检测草甘膦及其代谢物的方法和组合物的制作方法

专利名称：检测草甘膦及其代谢物的方法和组合物的制作方法
专利说明检测草甘膦及其代谢物的方法和组合物 发明领域 本发明涉及检测草甘膦和/或它的代谢物在各种测试基质(matrices)中的存在或含量。

背景技术：
草甘膦(DPX-B2856)是广泛用于农作物(crops)的非选择性除草剂中的活性成分，其中所述农作物已经被进行遗传修饰，以抵抗该除草剂活性。草甘膦抑制芳香族氨基酸在植物中的生物合成所需的EPSPS(烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)酶。已经通过在植物中用微生物起源的EPSPS(烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)、GOX(草甘膦氧化还原酶)和glyat(草甘膦N-乙酰转移酶)酶变体对该植物进行遗传修饰而实现农作物对草甘膦的耐药性。EPSPS变体破坏草甘膦对EPSPS酶的活性，在植物中留下完整(intact)的草甘膦。GOX变体通过的脱羧成AMPA而解毒草甘膦。Glyat变体提供通过草甘膦分子的酶促乙酰化，而形成非植物毒性代谢物N-乙酰草甘膦进行草甘膦解毒的新模式。参见例如Castle等(2004)Science 3041151-1154。需要对草甘膦和草甘膦代谢物在各种测试基质——包括各种动植物基质——中的存在和含量进行调节性监视。
发明概述 本发明提供允许确定草甘膦及其代谢物、衍生物或降解残余物在各种测试基质中的存在或含量的方法和组合物。包括在该分析方法内的有关的草甘膦代谢降解物是N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰基AMPA)和氨甲基膦酸(AMPA)。N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA是在包含glyat(草甘膦N-乙酰转移酶)基因的基因修饰植物中发现的新的草甘膦代谢物。在一种方法中，确定N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA在测试样品中的存在或含量包括提供怀疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的测试样品；从该测试样品提取包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的组合物；和检测所述组合物的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。
在其它方法中，确定了测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它们的代谢物的至少一种的存在或含量。这种方法包括提供怀疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA或者它们的代谢物的至少一种的测试样品；从该测试样品提取包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或者它们的代谢物的组合物；和检测草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或者它们的代谢物的至少一种。在具体实施方式
中，在，没有衍生化草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的情况下进行草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的检测。
附图简述


图1提了代表性的草甘膦质谱。
图2提了代表性的N-乙酰草甘膦质谱。
图3提了代表性的AMPA质谱。
图4提了代表性的N-乙酰AMPA质谱。
图5提了代表性的校准曲线。
图6A和B提了代表性的校准用标准色谱。
图7提供了采用稳定同位素内标的代表性的5ng/ml草甘膦和AMPA色谱。草甘膦和草甘膦1，2-13C15N稳定同位素在5ng/ml下是等价的并且显示出一致的峰面积响应(2074，1885)。由于AMPA与草甘膦等价是5ng/ml且AMPA13C15N是5ng/ml，所以同位素峰响应与AMPA/草甘膦的摩尔比(111/169＝0.66≈628/902)一致。
图8提了代表性的玉米饲料色谱。
图9提了代表性的玉米粒色谱。

