专利名称：番茄雌核发育培养方法
技术领域：
本发明涉及无性繁殖技术，具体涉及一种由番茄雌核诱导得到愈伤组织，以及进一步发育获得植株的方法。
背景技术：
番茄单倍体培养技术的建立对于番东育种、分子标记、遗传图谱构建、基因定位、基因克隆等均有极其重要的意义。诱导植物的雄核
发育和雌核发育是获得单倍体的2条途径。诱导雄核发育途径包括花药和小孢子培养技术，该技术已应用于大麦、小麦、玉米、水稻、烟草、亚麻、油菜、甘蓝、茄子、西瓜等作物的育种。诱导雌核发育途径包括未授粉的子房和胚珠培养，并在小麦、水稻、烟草、大蒜、甜菜、非洲菊等作物中获得成功。番菜的单倍体培养起始于1971年，Sharp得到了栽培番茶花药的愈伤组织。Gresshoff和Doy(1972)培养番茄花药获得了植株，同年Sharp创造了番茄花粉的滋养培养技术。随后众多研究者进行了番茶花药和小孢子培养研究，但普遍存在着愈伤组织诱导率低，成苗难的问题，获得了少量的花药植株，而小孢子培养仅至球形胚和类心形胚阶段，尚未得到进一步的结果(Debergh和Nitsch ( 1973 ); Devreux等(1976 ); Debergh ( 1978 ); Cappadocia
(1980);高秀云、王纪方等(1979, 1980); Gulshan等(1981;Krueget-Lebus等(1983 ); Shamina和Yadav( 1986 ); Evans和Morrison
(1989);袁亦楠(1999))。因此，本申请发明人考虑进一步探索另一条获得番茄单倍体的途径__诱导雌核发育。关于番茄雌核发育的研究较少，Ugur和Bal Kazim Abak ( 2003 )进行了番茄的子房培养，未获得愈伤组织，在培养过程中子房逐渐枯萎最后死亡。
发明内容
4本发明的目的在于提供一种番茄雌核培养方法，为番东雌核诱导愈伤以及随后育成植株提供可能。
本发明方法是以处于E期或F期的番痴花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3 mm的番茶花蕾。
其中所述愈伤组织培养基为优选为含有适当生长素和细胞分裂素的B5培养基。可用的生长素及细胞分裂素包括2,4-D、6-BA、NAA、IBA、 KT、 TDZ的浓度范围为0.1(imol丄"-500^imol丄"。优选培养基包括
B5+ 2.0(xmol丄'1 2，4國D+1.0 (imol丄—^-BA;
B5+2mg丄"2，4國D+1.0 nmol丄"6-BA + 5.0 pmoLI/1 NAA+1.0pmol丄-1 IBA+1.0 (xmol丄"KT;
B5+2.0 iamol丄'1 2,4-D+1.0 iimoLL—1 6-BA + 2.0 fxmol丄—1 NAA +1.0nmol丄"TDZ。
上述培养基的蔗糖浓度优选为1-3%,琼脂糖浓度为0.6-1%, pH5.8。更优选为2%，琼脂糖浓度为0.8%, pH5.8。
在上述培养基上按照常规植物愈伤组织诱导培养即可，优选的培养条件是完全黑暗培养，温度28。C,湿度70%。
按照上述方法进行对番茄雌核进行培养，结果表明处于E和F期的胚珠在培养8 12 h后就开始分裂生长，能够分化成愈伤组织的胚珠数目可达60%以上。
本发明还进一步将上述愈伤组织在分化培养基上培育成植株。可用的生长素及细胞分裂素包括2，4-D、 6-BA、 NAA、 IBA、 KT、 TDZ的浓度范围为(UnmoLlZ-SOO^imoLlA优选的分化培养基包括(1) B5 + NAA 0.02 mg丄-1 + ZT 1.0 mg丄-1;(2 ) B5 + NAA 0.5 pmol丄-1 + ZT 10.0 |jmoLL-1;
5(3 ) B5 + NAA 4.mg丄-1 + 2，4-D l.mg丄-1 + KT 0.8 mg丄-1 ;(4 ) B5 + IAA 0.01 mg丄-1 + ZT 2.0 mg丄-1 ;(5 ) MS + IAA 0.2 mg丄-1 + 2 mg丄-1 6國BA;(6 ) DBMII + NAA 0.5(imol.L-1+ ZT 10 jimol丄-1。上述培养基的蔗糖浓度优选1-3%，琼脂糖浓度为0.6-1%， pH5.8-6.0。更优选为2%，琼脂糖浓度为0.8%， ph5.8。
