专利名称：防干剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以编码热休克蛋白的核酸作为有效成分的防干剂、或者该核 酸作为防干剂的应用。
背景技术：
热休克蛋白(Heat Shock Protein,以下记载为"HSP")是随着高温刺 激而诱导其表达的蛋白质，作为称作"分子伴侣"的一群蛋白质而广为人知。 HSP已被确认广泛存在于从原核生物到真核生物的大量生物种中，例如，已 知有(1)分子量为约15kDa 约30kDa的小HSP (small HSP) ; (2)分子 量为约60kDa的HSP60蛋白或GroEL蛋白("HSP60"的名称是真核生物中 的名称，"GroEL"的名称是原核生物中的名称)；以及(3)分子量为约70kDa 的HSP70蛋白或DnaK蛋白("HSP70"的名称是真核生物中的名称，"DnaK" 的名称是原核生物中的名称)。
关于HSP的功能，虽然已经指出了与高温抗性有关系，但目前还仍处于 研究阶段，已探明的并不多。
作为植物中HSP功能的研究例，已知在烟草中，若通过反义法抑制HSP60 蛋白的表达时，显示出异常的表型(非专利文献1)，另外，已知在拟南芥 (JrahV/opwi Aa/!'a"a)中，若通过反义法抑制HSP70蛋白的表达时，显示 出异常的表型(非专利文献2)。而且，己知在拟南芥中，通过抑制用于控 制热休克基因转录的基因，提高HSP70蛋白的表达量，拟南芥获得了高温抗 性(非专利文献3)。进而已知，当将编码来自栗树(chestnut)的小HSP的 基因导入大肠菌时，若使上述蛋白质在大肠菌中表达，则大肠菌获得了高温 抗性(非专利文献4)。
另外，关于高温抗性以外的环境刺激(例如，高碱性、干燥、或强光) 抗性与分子伴侣之间的关系，例如，已有DnaK及HSP70参与了抗碱性、抗 干燥性等中的报告(专利文献l)。
而且，专利文献2中记载有，在不会对植物体给予特殊剌激的环境下，HSP70起到重要的作用的内容。然而，对HSP70具有抑制由植物引起的水蒸 发的作用，进而，虽然能够大幅促进光合成，但不会促进水蒸发的作用等内 容，没有作出任何的记载，也得不到任何的启示。
专利文献l: JP特开2001-78603号公报
非专利文献1: Plant J.， 6, 425-432(1994)
非专利文献2: Mol. Gen. Genet" 252， 11-19(1996)
非专利文献3: Plant J.， 8， 603-612(1995)
非专利文献4: Plant Physiol.， 120,521-528(1999)
发明内容
发明要解决的课题
在植物的生长过程中水是必须的，然而，特别是在绿化事业等的现实情 况中，希望有能够提高水消费效率的方案。
用于解决课题的方法
技术领域：
本发明人等为了解决上述课题进行了悉心研究的结果，惊奇地发现导入 了 HSP的重组植物相比于没有进行重组的植物，虽然能够大幅促进光合成作 用，但也抑制了蒸发作用的亢进，并通过将HSP作为防干剂，完成了本发明。
艮口，本发明的技术方案如下所述。
1. 一种防干剂，其作为有效成分含有编码热休克蛋白的核酸。
2. 如l所述的防干剂，其特征在于，热休克蛋白为DnaK蛋白或HSP70蛋白。
3. 如2所述的防干剂，其特征在于，上述DnaK蛋白为抗碱性蓝藻的 DnaK蛋白。
4. 一种防干剂，该防干剂作为有效成分含有编码蛋白质的核酸，所述蛋 白质含有下述(a) (d)的氨基酸序列，
(a) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号1 721组成的氨基酸 序列；
(b) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号116 721组成的氨基 酸序列；
5(c) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号164 721组成的氨基 酸序列；
(d) 在(a) (c)的序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或转 移的氨基酸序列。
5. 如1~4中任意一项所述的防干剂，其特征在于，还含有编码蛋白质的 核酸或由该核酸的反义序列组成的核酸，所述蛋白质是由参与光合成控制的 的蛋白质/酶、控制植物体大小的蛋白质/酶、促进根伸展的蛋白质/酶、促进 植物体生长的蛋白质/酶、以及提高RNA稳定性的蛋白质/酶组成的组中选出 的一种以上蛋白质。
6. 如1~5中任意一项所述的防干剂，其特征在于，核酸为脱氧核糖核酸。
