专利名称：提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体说，是涉及提高大豆蛋白质含量和 质量的表达载体及其制法和用途。
背景技术：
大豆是我国重要农作物之一，含有丰富的蛋白质和人体及动物不能合成的8 种必需氨基酸，是人类食物和动物养殖的主要植物蛋白来源。近年来，联合国 粮农组织极力主张发展大豆食品，以解决目前发展中国家蛋白质资源不足的现 状。因此，提高大豆蛋白含量及质量是最重要的内容之一。目前随着人们健康及保健意识的提高，优质的高蛋白大豆粉在市场的需求 量正逐年上升。对于有些不能食用动物蛋白的特殊疾病患者，由优质大豆制成 的高蛋白制品对这样的人群更为重要。大豆高蛋白育种对于动物以及大豆早期 自身的生长等多方面都会带来一定的益处。以优质高蛋白大豆作为家畜的饲料， 减少和避免使用动物饲料，将更有助于家畜的生长。种子中的贮藏蛋白在种子 萌动发芽中是一种氮源，具有非常重要的作用。如果以高蛋白大豆作为种子， 内源氮素丰富，大豆早期的生长将会更好。我国是一个人口众多的发展中国家， 为满足我国不断增长人口对农作物的需求，采用增加种植面积来达到增产的目 的已经不符合当前我国的基本国策，而通过在现有单产基础上提高农作物蛋白 质的生产率获得更有营养的农作物，是一种更为科学和经济的增产方式。因此， 种植高蛋白大豆还可提高单位土地面积蛋白质生产量，提高土地的生产率。在大豆蛋白质中卯％是盐溶性球蛋白(Fukushima D, Chemistry, technology ， and nutrition. Food Reviews Imational, 1991, 7:323 -351),按照在 一 定pH和盐离 子浓度环境中沉降系数不同，盐溶性球蛋白又可分为2S、 7S、 11S和15S四种 组分。其中7S和llS球蛋白是两种主要的成分，分别被称为豌豆球蛋白(Vicilin) 和豆球蛋白(Legumin)(盖钧镒.大豆品质育种.农作物品质育种(刘后利主编)， 湖北科学技术出版社.2001， pp: 269~331)。大豆的豆球蛋白主要为大豆球蛋白 (Glycinin)，约占成熟种子总蛋白含量的40 % (Utsumi S ， Adv Food Nutr Res,1992, 36:89 ~ 208; UtsumiS， etal, Food Proteins and Their Applications, Marcel Dekker， New York, 1997， 257 ~ 291)，是目前大豆盐溶性球蛋白研究的重点。尽管大豆是一种营养价值较高的作物，已具有完全蛋白的美称，但是根据 人们对大豆蛋白氨基酸组成分析发现，大豆缺乏含硫氨基酸(甲硫氨酸和胱氨 酸)(胡明祥等，大豆品质育种.作物品质育种(翟风林等编著)，农业出版社， 1988, pp: 407-453)，这已成为大豆蛋白质营养价值的重要限制因素。因此设 法提高含硫氨基酸的含量，是当今改良大豆营养品质研究的重要课题。大豆的IIS球蛋白含有较丰富的甲硫氨酸(1.3%-1.8%)及胱氨酸(1.4%~ 1.7%)，而在7S豌豆球蛋白中两种含硫氨基酸含量较少，分别为0.3%左右(盖 钧镒.大豆品质育种.农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社.2001, pp: 269-331)。因此在大豆贮藏蛋白中增加11S蛋白含量，将能够提高大豆蛋 白质的质量。从人们对大豆蛋白质保健功能研究结果显示，大豆球蛋白还具有 天然的降血脂和降低血浆胆固醇的作用。盖钧镒在《大豆品质育种》 一文中也 提出，从避免动物性食品中的胆固醇问题，由大豆制成的人造肉将是人类未来 的重要蛋白质营养来源(盖钧镒.大豆品质育种.农作物品质育种(刘后利主编)， 湖北科学技术出版社.2001, pp: 269~331)。在我国，大豆的主要用途之一是加 工豆腐制品，供人们食用。由11S蛋白组分凝结制得的豆腐比7S蛋白组分凝结 制得的豆腐结构要坚实(胡明祥等，大豆品质育种.作物品质育种(翟风林等编 著)，农业出版社，1988, pp: 407-453)。而且从改善大豆分离蛋白的性质与 功能出发，也要求增加IIS球蛋白含量(盖钧镒.大豆品质育种.农作物品质育种 (刘后利主编)，湖北科学技术出版社.2001， pp: 269-331)。现已证实，大豆的IIS球蛋白是由多基因家族编码，迄今为止已有七个大 豆球蛋白基因被克隆、测序。1982年，Fischer和Goldberg (Fischer RL， Goldberg RB.Cell， 1982, 29:651 ~ 660)首次报道了三个高度同源的非等位大豆球蛋白基 因，并命名为Gjl、 Gy2和G_y3。 