在上述培养基上按照常规的分化培养条件培养即可，优选的分化培养的条件是，1611光照(90^111101'11^8-1)， 8h小时黑暗，温度28。C，湿度70%，每20-40d更换l次培养基。
经上述分化培养过程中，多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的"果实"，最后成熟，"果实"表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番茄的"味道"。
在B5 + IAA 0.01 mg丄"+ ZT 2.0 mg丄"培养基中培养的愈伤组织能够分化成芽，再经生根培养即可获得完整植株。
生根培养可按照常规方法进行，优选当芽生长至2-3片叶时，将其转移至生根培养基MS + 0.2 mg丄"IAA + 2%蔗糖+ 0.8%琼脂，ph5.8中培养，l周后根即长成。
本发明番茄雌核培养方法，釆用E期或F期的番茄大孢子的离体胚珠作为外植体，进行培养，可获得大量愈伤组织，为研究雌核发育途径获得番茄单倍体提供有先决条件。进一步，本发明还提供了分化培养方法，结果表明，在本发明提供的分化培养基上进行培养多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的"果实"，最后成熟，"果实"表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番东的"味道"。在特定的培养基上进行培养还能分化成芽。进一步，通过生根培养可获得完整植株。这为雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。
图1所示的是番茄花蕾发育的不同时期； 图2所示的是培养3周后E、 F型的膨大子房； 图3所示的是在离心管中培养1周后的胚珠，右图为左图其中一 管在200倍下的照片；
图4是分别生长在离心管和三角瓶中的愈伤组织； 图5是由胚珠发育而来的"果实"； 图6是愈伤组织分化形成的芽点； 图7是愈伤组织分化形成的芽； 图8是再生植株。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例l愈伤组织诱导培养
l材料与方法
1.1材料试材为中国农业科学院蔬菜花丼研究所育成的两个杂
交番茄品种'中杂ior和'中杂i05，(购自中国农业科学院蔬菜花
卉研究所)，2006-2008年种植于春季温室、春季大棚、露地、秋季大 棚和秋季温室，以保证周年釆集样本，每种材料每次种植40 - 100株， 均按常规方法管理，植株定植1周后选取合适的花蕾进行子房和胚珠 分离。
1.2诱导培养基的筛选共选用了 20种诱导培养基，其成分以 B5和MS (均购自Sigma公司)为基本培养基，附加不同浓度(1-lOOpmol丄-1)的生长素(IA、 NAA、 2,4-D、 IBA)和细胞分裂素(KT、
76BA、 TDZ、 ZT)共组成20种培养基，蔗糖浓度均为2%，琼脂糖浓 度均为0.8%, pH 5.8-6.0。
将50mL诱导培养基分装于2mL的离心管，每离心管400|iL， 120。C下灭菌15-18min。在无菌条件下将'中杂101，和'中杂105， 两个品种从现蕾至花开前期的胚珠混合接种于离心管中的诱导培养 基上，观察胚珠细胞的分裂和分化情况，筛选出最佳的培养基。
1.3培养时期的條选以'中杂105'为材料，按照花蕾和花药 大小、距开花时间等分7个时期(表1)取样，将胚珠分别置于最佳 的诱导培养基上，观察胚珠细胞分裂和分化情况，以确定最佳的取样 时期。
1.4番茄子房和胚珠外植体比较选取最佳时期的花蕾，剥离 出子房，用10%次氯酸钠灭菌16-20 min,再用去离子无菌水冲洗 3~4次。在无菌条件下将下列4种外植体接种于诱导培养基
(1) 完整子房；
(2) 将子房切除外部果皮后使胚株外露；
(3) 将子房切除外部果皮后使胚株外露，再将其切成长与宽均 约1-3 mm的胚珠块，每一小块均有少量的胎座组织，胎座组织上 大约含有数十个胚珠；
(4) 离体胚珠。