7. 编码热休克蛋白的核酸作为防干剂的应用。
8. 编码DnaK蛋白或HSP70蛋白的核酸作为防干剂的应用。
9. 如8所述的应用，其特征在于，上述DnaK蛋白为抗碱性蓝藻的DnaK 蛋白。
10. 编码含下述(a) (d)氨基酸序列的蛋白质的核酸作为防干剂的应用，
(a) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号1 721组成的氨基酸 序列；
(b) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号116 721组成的氨基 酸序列；
(c) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号164 721组成的氨基 酸序列；
(d) 在(a) (c)的序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或转
移的氨基酸序列。
11. 上述1 6中所述的防干剂在提高光合成效率中的应用。
12. —种植物蒸发抑制方法，其特征在于，将编码热休克蛋白的核酸导 入植物细胞内的基因组中，并使含导入有上述核酸的基因组的植物细胞生长。
另外，在本说明书中，"植物"意指将生物分类为微生物、植物、及动 物的三种类时的上述植物，包括植物体(即植物整体)及其一部分(例如， 花、叶、茎、根、或种子、或组织)。另外，"植物细胞"包括已经分化的 植物的细胞/组织之外，例如还包括未分化的植物细胞或未分化的植物组织培养物、或原生质体、愈伤组织(细胞团块)、不定胚、不定芽。
另外，"育种"意指使之生长、进行培养等使植物细胞增殖、分化、肥 大化、伸张等成长行为。
发明效果
根据本发明，能够提供HSP作为防干剂的新型用途。
图1是通过二氧化碳固定量比较作用了本发明防干剂的水稻和对照群水 稻的光合成活性的图。"样品(Sample)"表示作用了本发明防干剂的水稻， "对照(Control)"表示对照群水稻。纵轴表示二氧化碳固定量(单位面积、 单位时间固定的二氧化碳量)。 ^
图2是比较作用了本发明防干剂的水稻和对照群水稻的蒸发速度的图。 "样品(Sample)"表示作用了本发明防干剂的水稻，"对照(Control)" 表示对照群水稻。纵轴表示蒸发速度(单位面积、单位时间内释放到大气中 的水分子摩尔数)。
具体实施例方式
下面，通过用于实施本发明的最佳方式，详细说明本发明。 1.本发明的防干剂
本发明的防干剂作为有效成分含有编码HSP的核酸。 作为本发明防干剂中的"HSP"，可以使用小HSP(例如，Mol. Gen. Genet.， 219，365-372(1989)中记载的HSP17.4蛋白或HSP18.2蛋白等)、HSP60蛋白 (例如，Plant Mol. Biol.， 18， 873-885中记载的HSP60蛋白等)、GroEL蛋白 (例如，Plant J., 10， 1119-1125(1996)中记载的CPN10蛋白)、HSP70蛋白(例 如，Plant Mol. Biol., 25， 577-583(1994)中记载的HSC70蛋白、PlantPhysi1。.， 88, 731-740(1988)中记载的HSP70-l蛋白、HSP70-2蛋白、HSP70-3蛋白、Plant Cell Physiol.， 37， 862-865(1996)中记载的BiP蛋白等)DnaK蛋白、HSP90(Plant Physio1.，99, 383-390(1992)中记载的HSP81-l蛋白、HSP81-2蛋白、HSP81-3 蛋白、Plant Mol. Biol., 35, 955-961(1997)中记载的HSP81-4蛋白、HSP88.1蛋白、HSP89,1蛋白等)、HSP100 (PlantCell, 6, 1899-1909 (1994)中记载的 HSP101蛋白等)中的任意一种，但优选DnaK蛋白及HSP70蛋白。优选DnaK 蛋白质，特别优选抗碱性蓝藻或细菌的DnaK蛋白。
作为HSP70蛋白，可以使用真核生物的HSP70蛋白，例如，可以举出 动物、植物、或真菌(例如霉菌、酵母菌或伞菌等)的HSP70蛋白。