1985年，Scallon等(Scallon B， et al， Theor Appl Genet, 1985, 70:510 ~ 519)首次报道了编码大豆球蛋白的G;4、 Qy5基因。2002 年，Beilinson等(Beilinson V et al, Theor Appl Genet, 2002， 104: 1132 ~ 1140 ) 又报道了 Gy6及Gy7基因，其中Gy6基因为3'端缺陷型，不能编码有功能的大 豆球蛋白。Nielsen等(Nielsen N C et al, The Plant Cell ， 1989， 1: 313 ~ 328 )按照大 豆球蛋白基因cDNA序列的同源性，曾对qW (^y5基因的不同区域的序列进行了比较分析，并将(^yl、 qy2和G少3分为第一类群，G少4和Gy5分为第二类群。 Beilinson等(Beilinson V et al， Theor Appl Genet, 2002， 104:1132 ~ 1140 )按 照大豆球蛋白亚基的同源性，将(^6和G/7基因分为第三类群。Nielsen认为， 第一、第二类群大豆球蛋白基因都在开花后大约25天开始转录，约55天达到 最大，91天降到很低的水平，且第一类群的表达量高于第二类群(NidsenNCet al, ThePlantCell, 1989， 1: 313 -328 )。 Beilinson认为第三类群的Qy7基因在 种子中熟期表达，比第一、第二类群晚，而且表达量最少，不到总蛋白的5% (Beilinson Vetal， Theor Appl Genet, 2002， 104:1132 ~ 1140 )。分析六种大豆 球蛋白基因启动子，造成基因表达量最少的原因是由于启动子保守序列 Legumin box碱基序列的突变，六种有功能大豆球蛋白基因启动子区Legumin box 序列比较如下(阴影表示重要保守序列)cttcatgaggtgtagcacccaaggcttccatagccatgcata￡tgaagaatgtctcaagctcagcaccctactt ，cttaatgaggtgtaacacacaaggcttccatagccatgcata￡tgaagaatgtctcaagctcagcaccccacttcttaat a gtgtaagacagaagggttccatagccatgcata￡tgaagaatgtcttaagctcagcaccccacttatgtatgaggtgtaacaaaattggaaacaatagccatgcagggtgaagaatgtcaccaactcagaaacccttatatgtatgaggtgtaacaaaattggaaacaatagccatgcaaggtgaagaatgtcacaaactcagcaacccttatgttgatgaggtgtaagaaatgagggtttgaaagacatgcaggctgcagaatgtctacatctcagggactaatgt 分析比较Gyl、 Gy2、 @3、 Gy4、 C^5和Gy7六种功能性大豆球蛋白基因 合成的多肽氨基酸组成，不论从八种必需氨基酸、半必需氨基酸和含硫氨基酸 (Met+Cys)的百分含量，还是它们的实际数值，@7基因明显比其他大豆球蛋 白基因更好，Gy7基因表达产物不仅具有最高的赖氨酸含量，同时含硫氨基酸也 是最高的(见表l所示)，是一个目前已发现的最优质的大豆球蛋白基因(李 建粵等，西北植物学报，2005, 25 (8) : 1706- 1712) 。 Qy7基因自2002年 Beilinson首次报道以来，关于利用该基因改良作物方面的研究目前还未见报道。表l六种大豆球蛋白重要氨基酸百分含量(％)和实际值(个)氨基酸种类GlG2G3G4G5G7Lys5.644.334.355.344.086.99重Thr3.833.523.543.183.51■要Met雄1.7;1.230.420,691.38氨Trp1.311.341.01認1.271.83基lie5.494.965.203.873.665.49酸Val4.335.014.845.776.357.53百Leu6.967.126.727.017.117.06分Phe認5.16雄3.254.093.70含Arg7.568.308.358.828.36繊量His2.001.021.543.273.855.10(%)Met+Cys3.00認2.831.441.823.33Phe+Tyr8.518.4310.097.07謹6.95Lys2418192^18重Thr181812要Met23会氨Trp4434基lie2^23242118酸Val232625望实Leu333331巡3536际Phe192^141615值Arg27292931(个His84615Met+Cys141513812Phe+Tyr3130292i27*表中单下划线表示氨基酸在六种大豆球蛋白中排列第一，双下划线表示排列第二； Gl G7分别表示(^l G/7基因相应的多肽产物。