每个品种的不同外植体接种10个离心管，每个离心管接种2 3 个子房、半子房或胚珠块，接种100~200个胚珠。在28。C下进行暗 培养，每12h检查1次。 2结果
2.1适宜的诱导培养基
将现蕾至花开前期的混合胚珠接种于20种诱导培养基进行筛选 的结果表明，以下3种诱导培养基能使部分胚珠较快地生长出愈伤组 织，可用于胚珠和子房的诱导培养，并且对'中杂101'和'中杂105，
8的诱导效果一致，这3种培养基是
B5+ 2.0ixmol丄"2,4-D+1.0 ixmol丄"6-BA;
B5+2mg丄"2,4-D+1.0 ixmol丄"6國BA + 5.0 nmol丄"NAA+1.0 jxmol丄-1 IBA+1.0 Mmol丄'1 KT;
B5+2.0 pmol丄'1 2,4-D+1.0 iimoLL—1 6-BA + 2.0 pmoLL—1 NAA + 1.0pmol丄"TDZ。
3种培养基的蔗糖浓度均为2%,琼脂糖浓度为0.8%， pH5.8。 2.2适宜的培养时期
在诱导培养基的筛选中发现，现蕾至花开前期的混合胚珠中只有 一小部分能在诱导培养基中生长，表明并非所有发育时期的胚珠均适 于离体培养，需要进行最佳培养时期的筛选。以'中杂105'为试材， 将处于A-G(表1，图1) 7个时期的胚珠于上述3种诱导培养基上 培养。结果表明，处于A-C时期和G时期的胚株不能进一步脱分化 和进行细胞分裂，在培养过程中逐渐褐化，最终死亡；处于D期的 花蕾，在培养过程中，仅有少量较小的胚珠分裂和生长；处于E和F 期的胚珠在培养8 12 h后就开始分裂生长，能够分化成愈伤组织的 胚珠数目可达60%以上。
因此认为，最适于进行番茄大孢子培养时期为E和F期。对两时 期花蕾的花粉进行观察，可以观察到单核早期至单核晚期的花粉粒， 表明E和F期为单核期。最易于识别这两个时期的取样标准是萼片合 抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3 mm (图l,表1)。利 用该标准对'中杂101'和其它番东材料进行取材和培养，结果与'中 杂105' —致。
表1中杂105番茄花蕾的分类
时期 花蕾长度 /mm
A 12-14 B12 — 13
花药长度 /mm
9- 10 8一9
预期开花时间
当日开放 次曰开放
萼片开裂最深处至 花瓣顶端的距离
全裂 萼片开裂至底部
胚珠大小(横直 径X纵茎)mm
0.8X1.2 0.8X1.1c11 - 137-9第2曰开放萼.片开裂1/2至3/40.7乂1.0
D10- 127-8第3曰开放开裂3mm至1/20.7X0.9
E8- 106-7第4曰开放1-3 mm0.6X0.9
F7-95-6第5曰开放0-2 mm0.6X0.8
G5-73-5第6曰开放未开裂0,5X0.7
H<5<31周后开放未开裂—
2.3不同外植体的培养效果
2.3.1完整的子房培养对中杂101和中杂105两个番东品种E 和F时期的子房培养结果表明在培养3d后，子房开始膨大，至4 周后生长至最大，大小是原来的4-8倍，继代培养3个月后，果实 开始变色，至4个月后完全变红，但果实内部没有种子或类似于种子 的痕迹，也未观察到来自于胚株的愈伤组织或胚状体(图2)。
2.3.2半子房培养将'中杂101'和'中杂105'两个番东品种 E和F时期的子房切除外部果皮后使胚株外露，然后置于培养基上培 养，培养2 3d后，的胚珠均略有膨大，但在随后的培养过程中停止 生长并逐渐褐化，最后死亡，在培养过程中也未观察到来自胎座和其 它组织的愈伤组织的分化现象。
2.3.3胚珠块培养将E和F期子房切除外部果皮后使胚株外露， 再将其切成长与宽均约1-3mm的胚珠块置于培养基上培养，培养 3~5 d后胎座组织开始由绿变褐，胚珠略有膨大，但随后停止生长并 逐渐褐化，最后死亡，在培养过程中也未观察到来自胎座的愈伤组织 的分化现象。
2.3.4胚株的培养
将处于E和F期的离体胚株置于诱导培养基上，7-12h后胚珠 开始膨大，颜色逐渐变白，呈不透明状态。l周后体积增加l倍，60% 以上的胚珠成长为不透明的白球状，并在胚株与珠柄的断裂处留下一 个褐色的痕迹(图3)。 10-15 d开始形成愈伤组织，20d后的愈伤 组织可达到2 - 3 mm,每个离心管中均可生长出50 - 100个愈伤组织。