在这些蛋白质中，特别优选抗碱性蓝藻类的DnaK蛋白。作为上述抗碱 性蓝藻，只要是具有抗碱性的蓝藻即可，没有特别的限定，例如，可以举出 在NaCl浓度为0.25 mol/L 3mol/L的条件下能够生长的高碱抗性蓝藻，作为 实例可以举出嗜盐隐杆藻(^ /2a"W/^ce /2a/op/zWca)。作为抗碱性蓝藻中的一 种的嗜盐隐杆藻的DnaK蛋白，整体上由721个氨基酸残基组成，其与抗碱 性蓝藻以外的原核生物(例如，大肠菌或淡水性蓝藻)的DnaK蛋白、或真 核生物的HSP70蛋白不同，在羧基末端(C末端)具有由约100个氨基酸残 基组成的多余的氨基酸序列。已知嗜盐隐杆藻的DnaK蛋白具有即使在高碱 性浓度中，也影响其他蛋白质正确组装的特性。将嗜盐隐杆藻DnaK蛋白的 氨基酸序列示于序列号2。若将编码该DnaK蛋白的核酸导入植物细胞的基 因组，则通过后述的蒸发抑制效果的确认方法评价的蒸发抑制效果，比未使 用本发明防干剂的植物相比提高了 20%以上。本发明防干剂中作为有效成分 使用的核酸，优选为具有50%以上蒸发抑制效果的核酸，更优选为具有65% 以上蒸发抑制效果的核酸，最优选为具有80%以上蒸发抑制效果的核酸。
然而，天然存在的蛋白质中，除了编码该蛋白质的DNA的多态性或突 变以外，由于生成后的蛋白质细胞内及精制中的修饰反应等，在其氨基酸序 列中可能发生氨基酸的取代、缺失、插入或转移等突变。已知尽管有这样的 突变，仍具有与未突变的蛋白质实质上同等的生理、生物学活性。如此的虽 然在结构上存在一些差异，但在其功能上没有太大的差别的蛋白质，也包含 在由作为本发明防干剂有效成分的核酸编码的氨基酸序列中。人为地向蛋白 质的氨基酸序列导入上述突变的情况下也相同，在这种情况下能够制造出更 多种多样的突变体。例如，在人白细胞介素2 (IL-2)的氨基酸序列中，已知 用丝氨酸取代某半胱氨酸残基的多肽保持IL-2活性(Science，224,1431(1984))。 另外，已知某种蛋白质具有对活性不是必要的肽区域。例如，在细胞外分泌 的蛋白质中存在的信号肽、蛋白酶的前躯体中常见的前序列等相当于这些，
8这些区域中的大多数在转译后，或向活性型蛋白质转化时被去除。这种蛋白 质是虽然在一次结构上以不同的形式存在，但最终具有同等功能的蛋白质。
同样，DnaK蛋白及HSP70蛋白当然包含天然的DnaK蛋白及HSP70蛋 白、还含有突变体、基因学上能够得到的基因重组蛋白、或者氨基酸序列为 在DnaK蛋白或HSP70蛋白的氨基酸序列中一个或一个以上(优选一个或多 个)氨基酸发生缺失、取代、或添加的氨基酸序列的突变蛋白质。另外，本 说明书中所说的"多个"是指氨基酸序列中全部氨基酸数量的7%的整数个， 优选为5%的整数个、更优选为3%的整数个。例如，在由721个氨基酸组成 的氨基酸序列中，表示50个，优选表示36个，更优选表示21个。
但是，已知P-l，4-半乳糖基转移酶在框架内包含两个ATG密码子
(Nakazawa, K. et al. (1988) J.Biochem， 104， 165-168、 Shaper， N. et al. (1988) J. Biol. Chem.， 263, 10420-10428)。另外，Shaper等发现，由于从两处开始翻 译，P-l,4-半乳糖基转移酶同时具有长的形式和短的形式的两种形式。如此 地，在自然界存在的氨基酸中，已知存在着即使来自同一基因也具有不同大 小的蛋白质。同样，例如在DnaK中，也存在着多个ATG密码子作为开始密 码子起作用的可能性。然而，不管哪个ATG密码子为开始密码子，在编码上 述DnaK蛋白的方面是相同的，具有从第2位、第3位ATG密码子开始的碱 基序列的核酸也可以在本发明的防干剂中使用。因此，DnaK蛋白除了包含 序列号2记载的由嗜盐隐杆藻氨基酸序列的氨基酸编号1 721组成的氨基酸 序列以外，还包含由氨基酸编号116 721组成的氨基酸序列、由氨基酸编号 164 721组成的氨基酸序列。
本发明防干剂中的"核酸"，可以举出脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸
(RNA)，从本发明防干剂的保存稳定性及使用时的稳定性优异的方面考虑， 优选为DNA。另外，这些核酸既可以是单链(例如，DNA为上述HSP的正 义链或者反义链中的任意一种)，也可以是双链(成对的上述正义链及反义 链)，但从核酸的稳定性优异方面考虑，优选双链。例如，作为编码上述嗜 盐隐杆藻的氨基酸序列(序列号2记载)的DNA碱基序列，可以举出由序 列号1记载的碱基序列中的碱基编号1 2166组成的碱基序列。另外，作为 编码由序列号2的氨基酸编号116 721组成的氨基酸序列的DNA碱基序列， 可以举出由序列号1记载的碱基序列中的碱基编号345 2166组成的碱基序列。进而，作为编码由序列号2的氨基酸编号164 721组成的氨基酸序列的 DNA碱基序列，可以举出由序列号1记载的碱基序列中的碱基编号490 2166组成的碱基序列。另外，对应一个氨基酸的密码子(对应氨基酸的碱基 序列)存在多个是本领域技术人员的公知技术。因此，对本领域技术人员来 说，很容易理解例如编码序列号2记载的氨基酸序列的碱基序列，不能解释 为限定在序列号1记载的碱基序列中。