改良大豆营养品质育种在国内外很早就引起了人们的兴趣，不同学者曾先 后釆用杂交、辐射育种等方法开展高蛋白大豆育种及遗传研究(胡明祥等，大豆 品质育种.作物品质育种(翟风林等编著)，农业出版社，1988， pp: 407~453;许月等，大豆科学，1998， 17 (3): 262 ~ 267)。国内学者在20世纪90年代起， 多釆用总DNA导入法提高大豆蛋白质含量，进行大豆营养品质改良研究(雷勃 钧等，中国科学(B辑)，1994, 24 (6) : 596~601;雷勃钧等，大豆科学， 14 (3) : 203-207;许守民等，大豆科学，1995， 14 (4) : 316-320;刘广 阳等，中国油料，1996， 18(3): 20-22;雷勃钧等，作物学报，2000， 26(6):725 ~ 730)。尽管利用如上方法在提高大豆总蛋白含量方面已有成功的报道，也有极 少数研究增加了大豆11S球蛋白含量，但是从总体而言，釆用这些技术要快速 有效地提高优质大豆IIS球蛋白含量还是比较困难的。在国外，利用基因工程技术成功改良大豆蛋白质品质方面报道也较少。20 世纪90年代初期，有人设想通过改变现有大豆IIS球蛋白基因序列，将制备的 新基因改良大豆品质。如Kim等人(Kim等，ProteinEng， 1990， 3(8):725~31) 在1990年曾在Gj3基因的基础上通过删除3个氨基酸残基或增加4个含硫氨基 酸残基的核苷酸构建了重组载体，并导入大肠杆菌表达系统进行研究，发现有 一个重组载体表达的蛋白质比较理想，但利用该设计改良大豆一直未见报道。 在1988年，Hoffinan等人(Hoffinan等，PlantMolBiol， 1988, 11: 717-729) 也曾将来自玉米15KDZein基因中富含6个甲硫氨酸残基密码子的45bpDNA片 段插入菜豆贮藏蛋白基因中并导入烟草，结果显示新基因在烟草中能够表达出 相应的蛋白质，但无法在细胞中完成正确的运输过程聚集在蛋白体内。利用体 外合成新基因改良作物种子营养品质，除了要考虑新基因表达的多肽能否在细 胞中正确运输外，还需要对改变核苷酸序列后的多肽产物之间能否相互作用形 成正确的高级结构进行分析。在20世纪90年代中期，改良大豆品质最有影响 的报道是将含硫氨基酸较髙的巴西果2S白蛋白导入大豆。但是由于巴西果是众 所周知的过敏性植物，Nordlee等(NordleeJAetal, NEngl J Med， 1996,334(11): 688-692)对转基因大豆中的2S白蛋白进行放射变异原吸附测定、免疫印迹鉴定 及皮试分析，结果表明转基因大豆会导致人的过敏反应。目前在国内外都还未 见釆用基因工程技术直接导入优质大豆11S球蛋白基因改良大豆营养品质方面 的报道。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种提高大豆蛋白质含量和质量的表达 载体及其制法和用途，以克服现有技术不能针对性地增加某一种优质的IIS球蛋白表达量及采用异源蛋白基因可能导致人体食用产生过敏反应的缺陷。本发明的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，包括大豆球蛋白基因启动 子、大豆球蛋白基因片段、信号肽编码序列、终止子及内切酶敏感序列，其特征在于所述大豆球蛋白基因启动子为第一类群大豆US球蛋白基因启动子， 所述大豆球蛋白基因片段为大豆IIS球蛋白Gy7基因片段。所述第一类群大豆11S球蛋白基因启动子可选自Gyl、 Gy2或qy3基因启 动子，优选C^1基因启动子。所述大豆llS球蛋白Gy7基因片段可为qy7全基因序列或(^7基因的cDNA编码序列片段。所述信号肽编码序列可在大豆11S球蛋白基因启动子的下游，也可在大豆 IIS球蛋白基因片段的上游。所述终止子优选CaMV 35S基因终止子。本领域的普通技术人员无需通过特珠的试验即可知道，所述的大豆球蛋白 G/7全基因或者G少7基因的cDNA编码序列可以指与GenBank序列号AF319776 基因或是和AF319777同源的基因。