10'中杂101，和'中杂105，两个品种之间无明显的差异，均获得上 千个的愈伤组织。 实施例2分化培养及生根培养 1、材料和方法
1.1材料实验材料为实施例1获得的愈伤组织。待愈伤组织形 成并生长至2mm左右时，在无菌条件下将其转移至分化培养基中。 子房、半子房和胚珠块也可以釆用普通培养方法，将其接种于三角瓶 或者培养皿中的培养基上。
1.2分化培养基的筛选选用了 60种分化培养基一 以B5、 MS、 DBMII (GreshoffRM.DoyC.H. 1972)、 Nitsch和N6为基本培养基， 附加不同浓度(0.1 - lOOOnmoLL")的生长素。引噪乙酸IAA、 cc-萘乙酸NAA、 2,4-D)和细胞分裂素(激动素KT、 6-节氨基P票呤6-BA、 TDZ、玉米素ZT)，蔗糖浓度为2%，琼脂糖浓度为0.8%， pH5.8-6.0。
当愈伤组织达到2mm大小时，将其转移至分化培养基上，16 h 光照(90iamolm-2s-l)， 8h黑暗培养，温度28"C，湿度70°/。，每20 -40d更换l次培养基。早期的分化培养基可以分装于离心管中，但 当愈伤组织达到5mm左右后须转移至50或100mL的三角瓶中培养。
1.3生根培养及根尖染色体倍性鉴定
当愈伤组织诱导出芽并生长至2-3片叶时，将其转移至MS + 0.2mg/LIAA + 2。/。蔗糖+ 0.8。/。琼脂，pH 5.8的生根培养基中培养，培 养条件与分化培养相同。根尖的染色体的倍性鉴定釆用朱徵(1982)的 方法。
2结果
将2个品种的愈伤组织接种于60种不同的分化培养基中， 一部 分培养基中的愈伤组织逐渐褐化，最后死亡，另一部分培养基中的愈 伤组织生长极其缓慢，最后筛选到6种较好的培养基，在这6种培养基中的愈伤组织生长正常，速度较快。
(1) B5 + NAA 0.02 mg丄"+ ZT 1.0 mg丄"；
(2 ) B5 + NAA 0.5 pmol丄"+ ZT 10.0拜ol丄"；
(3 ) B5 + NAA 4.mg丄"十2,4國D 1 .mg丄"+ KT 0.8 mg丄"；
(4 ) B5 + IAA 0.01 mg丄-1 + ZT 2.0 mg丄-1 ;
(5 ) MS + IAA 0.2 mg丄-1 + 2 mg.U1 6-BA;
(6 ) DBMII + NAA 0.5pmol丄"十ZT 10 jxmol丄國1。 6种培养基的蔗糖浓度均为2%,琼脂糖浓度为0.8%，ph5.8-6.0。 将2个品种的白色的愈伤组织接种于上述6个培养基中，l周后 开始膨大，随后表面稍为变褐，3周左右开始变绿，2-3月后完全变 绿，随后继续生长(图4)。'中杂101'番东在更换15-20次培养基 并生长20月后，3个愈伤组织开始出现绿色的芽点(图6),再过2 -3周后形成2cm左右高的植株，此时，多数愈伤组织为绿色，表现 正常，少数愈伤组织可长成4cm大小的"果实"，最后成熟，"果实" 表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹， 但有番茄的"味道"(图5)。
'中杂105'番东也得到类似于'中杂101'的愈伤组织和"果 实"。在更换10-12次培养基并生长15月后，5个愈伤组织开始出 现绿色的芽点(图6)，再过2-3周后形成2cm左右高的植株，如果 需要可利用这些愈伤组织分化出更多的芽(图7)。
当芽生长至2-3片叶时，将来自愈伤组织的芽转移至生根培养 基MS + 0.2mg丄"IAA + 2。/。蔗糖+ 0.8。/。琼脂，ph5.8中培养，1周后 根即长成(图8)。根尖染色体鉴定结果其染色体数为24条。
本发明建立了在诱导愈伤组织阶段的番茄胚珠的微型培养方法， 实验表明，选择最佳时期的花蕾进行胚珠培养是必须的，本研究结果 表明，E和F类花蕾的胚珠最适合培养，其所对应的小孢子时期为单 核期。根据花蕾大小、花药大小、颜色和胚珠大小来选择单核期的花蕾，在不同的番茄材料中会出现较大的偏差，因此，依据萼片开裂最
深处至花瓣顶端的长度为0 - 3mm (将于4 - 5 d后开放)作为取样标 准，大大提高了取样的准确性。