另外，由这样的碱基序列组成的核酸(例如DNA)，也可以在构成该核 酸的碱基序列中具有一个或多个碱基的取代、缺失、插入或转移。即使发生 了该突变，突变对由其编码的氨基酸序列的影响小，只要能够保持本发明防 干剂的蒸发抑制效果(优选通过湿润重量测定的生长率保持30%以上)，也 可以对氨基酸序列给予突变。该碱基序列，可以举出严谨条件下与由序列号 1记载的碱基序列组成的核酸(DNA或RNA)杂交的核酸。
另外，"严谨条件下"是指，例如在50%甲酰胺、5XSSPE (20XSSPE: 包含2.97 mol/L NaCl、 0.2 mol/L NaH2P04 H20、 0.025 mol/L EDTA (乙二 胺四乙酸)的pH7.4的水溶液)、5XDenhardt's溶液(100XDenhardt's液 将lg聚蔗糖400 (Pharmacia公司制)、lg聚乙烯吡咯垸酮(PVP-360: Sigma Corporation制)、lgBSA FractionV (牛血清白蛋白Sigma Corporation制) 溶解在50ml水中的水溶液)、0.5%SDS (十二烷基硫酸钠)存在下、于42 'C温度下16小时的恒温箱、进而依次用含0.1%SDS的1 XSSPE、含0.1%SDS 的0.1XSSPE在55"C下进行洗涤的条件，或与核酸的杂交中同等功能的条件。 在该条件下，由与某DNA杂交的碱基序列组成的DNA，与某DNA至少具 有70%以上的同一性，例如，由2166碱基组成的DNA中，1527碱基以上的 碱基序列是共同的。
该核酸可作为防干剂使用(将该使用称作"本发明使用")。
本发明防干剂优选还含有编码HSP以外的蛋白质的核酸。即，由于本发 明的防干剂是用于改善基因重组植物中的生长性不良，因此，能够想到将编 码HSP以外蛋白质的核酸同时导入基因组时的使用。作为该"HSP以外的蛋 白质"，例如可以举出用于促进光合成的酶等基因(例如，磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶(JP特开平10-248419号公报)等)、赋予不稔性的反义序列(Bgpl (国际公开公报W09413809) 、 MS2 (美国专利第5932784号公报)等)、控制植物体大小的基因(B0N1 (美国公开2002/0194639号公报)、BAP1 (美国公开2002/0194639号公报)等)、与根的伸展有关的基因(脯氨酸转 运因子的基因(ProT:例如，Plant Cell Physiol" 42(11)， 1282隱1289(2001)记载)、 果糖-l，6-二磷酸醛縮酶基因(美国专利第6441277号公报)等)、促进植物 体生长的基因(细胞周期蛋白基因(美国专利第6166293号公报)等)、提 高RNA (mRNA)稳定性的蛋白质的基因(HVD1基因(JP特开2002-34576 号)等)等，可以使用任意一种。上述"HSP以外的蛋白质"既可以作为与 HSP的融合蛋白表达的方式构建，也可以作为单独的蛋白质表达的方式构建。
上述本发明的防干剂中含有的上述核酸，能够以核酸单体的状态存在， 但为了提高核酸的稳定性，例如，优选以导入到使用本发明防干剂时采用的 重组载体中的状态存在。作为该重组载体的实例，例如，可以举出二元载体 pBI121 (Methods Enzymol., 118， 6270640(1986)记载)、pCIAMBIA 、 pE21-Q-MCS等，可以使用现有的重组载体。只要是本领域技术人员，考虑 到向由本发明防干剂促进生长的对象植物基因组的导入效率，能够选择适当 的重组载体而使用。
将核酸导入重组载体时，优选在要导入的核酸的上游及下游，分别插入 能够在对象植物细胞内起作用的启动子及终止子，另外，优选作为得到转化 体时有效的筛选标记插入合适的DNA。
作为上述启动子，例如，可以举出花椰菜花叶病毒35S启动子。作为上 述终止子，例如，可以举出来自胭脂碱合成酶(NOS)的终止子。作为上述 筛选标记，例如，可以举出卡那霉素抗性基因(NPTII)、潮霉素抗性基因(HPT 基因)等。
作为本发明防干剂的剂型，可以举出液状、微粉状、膏状等，只要不损 害本发明防干剂中含有的核酸的稳定性，且能够在后述的使用例中使用的情 况下，也可以采用其他剂型。
2.本发明的蒸发抑制方法
技术领域：
本发明的蒸发抑制方法，其特征在于，将编码HSP的核酸导入植物细胞 内的基因组中，并使含有导入了上述核酸的基因组的植物细胞生长。
本发明的蒸发抑制方法中，"HSP"及"核酸"与上述"1.本发明的防
ii干剂"中记载的相同。