本发明所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法，包括如下 步骤1) 釆用PCR方法扩增第一类群大豆11S球蛋白基因启动子，然后将扩增产 物与T载体连接得中间载体T-1;2) 釆用PCR方法扩增下游带有信号肽编码序列的第一类群大豆11S球蛋白 基因启动子，然后将扩增产物与T载体连接得中间载体T-2;3) 采用PCR方法扩增大豆llS球蛋白Gy7全基因中信号肽后的序列或采用 反转录及PCR方法扩增大豆11S球蛋白Gy7基因的cDNA编码序列中信号肽后 片段，然后将扩增产物与T载体连接获得中间载体T-3;4) 采用PCR方法扩增上游带有信号肽编码序列的大豆IIS球蛋白Gy7全基 因序列或采用反转录及PCR方法扩增上游带有信号肽编码序列的大豆IIS球蛋 白Gy7基因的cDNA编码序列，然后将扩增产物与T载体连接获得中间载体T-4;5) 将中间载体T-1和中间载体T-4或中间载体T-2和中间载体T-3进行酶切、 并与基因终止子、植物通用载体其他序列连接，即得本发明的表达载体。本发明的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体可应用于转化大豆，以获得本发明的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体还可应用于转化大豆，以获 得无抗性选择标记基因、无报告基因的高含量优质大豆IIS球蛋白新品种。与现有技术相比，本发明的有益效果如下1) 本发明解决了现有技术不能快速有效地提高优质大豆IIS球蛋白含量的 困难，所述表达载体可利用转基因技术直接将优质的目的大豆球蛋白基因导入 大豆，避免了育种上的盲目性；2) 本发明采用作物自身的优质基因改良同一种作物，避免了采用异源蛋白 基因有可能导致人体食用产生过敏反应的缺陷，为今后利用源自于作物本身的 优质基因进行大豆等作物优质育种的可能性提供重要参考；3) 本发明的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体所转化获得的大豆新品 种，其后代种子中优质大豆11S球蛋白Gy7基因合成的多肽含量至少比未转化 的对照大豆增加l倍。本文所用的术语"C^7基因"是指编码大豆种子贮藏蛋白中沉降值为IIS的球 蛋白(Glycinin )家族之中的一类球蛋白的基因，比如GenBank序列号为AF319776 的全基因或者GenBank序列号为AF319777的mRNA序列。本文所用的术语"PCR方法"是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。 本文所用的术语"CaMV 35S基因终止子"是指来自于花椰菜花叶病毒的35S 终止子。本文所用的术语"中间载体"是指在目标载体制备过程中获得的载体。 本文所用的术语"T-DNA"是指根癌农杆菌Ti质粒中可转移并整合到寄主植 物细胞染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。
图1是pCAMBIA1300质粒的T-DNA结构图，图中LB、 RB为T-DNA的 左右边界；35S-pro、 35S-ter为CaMV35S基因启动子和终止子；々pf为潮霉素抗 性基因；Xh为J^oI的缩写；Bs为5^XI的缩写；E为五coi I的缩写；Sa为Sacl 的缩写；K为/C; M的缩写；S为Smal的缩写；B为5amffl的缩写；X为^feal 的缩写；Sal为S"/I的缩写；P为尸wl的缩写；H为/^"dlI的缩写；图2是实施例1构建的表达载体的T-DNA结构图，图中LB、RB为T-DNA 的左右边界；G/7指大豆球蛋白G/7基因去除信号肽后全长序列；Qy7cDNA指 大豆球蛋白qy7基因去除信号肽后编码序列；q^-pro-Sl指大豆球蛋白^yl基因启动子和信号肽；Terminator指基因终止子；图3是实施例2构建的表达载体的T-DNA结构图，图中LB、 RB为T-DNA 的左右边界；Qy7-S7指大豆球蛋白G/7基因包含信号肽全长序列；Gy7cDNA-S7 指大豆球蛋白G/7基因包含信号肽所有编码序列；Gyl-pro指大豆球蛋白@1 基因启动子；Terminator指基因终止子；图4是pCAMBIA1301质粒的T-DNA结构图，图中LB、 RB为T-DNA的 左右边界；35S-pro、 35S-ter为CaMV35S基因启动子和终止子；/2/^为潮霉素抗 性基因；gws为P-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter为Nos基因终止子；Xh为A7wl 的缩写；Bs为&fXI的缩写；E为的缩写；Sa为S"cI的缩写；K为 