此外，直接将胚珠接种在三角瓶或培养皿中的常规方法相比，釆 用2mL的离心管进行培养具有优越性，其最主要的优点是可以大大 降低污染率，因为和小孢子相比胚珠的数量是较少的，50个子房的 胚珠仅能接种在2-3个三角瓶中，在预备实验中每个三角瓶平均可 长出2-3个细菌病斑，污染率高达80%以上，在秋季甚至可达100%。 而将50个子房的胚株置于20 - 30个离心管中培养，仅有3 - 6个离 心管受到污染，培养效率数倍地提高，此外釆用离心管法培养还可节 省大量的培养基。参考文献
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权利要求
1、番茄雌核发育培养方法，其以处于E期或F期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm的番茄花蕾。
2、 如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，其中所述愈伤 组织诱导培养基选自B5+ S.Oixmol.U1 2，4-D+1.0 lamol.L"6國BA;B5+2mg丄"2,4-D+1.0 nmol丄"6-BA + 5.0 pmoLI/1 NAA+1.0 jxmol丄—1 IBA+1.0 pmol丄'1 KT;B5+2.0 (xmol丄—1 2，4-D+1.0 (imol丄'1 6-BA + 2.0 pmol丄'1 NAA + l.O拜ol丄-1 TDZ,这三种培养基的蔗糖浓度为1-3%,琼脂糖浓度为0.6-l%，pH5.8。
3、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述愈伤组织 诱导培养在离心管中进行。
4、 如权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于其还包括将 诱导获得的愈伤组织进行分化培养。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分化培养的培 养基选自(1 ) B5 + NAA 0.02 mg丄-1 + ZT 1.0 mg丄"； (2 ) B5 + NAA 0.5 pmol丄-1 + ZT 10.0 (omol丄"； (3 ) B5 + NAA 4.mg丄"十2,4國D 1 .mg丄"+ KT 0.8 mg丄"； (4 ) B5 + IAA 0.01 mg丄-1 + ZT 2.0 mg丄-1 ; (5 ) MS + IAA 0.2 mg丄-1 + 2 mg丄-1 6國BA; (6 ) DBMII + NAA 0.5nmoLU1+ ZT 10 (imol丄國1， 这6中培养基的蔗糖浓度为1-3%，琼脂糖浓度为0.6-1%，pH 5.8。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，分化培养的条件是,16h光照培养，8h暗培养，温度28。C,湿度70%,每20 - 40天更 换1次培养基。
7、 如权利要求4 6任一项所述的方法，其还包括愈伤组织分化 成芽后进行生根培养。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为 MS + 0.2 mg丄"IAA + 2%蔗糖+ 0.8%琼脂，ph 5.8。
全文摘要
本发明提供了一种诱导番茄雌核发育的培养方法，其以处于E期或F期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm的番茄花蕾。通过该方法可获得大量愈伤组织，为研究诱导雌核发育途径获得番茄单倍体提供先决条件。进一步，本发明将愈伤组织在特定的培养基上分化成芽，最后通过生根培养获得完整植株。这为诱导雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。
文档编号A01H4/00GK101658134SQ20081011923
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者王孝宣 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所