本发明蒸发抑制方法中的"植物细胞"可以是被子植物细胞或裸子植物 细胞中的任意种，也可以是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞中的任意种， 另外，还可以是草本植物或木本植物中的任意种。作为草本植物，例如可以
举出谷类植物，草坪草(Turfgrass)类、或野菜类，作为木本植物，例如可以举 出常绿阔叶树、落叶阔叶树等。
作为上述草坪草类，例如，可以举出禾本科草[例如，画眉草亚科(例 如，牧草类(grass group)或狗牙根(Bermuda grass)类)、羊茅亚科(例如， 剪股颖(bent grass)类、早熟禾(blue grass)类、牛毛草(fescue)类、或 黑麦草(ryegrass)类)、或者黍亚科(Panicoideae)]、莎草禾斗(Cyperaceae) 类、及菊科类。作为上述谷类植物，例如，可以举出禾本科植物、例如，水 稻、黑麦、大麦、小麦、小米、高粱、甘蔗、玉米/爆花用玉米、或薏苡。作 为上述野菜类，例如，可以举出茄科植物(例如，烟草、茄子、马铃薯、番 茄、或辣椒)、藜科植物(例如，菠菜、糖萝卜等)、豆科植物(例如，大 豆、小豆、豌豆等)、油菜科(例如，油菜、芝麻叶等)或芝麻科植物(例 如芝麻)。
作为上述常绿阔叶树，例如可以举出桉树、刺槐、或咖啡树。作为上述 落叶阔叶树，例如，可以举出白杨、柞树、賴晰、白桦、或袍栎。
另外，本发明的促进方法对通常作为观叶植物为人所知的植物(例如龙 舌兰科、天南星科、棕榈科、五加科、桑科、萝摩科、爵床科、夹竹桃科、 竹芋科、柏科、芸香科、木棉科、露兜树科、芭蕉科、大戟科、木樨科、鸭 跖草科、凤梨科、景天科、龙血树科、杨柳科等植物、蕨类植物等)也有效。
在该植物细胞中，优选禾本科植物、藜科植物、豆科植物、油菜科植物、 桉树、刺槐、白杨的细胞，特别优选甘蔗、糖萝卜、大豆、油菜、芝麻、桉 树、白杨的细胞，但只要能够促进生长即可，并不限定于这些植物。
作为将核酸导入该植物细胞内基因组的方法，可以使用通过公知的表达 载体(pBI121等)，例如使具有含目的基因的载体的土壤杆菌(Agrobacterium) 感染在植物组织的方法；聚乙二醇处理法；对原生质体进行电脉冲处理从而 将上述载体导入的电穿孔法；或者、将上述载体置于金属粒子而导入植物组 织的基因枪法等的常用方法。使通过上述方法转化的植物细胞，在适当的培养基[例如，MumshigeandSkoog培养基;Plant Physiol" 15,473-497(1962)]中生长、再生，由此能够得到转化植物。此时，若将对应于筛选标记的适当的抗生物质(例如，卡那霉素)添加培养基，则可以选择转化体。
例如，当将编码DnaK蛋白或HSP70蛋白的DNA导入禾本科草(例如，结缕草或剪股颖)时，可根据以下步骤实施。
根据上述聚乙二醇处理法导入时，例如，可如下所述地进行。将1 100pg/mL载体和105 106个/mL原生质体悬浮在作为浸透压调节剂含有0.4 0.6mol/L甘露醇等的缓冲液等液体溶剂中。向其中添加聚乙二醇溶液，以使最终浓度达到10 30%，在室温下放置5 30分钟后，通过稀释聚乙二醇，将基因导入原生质体中。
通过上述电穿孔法进行的导入，可如下所述地进行。将1 100pg/mL载体和105 106个/mL原生质体悬浮在作为浸透压调节剂含有0.4 0.6mol/L甘露醇等的缓冲液等液体溶剂中。向其施加由电场强度300 600V/cm、时间常数10 50ms组成的电脉冲，从而施加电剌激，将基因导入原生质体中。
通过上述基因枪法进行的导入，例如，可如下所述地进行。使细胞团块(0.3 0.5ml程度)均匀地展开/吸附在过滤纸上。然后，准备通过氯化转和亚精胺吸附了载体的直径0.1 5pm的金属粒子，利用基因枪，以800 1500PSI的空气压力或火药爆炸时的压力，打入细胞团块而进行导入。作为金属粒子，可以使用钨或金等。
基因导入处理后的原生质体，通过在植物的组织培养培养基中，例如在N6培养基、R2培养基、K8p培养基、或AA培养基等中添加植物生长调节剂，例如添加2,4-二氯苯氧基乙酸、萘乙酸等茁长素类及激动素等细胞分裂素类而成的液体或固体培养基进行培养。培养在暗处进行，温度优选为20 30°C。通过上述培养，由导入了基因的原生质体形成细胞团块。
通过在植物的组织培养培养基中，例如在N6培养基、R2培养基、K8p培养基、或AA培养基等中添加植物生长调节剂，例如添加2， 4-二氯苯氧基乙酸、萘乙酸等茁长素类及激动素等细胞分裂素类而成的液体或固体培养基培养基因导入处理后处于脱分化状态的细胞团块。培养在暗处进行，温度优选为20 30°C。进而，每14 40天更换新鲜培养基，继续进行培养。培养优选在明处进行。培养开始24 48天后能够得到不定胚或不定芽。