的缩写；S为5Vwfll的缩写；B为J5awffl的縮写；X为^al的缩写；Sal为Sa/I 的缩写；P为户M的縮写；H为历'"c/in的缩写；图5是实施例3构建的表达载体的T-DNA结构图，图中LB、RB为T-DNA 的左右边界；G/7指大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后全长序列；G/7cDNA指 大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后编码序列；G^W-pro-Sl指大豆球蛋白Qvl基 因启动子和信号肽；Terminator指基因终止子；35S-pro、 35S-ter为CaMV 35S 基因启动子和终止子；/2^为潮霉素抗性基因；gt/5为|3-葡萄糖醛酸糖苷酶基因； Nos-ter为Nos基因终止子；图6是实施例4构建的表达载体的T-DNA结构图，图中LB、 RB为T-DNA 的左右边界；(&7-S7指大豆球蛋白Gy7基因包含信号肽全长序列；Gy7cDNA-S7 指大豆球蛋白基因包含信号肽所有编码序列；G^-pro指大豆球蛋白Gyl 基因启动子；Terminator指基因终止子；35S-pro、 35S-ter为CaMV 35S基因启 动子和终止子；/^f为潮霉素抗性基因；gws为p-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter 为Nos基因终止子。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。在构建载体搡作中涉及的常规PCR扩增、限制性内切酶酶切和连接等方法 主要参考《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)， 科学出版社，1992)。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例1a) 根据Genbank AF319776公布的大豆球蛋白7基因序列设计特异PCR 引物，上游引物一端引入XbaI位点，在下游引物一端引入XhoI位点；利用常 规PCR从大豆(G(Kdwe wox)总DNA中扩增约2.2kb大豆球蛋白Qy7基因序列信 号肽以后的部分；或提取中熟期大豆(Gfydwe附ox)种子RNA，根据Genbank AF319777公布的大豆球蛋白Gy7基因mRNA序列设计特异引物，在上游和下 游引物也分别引入Xbal位点和Xhol位点，采用反转录及PCR扩增获得约 1.6kb^y7基因cDNA片段信号肽以后的序列；将PCR产物与T载体连接获得中 间载体T-3，并转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检 测中间载体T-3;利用Xbal和Xhol对中间载体T-3进行双酶切后，与 pCAMBIA1300 (简称p1300，来自于中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳 研究员)质粒(见图1所示)Xbal和Xhol双酶切后回收的大片段进行连接形成 pl300-Gy7 (1)载体，转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常 规方法检测p1300 - Gy7 (1)载体；b) 分别参照GenBankE07850和X15121显示的大豆IIS球蛋白基因启 动子及基因编码序列，设计一对能够与G，yl基因启动子及信号肽(-1117 +57) 特异配对的引物；上游引物一端引入PstI位点，在下游引物一端引入XbaI位点； 以大豆(67yc/we wflw:)总DNA为模板，通过PCR扩增获得U74bp大小的DNA 片段，将PCR产物与T载体连接获得中间载体T-2，并转化感受态大肠杆菌； 利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测中间载体T-2;利用XbaI和PstI对 中间载体T-2进行双酶切后，与p1300 - Gy7 (1 )载体Xbal和Pstl双酶切后回 收的片段进行连接形成pl300-Gyl-Sl-Gy7 (1)载体，即目标载体-1 (见图2所 示)。