新芽，鉴于此将荒漠苔藓结皮培育分为两个阶段原丝体诱导、新芽发展与原始结皮形成两个阶段。离体绿叶植于Kn叩-琼脂固体培养基中，在2(TC(白天)和l(TC(夜晚)中培养l个月；然后移植于去营养的沙砾中，轻压后喷雾状Knop营养液，在25°C(白天)和15°C(夜晚)中培养1个月，最终形成面积为约15cm2的初始荒漠苔藓结皮。实验表明荒漠苔藓结皮可以在相对短期内人工培育形成，为在生态修复中规模化应用荒漠苔藓生物结皮开辟一条新途径。实例6:荒漠苔藓生物结皮的景观特征与生态功能比较人工培育结皮相对于野生结皮形貌特征比较表明，室内培养荒漠苔藓结皮配子体规整，颜色鲜艳，且地上部分高度超过lOrnm，非常适合作为绿地建设生物材料。人工培育与野生荒漠苔藓生物结皮微观显示，人工培育的苔藓生物结皮同野生结皮相似，假根发达，都具有胶结固沙的能力，非常适合用于荒漠化地区土壤改良和生态固沙。本发明的方法充分利用组织培养技术实现荒漠苔藓人及其生物结皮的人工快速培育，是荒漠苔藓人工繁殖的新突破，为荒漠化治理与干旱地区城市绿化提供新材料应用的可能性。权利要求1、一种荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1荒漠环境采集的干燥荒漠苔藓TortuladesertorumBroth.配子体的活性恢复；步骤2荒漠苔藓快速繁殖上述活性恢复材料的叶片与基体分离，将分离后的叶片植入载有固体培养基的培养皿中进行培养，得到该荒漠苔藓培养材料；步骤3荒漠苔藓结皮构建分离步骤2得到的苔藓配子体叶片，将分离后的叶片在载有固体培养基的培养皿中培养，然后将培养出的原丝体移栽至载有河沙的培养皿中，改变培养温度，再培养形成完整的苔藓结皮；步骤2和3中培养基选择Knop培养基或者培养液，其组成为1.0g/LCa(NO3)2·4H2O、0.25g/LKH2PO4、0.12g/LKCl、0.25g/LMgSO4·7H2O以及微量FeCl3·6H2O；步骤4苔藓生物结皮微组装与抗性驯化步骤3中培育出的苔藓结皮压入培养盘中，放置在室内环境中，喷水保持湿润，使其蔓延生长成片状；2.根据权利要求1所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是上述步骤1是将干燥的苔藓样品以完全复水方式复活48小时。3.根据权利要求1或2所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是上述步骤1中复水温度控制在(TO4'C，光照强度〈20Mmolm—2s—'PPFD，光照周期8小时。4.根据权利要求1所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是上述步骤2中培养条件具体为温度分别为白天20'C、黑夜10'C，湿度控制在65%-80%，光照强度为85-120Wnolm—2s^PPFD。5.根据权利要求1或4所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是上述步骤2中，培养光周期设定为16小时，培养周期为2个月。6.根据权利要求1所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是:上述步骤3中在载有固体培养基的培养皿中培养，其培养条件具体为温度分别为白天20。C、黑夜10。C，湿度控制在65%-80%，光照强度为85-120MmolnT2s^PPFD，培养时间为一个月。7、根据权利要求1或6所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是上述步骤3中改变培养温度，是指将培养温度从白天20'C和黑夜l(rC改变为白天25'C和黑夜15°C，再培养一个月。8、根据权利要求1所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是:上述步骤3中培养基质是砂粒、砂土混合物，其中砂和土的质量比〉2。9、根据权利要求1所述的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，其特征是:上述步骤4中驯化光照强度按照lOOMmoln(-2)s(-1)PPFD，150,1m—2s(-1)PPTO，250Mmolm(-2)s—1PPFD,400Mmolm(-2)s(-1)PPFD依次递增。全文摘要一种环保
技术领域：
的荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖方法，步骤如下荒漠环境采集的干燥荒漠苔藓配子体的活性恢复；将活性恢复材料的叶片与基体分离，将分离后的叶片植入载有固体培养基的培养皿中，培养得到该荒漠苔藓培养材料；分离得到的苔藓配子体叶片，将分离后的叶片在载有固体培养基的培养皿中培养，然后将培养出的原丝体移栽至载有河沙的培养皿中，改变培养温度，再培养形成完整的苔藓结皮；将培育出的苔藓结皮压入培养盘中，放置在室内环境中，喷水保持湿润，使其蔓延生长成片状。本发明实现了荒漠苔藓人及其生物结皮的人工快速培育，为荒漠化治理与干旱地区城市绿化提供新材料应用的可能性。文档编号A01H4/00GK101268739SQ20081003555公开日2008年9月24日申请日期2008年4月3日优先权日2008年4月3日发明者东岳,艳王,王正武,许书军申请人:上海交通大学