将上述不定胚或不定芽，通过在植物体再生培养基中，例如在N6培养 基、R2培养基、MS培养基、或LS培养基等中添加植物生长调节剂，例如 添加2， 4-二氯苯氧基乙酸、萘乙酸等的茁长素类及激动素等细胞分裂素类而 成的培养基进行培养。每14 40天更换新鲜培养基，继续进行培养。培养优 选在明处进行。培养开始24 48天后可以得到转化植物体。
通过下述方法，比较如此得到的植物体与在通常的生长条件下未采用本 发明蒸发抑制方法而生长的植物体的生长率时，从上述得到的植物体中能够 观察到蒸发抑制效果。
例如，通过下述方法能够确认本发明蒸发抑制方法的效果。 艮P，可以举出，使插入了不含HSP的载体的阴性对象植物和蒸发抑制对 象植物生长，测定经过相同生长期间的植物体吸水量的方法；或者，釆取植 物体整体或其一部分，测定释放出空气中的水蒸气量并进行对比的方法。
根据本发明的蒸发抑制方法，若使阴性对象和样品在同一条件下进行光 合成时，则光合成活性亢进10%以上(优选15%以上，最优选20%以上)， 而且蒸发作用的亢进被抑制在低于10% (优选低于5%，更优选低于3%)。 这些测定，若根据实施例中记载的方法进行，则能够达到更正确的测定。
3.本发明防干剂的使用方法
技术领域：
本发明防干剂可通过公知方法将其导入植物细胞的基因组，使具有导入 后基因组的植物体培养或生长而使用。
将本发明防干剂导入植物细胞基因组的方法，可通过已公知的方法进行， 作为该方法，可以举出在"2.本发明的蒸发抑制方法"中记载的将土壤杆菌 感染在植物组织的方法、聚乙二醇处理法、电穿孔法、以及基因枪法等，都 是采用重组载体的方法。
当待编码HSP的核酸插入在重组载体中，并将该HSP使用于本发明防 干剂时，可以使用插入有该核酸的重组载体或根据生长促进对象的植物制备 的载体(通过公知的方法切取"编码HSP的核酸"并进行分离，通过公知方 法导入至根据生长促进对象植物选择的重组载体中而构建)。
作为本发明防干剂的使用对象的植物，与"2.本发明的蒸发抑制方法"
14中记载的植物相同。
重组载体向植物细胞的导入，可通过事先插入在重组载体中的标记基因
(例如，卡那霉素抗性基因(NPTII)、潮霉素抗性基因(HPT基因)等的 表达系来确认。例如，当将NPTII等抗生物质抗性基因作为标记基因使用时， 则重组后在含有对应于抗性基因的抗生物质的培养基中培养植物细胞，选择 在该培养基中生长的植物细胞，由此能够得到基因导入在基因组的株。
对所选株的培育，只要是本领域技术人员，均可以在适当的条件下进行。
实施例
下面，通过实施例更具体地说明本发明。 测定例h
1. 糖/淀粉的提取
糖的提取是根据Rufty方法进行(Rufty， T.W. and Huber， S.C. 1983. Plant Physiol. 72 :474-480)。
艮P，按照下述方法进行糖分级。用液氮将新鲜重为0.2 8的叶子粉碎，并 通过5ml、 80。/。(v/v)的乙醇在IO(TC下煮沸1小时而提取。然后在3000Xg下 离心分离5分钟，回收上清。进而，将2.5ml的80。/o(v/v)乙醇添加至残渣中 进行悬浮，并以3000Xg进行5分钟离心分离，从而回收上清，将上述操作 重复两次。通过该80。/。(v/v)乙醇提取的糖的分级，包括蔗糖、己糖、戊糖、 可溶性低聚糖。
淀粉分级的提取是如下所述地进行。在该沉淀物中加入0.2mol/L氢氧化 钾lml，在IOO'C下处理1小时后，添加lmol/L的乙酸缓冲液(pH5.5)0.2mL
进行中和。进而，用10ml氨基葡萄糖苷酶(来自枯草杆菌(^fe^M^): 和光纯药工业制，含35 U/mL的50 mmol/L乙酸缓冲液，pH 5.5)在37。C下消 化16小时。对该可溶化状态的糖进行淀粉分级。
2. 糖的定量
糖的定量是通过蒽酮法进行(Roe， J.H. 1955，J. Biol. Chem. 212 : 335-343)。 即，在蒽酮试剂(含0.05%蒽酮的66% H2S04)lml中，添加上述1得到的糖 提取液20-100 nl，使其在10(TC下反应15分钟。然后，以葡萄糖为标准测定 620nm吸光度。测定例2:光合成活性的测定
二氧化碳的固定和蒸发速度，是在C02为350ppm、温度为25'C、湿度 为60°/。的条件下，通过光合作用测试系统(photosynthesis system) HCM-1000 (Heinz Walz GmbH, Germany)进行。这些测定是在上午11点~下午1点之间进 行。
实施例1:本发明防干剂的制造