实施例2a)按照实施例1的同样方法，根据Genbank AF319776公布的大豆球蛋白 C^7基因序列设计特异PCR引物，上游引物一端引入XbaI位点，在下游引物一 端引入Xhol位点，利用常规PCR从大豆(Gfy"Vie附ox)总DNA中扩增约2.25kb 大豆球蛋白Gy7基因全序列(从ATG开始，带有Gj;7基因信号肽)；或提取中 熟期大豆(G7k/"c w做)种子RNA,根据Genbank AF319777公布的大豆球蛋白 (5v7基因mRNA序列设计特异引物，在上游和下游引物也分别引入Xbal位点和 Xhol位点，采用反转录及PCR扩增获得约1.65kbG少7基因cDNA序列(同样从ATG开始，带有Qy7基因信号肽);将PCR产物与T载体连接获得中间载体T-4, 并转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测中间载体 T-4;利用Xbal和Xhol对中间载体T-4进行双酶切后，与p1300质粒(见图1 所示)Xbal和Xhol双酶切后回收的大片段进行连接形成p1300 - Gy7 ( 2 )载体， 转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测pl300-Gy7 (2)载体；b)参照GenBarikE07850显示的大豆llS球蛋白Gyl基因启动子序列，设计 一对能够与Gyl基因启动子(-1117到转录+1位点前)特异配对的引物；上游 引物一端引入PstI位点，在下游引物一端引入XbaI位点；以大豆(Gfyc/股w似) 总DNA为模板，通过PCR扩增获得1117bp大小的DNA片段，将PCR产物与 T载体连接获得中间载体T-l,并转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、 PCR等常规方法检测中间载体T-1;利用XbaI和PstI对中间载体T-l进行双酶 切后，与pl300-Gy7 (2)载体Xbal和Pstl双酶切后回收的片段进行连接形成 pl300-Gyl-S7-Gy7 (2 )载体，即目标载体-2 (见图3所示)。实施例3在pCAMBIA1300质粒载体(见图1所示)35S基因终止子下游设计PCR 引物， 一端引入PstI酶切位点；利用该引物和原先与( yl基因启动子上游序列 配对的引物(也带有Pstl酶切位点)对实施例1所构建的目标载体一 pl300-Gyl-Sl-Gy7 (1)载体进行PCR扩增，获得含有基因启动子及信号 肽和Gy7基因序列及35S基因终止子，将PCR产物与T载体连接获得载体2， 并转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测载体2;将 载体2利用Pstl酶切，回收酶切后的大片段，并与pCAMBIA1301 (简称pl301， 来自于中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员)质粒(见图4所示) 经PstI酶切产物连接；采用PCR、酶切及测序鉴定，形成pl301-Gyl-Sl-Gy7(1) 载体，即目标载体-3 (见图5所示)。实施例4a)按照实施例3的同样方法，在pCAMBIA1300质粒载体(见图1所示) 35S基因终止子下游设计PCR引物， 一端引入PstI酶切位点；利用该引物和原 先与Qyl基因启动子上游序列配对的引物(也带有Pstl酶切位点)对实施例2 所构建的目标载体一pl300-Gyl-S7-Gy7 (2)载体进行PCR扩增，获得含有Gyl 基因启动子和Gy7基因序列DNA及35S基因终止子；将PCR产物与T载体连接获得载体3，并转化感受态大肠杆菌；利用分子生物学酶切、PCR等常规方法 检测载体3;将载体3利用Pstl酶切，回收酶切后的大片段，并与p1301质粒(见 图4所示)经Pstl酶切产物连接；采用PCR、酶切及测序鉴定，形成 pl301-Gyl-S7-Gy7 (2)载体，即目标载体-4 (见图6所示)。 实施例5分别利用目标载体-3和目标载体-4单质粒转化大豆或者利用目标载体-1和 目标载体-2与含有抗性基因、报告基因的pCAMBIA1301质粒载体共转化大豆。 在转基因大豆开花后的25-30天，釆用RT-PCR即可以从幼嫩种子中检测到 基因的转录产物，而在非转基因大豆中无C^7基因转录产物，由此说明利用 Qyl基因启动子引导基因可使优质的G/7基因产物提前表达。参照Natarajan (Natarajan et al, Anal Biochem. 2005, 342(2):214 ~ 220 )报道方法定量提取转 基因和对照成熟大豆种子蛋白质，结合釆用等电聚焦电泳和SDS-PAGE检测G7 蛋白，并根据Beilinson等(Beilinson V et al， Theor Appl Genet, 2002， 104: 1132 ~ 1140)报道中描述的G7蛋白前体、酸性肽和碱性肽等电点及相应的分子量，利 用凝胶图像分析仪确定在转基因成熟大豆种子中G7蛋白表达量至少比非转基因 对照大豆种子增加l倍。