从具有嗜盐隐杆藻DnaK基因的质粒pEADKl [Plant Mol. Biol.， 35， 763-775(1997)]，切取含DnaK基因的Xbal/Bamffl片段(即，由限制性酶 XbaI及Bamffl消化而得到的DNA片段)，导入至二元载体pBI121的Xbal /BamHI认知部位。通过该操作，能够得到在二元载体中的花椰菜花叶病毒 35S启动子与来自胭脂碱合成酶(NOS)的终止子之间导入了嗜盐隐杆藻 DnaK基因的pBI121-ADK。该质粒pBI121-ADK，作为筛选标记具有来自上 述二元载体pBI121的卡那霉素抗性基因(NPTII)。
将如此得到的pBI121-ADK作为冷冻干燥制剂的本发明防干剂1 。
pBI121-ADK可在广泛通用于水稻、麦子等禾本科植物、烟草等茄科植 物、结缕草等草本植物、以及其他各种植物(对观叶植物等也相同)中的本 发明防干剂上应用。
另外，根据常用方法，使在插入上述pBI121之前的DnaK基因上游连接 了 Xbal粘着末端的HVD1基因加以连接，并导入至pBI121而得到的 pBI121-ADKHD冷冻干燥，得到本发明防干剂2。另外，通过同样的方法， 能够得到使用了 ProT基因的本发明防干剂3 (所得到的重组载体为 pBI121-ADKPT)。
同样，能够制造出含插入了小HSP sHSP的pBI121-SH的本发明防干剂 2，所述小HSP sHSP来自从kazusaDNA研究所得到的蓝绿藻(Cya"o6acferfa)， 另外，同样可以制造出含插入了 HSP60的pBI121-H6的本发明防干剂3。
实施例2:本发明防干剂在水稻中的使用
通过电穿孔法，将实施例1得到的本发明防干剂1导入根癌农杆菌 "grotofer/,麵gfe.，) EHA101株中。此时，作为二元载体使用pCAMBIA[Nucleic Acid Res" 12， 8711 -87210 984〗]。接着，对来自水稻(Ory加 ^M厶7Voto/2汰aW)种子胚的不定胚状愈伤组织，利用含本发明防干剂的根 癌农杆菌进行转化处理。使其在含3%蔗糖及50 u g/mL潮霉素的Mumshige & Skoog琼脂培养基[Plant Physiol.， 15， 473-497(1962)]上无菌生长，得到合 计250个植物株。从中选择15种独立转化体(F0)，采集种子。从15种F1 中，选择4种DnaK-mRNA表达量多者，采集种子。所得到的4种转化体(F2) 均表示基本相同的表型。以下，将其中的l种用于水稻的分析中。
另外，作为对照群使用仅导入pBI121且生长5周后的水稻(图l)。 结果，使用本发明防干剂1的水稻，根据测定例确认光合成活性时，可 以确认比对照群20%以上的亢进。
另一方面，根据测定例测定蒸发作用时，可以确认亢进均低于3%(图2)。
实施例3:本发明防干剂在烟草中的使用
通过电穿孔法，将实施例1得到的本发明防干剂1导入根癌农杆菌 LBA4404株中。此时，作为二元载体，使用pCAMBIA [Nucleic Acid Res.， 12， 8711-8721(1984)]。
接着，利用导入了上述本发明防干剂1的根癌农杆菌，处理从烟草 (Nicotianatabacum PetitHavaba SR1)叶切取的圆形叶片。使其在含3%蔗糖 和50 u g/mL卡那霉素的Murashige & Skoog寒天培养基上无菌生长，得到合 计250个植物株。从中选择15种独立转化体(F0)，采集种子。从15种F1 中，选择4种DnaK-mRNA表达量多者，采集种子。所得到的4种转化体(F2)
均表示基本相同的表型。
该烟草与没有作用本发明生长促进剂1的烟草(野生烟草)相比，能够
确认烟草中的蒸发抑制效果。
实施例4:本发明防干剂在结缕草中的使用
将上述实施例r中制备的本发明防干剂1用于结缕草(Zo油,.,"^) 的原生质体中，使处理后的结缕草生长，比较该结缕草与未作用本发明防干 剂l的结缕草(野生结缕草)，能够确认结缕草中的蒸发抑制效果。
17实施例5:本发明防干剂在剪股颖中的使用
通过上述实施例1中制备的本发明防干剂2处理匍匐剪股颖"簡fe 的原生质体，并使该匍匐剪股颖生长。通过比较该匍匐剪股颖的 生长和导入了仅插入有HVD1基因的表达载体pBI121的匍匐剪股颖生长， 能够确认本发明防干剂2的蒸发抑制效果。
实施例6:本发明防干剂在白杨中的使用
通过电穿孔法，将实施例1得到的本发明防干剂2导入根癌农杆菌 LBA4404株中。此时，作为二元载体，使用pE2113-Q [Nucleic Acid Res.， 12, 8711-8721(1984)]。