权利要求
1.一种提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，包括大豆球蛋白基因启动子、大豆球蛋白基因片段、信号肽编码序列、终止子及内切酶敏感序列，其特征在于所述大豆球蛋白基因启动子为第一类群大豆11S球蛋白基因启动子，所述大豆球蛋白基因片段为大豆11S球蛋白Gy7基因片段。
2. 根据权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述第一类群大豆11S球蛋白基因启动子为Gyl、 Qy2或C^3基因启动子。
3. 根据权利要求2所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述第一类群大豆IIS球蛋白基因启动子为GW基因启动子。
4. 根据权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述大豆11S球蛋白Gy7基因片段为C^7全基因序列或G;/7基因的cDNA 编码序列片段。
5. 根据权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述信号肽编码序列在第一类群大豆IIS球蛋白基因启动子的下游。
6. 根据权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述信号肽编码序列在大豆IIS球蛋白Gy7基因片段的上游。
7. 根据权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体，其特征 在于所述终止子为CaMV35S基因终止子。
8. —种权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体的制备方 法，其特征在于，所述方法包括如下步骤1) 采用PCR方法扩增第一类群大豆IIS球蛋白基因启动子，然后将扩增产 物与T载体连接得中间载体T-1;2) 采用PCR方法扩增下游带有信号肽编码序列的第一类群大豆11S球蛋白 基因启动子，然后将扩增产物与T载体连接得中间载体T-2;3) 采用PCR方法扩增大豆llS球蛋白Gy7全基因中信号肽后的序列或采用 反转录及PCR方法扩增大豆11S球蛋白Gy7基因的cDNA编码序列中信号肽后 片段，然后将扩增产物与T载体连接获得中间载体T-3;4) 釆用PCR方法扩增上游带有信号肽编码序列的大豆llS球蛋白Gy7全基 因序列或采用反转录及PCR方法扩增上游带有信号肽编码序列的大豆IIS球蛋白Gy7基因的cDNA编码序列，然后将扩增产物与T载体连接获得中间载体T-4; 5)将中间载体T-1和中间载体T-4或中间载体T-2和中间载体T-3进行酶切、并与基因终止子、植物通用载体其他序列连接，即得本发明的表达载体。
9. 一种权利要求l所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体的用途， 其特征在于，所述表达载体用于转化大豆，以获得高含量优质大豆US球蛋白 新品种。
10. 根据权利要求9所述的提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体的用途， 其特征在于，所述表达载体用于转化大豆，以获得无抗性选择标记基因、无报 告基因的高含量优质大豆11S球蛋白新品种。
全文摘要
本发明公开了一种提高大豆蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途，所述表达载体包括大豆球蛋白基因启动子、大豆球蛋白基因片段、信号肽编码序列、终止子及内切酶敏感序列，所述大豆球蛋白基因启动子为第一类群大豆11S球蛋白基因启动子，所述大豆球蛋白基因片段为大豆11S球蛋白Gy7基因片段。本发明的表达载体可应用于转化大豆，获得高含量优质大豆11S球蛋白新品种和无抗性选择标记基因、无报告基因的高含量优质大豆11S球蛋白新品种。本发明避免了育种上的盲目性和采用异源蛋白基因有可能导致人体食用产生过敏反应的缺陷，所转化获得的大豆后代种子中优质大豆11S球蛋白Gy7基因合成的多肽含量至少比未转化的对照大豆增加1倍。
文档编号A01H1/00GK101250551SQ20081003571
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者李建粤, 帆 王, 石少华, 刚 肖, 慧 逯, 顾婷玉 申请人:上海师范大学