接着，将无菌条件下从白杨(尸,/"s r函/")苗取出的胚轴，在导入 了上述本发明防干剂2的根癌农杆菌溶液中浸渍7分钟。然后，将其置于LS 培养基，使其在暗处生长2天。然后，取出胚軸，用CIM培养基(callus induction medium:在LS培养基含有0.1 P mol/L的4PPU、 50 u g/mL的卡那霉素、300 "g/ml羧苄青霉素、0.3%的gel lyte)使其生长。形成新芽后，切出新芽，移 到RIM培养基(root induction medium: LS培养基上含有4 u mol/L的卩引哚乙 酸、50ixg/mL的卡那霉素、300 u g/mL的羧苄青霉素、0.3%的gel lyte)使 其生长。等到根分化、且植物生长一定程度后，使其适应水土移到盆中生长， 得到植物株。其中选择7种独立转化体(F0)，采集种子。从5种F1中，选 择DnaK-mRNA表达量多的4种，结果，所得4种转化体(F2)均表示基本 上相同的表达型。
比较该白杨与未作用本发明防干剂2的白杨(野生白杨)，结果能够确 认白杨中的蒸发抑制效果。
权利要求
1.一种防干剂，其作为有效成分含有编码热休克蛋白的核酸。
2. 如权利要求1所述的防干剂，其特征在于，热休克蛋白为DnaK蛋白或HSP70蛋白。
3. 如权利要求2所述的防干剂，其特征在于，上述DnaK蛋白为抗碱性蓝藻的DnaK蛋白。
4. 一种防干剂，该防干剂作为有效成分含有编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有下述(a) (d)的氨基酸序列，(a) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号1 721组成的氨基酸序列；(b) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号116 721组成的氨基酸序列；(c) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号164 721组成的氨基酸序列；(d) 在(a) (c)的序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或转移的氨基酸序列。
5. 如权利要求1~4中任意一项所述的防干剂，其特征在于，还含有编码蛋白质的核酸或由该核酸的反义序列组成的核酸，所述蛋白质是由参与光合成控制的蛋白质/酶、控制植物体大小的蛋白质/酶、促进根的伸展的蛋白质/酶、促进植物体生长的蛋白质/酶、以及提高RNA稳定性的蛋白质/酶组成的组中选出的一种以上蛋白质。
6. 如权利要求1~5中任意一项所述的防干剂，其特征在于，核酸为脱氧核糖核酸。
7. 编码热休克蛋白的核酸作为防干剂的应用。
8. 编码DnaK蛋白或HSP70蛋白的核酸作为防干剂的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，上述DnaK蛋白为抗碱性蓝藻的DnaK蛋白。
10. 编码含下述(a) (d)氨基酸序列的蛋白质的核酸作为防干剂的应用，(a)由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号1 721组成的氨基酸序列；(b) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号116 721组成的氨基酸序列；(c) 由序列号2记载的氨基酸序列中的氨基酸编号164 721组成的氨基酸序列；(d) 在(a) (c)的序列中具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或转移的氨基酸序列。
11. 如权利要求1~6中任一项所述的防干剂在提高光合成效率中的应用。
12. —种植物的蒸发抑制方法，其特征在于，将编码热休克蛋白的核酸导入植物细胞内的基因组中，并使含有导入了上述核酸的基因组的植物细胞生长。
全文摘要
本发明提供以编码来自耐碱性蓝藻的热休克蛋白的核酸作为有效成分的防干剂。进而，还提供含有编码由参与光合成控制的蛋白质/酶、控制植物体大小的蛋白质/酶、促进根伸展的蛋白质/酶、促进植物体生长的蛋白质/酶、以及提高RNA稳定性的蛋白质/酶中选出的蛋白质的核酸或由该核酸的反义序列组成的核酸的防干剂，该防干剂在提高光合成效率中的应用，植物的蒸发抑制方法。
文档编号A01H1/00GK101675162SQ20088001059
公开日2010年3月17日 申请日期2008年3月26日 优先权日2007年3月28日
发明者内田明男, 高倍昭洋, 高倍铁子 申请人:Scivax股份有限公司