图10提了代表性的玉米稿秆(stover)色谱。

图11提了代表性的玉米油色谱。

图12提了代表性的玉米面粉色谱。

图13提了代表性的玉米渣(grit)色谱。

图14提了代表性的玉米淀粉色谱。

图15提了代表性的玉米粗粉(meal)色谱。

图16提了代表性的大豆饲料色谱。

图17提了代表性的大豆种子色谱。

图18提了代表性的大豆干草色谱。

图19提了代表性的大豆油色谱。
图20提了代表性的大豆粉色谱。
图21提了代表性的大豆外皮色谱。
图22A和B提了代表性的李子色谱。
图23A和B提了代表性的酸橙色谱。
图24提供了酸改性剂对草甘膦LC/MS/MS响应的影响。
图25提供LC/MS/MS分析，其显示了草甘膦1，2-13C215N和AMPA13C15N标准物的同位素纯度评价。
图26提供了大豆粉LOQ加标样品(fortification sample)的信噪比和LOD测定。
图27提供了0.050ppm草甘膦的玉米饲料加标样品的代表性API4000LC/MS/MS色谱。
图28提供了0.050ppm N-乙酰草甘膦的玉米饲料加标样品的代表性API 4000LC/MS/MS色谱。
图29提供了0.05ppm N-乙酰AMPA的玉米饲料加标样品的代表性API 4000LC/MS/MS色谱。
图30提供了0.05ppm AMPA的玉米饲料加标样品的代表性API4000LC/MS/MS色谱。
图31提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦的校准曲线。
图32提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦的校准曲线。
图33提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA的校准曲线。
图34提供了第2组、试验1、N-乙酰AMPA的校准曲线。
图35提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦、试剂空白试验的代表性色谱。
图36提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦、0.500ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图37提供了第2组、试验1、草甘膦、100ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图38提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦、未经处理的对照样品P1763S02-002的代表性色谱。
图39提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦、以LOQ加标的样品P1763S02-004的代表性色谱。
图40提供了第2组、试验1、葡萄、草甘膦、以4×LOQ加标的样品P1763S02-009的代表性色谱。
图41提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、试剂空白试验的代表性色谱。
图42提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、0.500ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图43提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、100ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图44提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、未经处理的对照样品P1763S02-002的代表性色谱。
图45提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、以LOQ加标的样品P1763S02-004的代表性色谱。
图46提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰草甘膦、以4×LOQ加标的样品P1763S02-009的代表性色谱。
图47提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、试剂空白试验的代表性色谱。
图48提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、0.500ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图49提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、100ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图50提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、未经处理的对照样品样品P1763S02-002的代表性色谱。
图51提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、以LOQ加标的样品P1763S02-004的代表性色谱。
图52提供了第2组、试验1、葡萄、AMPA、以4×LOQ加标的样品P1763S02-009的代表性色谱。
图53提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、试剂空白试验的代表性色谱。
图54提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、0.500ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图55提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、100ng/ml校准用标准物的代表性色谱。
图56提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、未经处理的对照样品样品P1763S02-002的代表性色谱。
图57提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、以LOQ加标的样品P1763S02-004的代表性色谱。
图58提供了第2组、试验1、葡萄、N-乙酰AMPA、以4×LOQ加标的样品P1763S02-009的代表性色谱。
图59提供了代表性的N-乙酰草甘膦质谱。
图60提供了代表性的草甘膦质谱。
图61提供了代表性的AMPA质谱。
图62提供了代表性的N-乙酰AMPA质谱。
图63提供了代表性的校准曲线。
图64提供了代表性的校准用标准色谱。
图65提供了代表性的乳(milk)色谱。
图66提供了代表性的蛋样品色谱。
图67A、B和C提供了代表性的小鸡肌肉样品色谱。
图68提供了代表性的小鸡肝脏样品色谱。
图69提供了代表性的小鸡脂肪样品色谱。
图70提供了代表性的母牛肌肉样品色谱。
图71提供了代表性的母牛肝脏样品色谱。
图72提供了代表性的母牛肾脏样品色谱。
图73提供了代表性的母牛脂肪样品色谱。
图74显示出草甘膦1，2-13C2 15N和AMPA 13C 15N标准物的同位素纯度评价。对于草甘膦1，2-13C2 15N标准物观察到的草甘膦杂质(面积70)表示70×100/200552＝0.03％的杂质。对于AMPA 13C 15N标准物观察到的AMPA杂质(面积624)表示624×100/42461＝1.5％的杂质。
图75提供乳基质的信噪比和LOD测定。
图76提供蛋基质的信噪比和LOD测定。
图77提供肝基质的信噪比和LOD测定。
图78提供肾基质的信噪比和LOD测定。
图79提供脂肪基质的信噪比和LOD测定。
图80提供肌肉基质的信噪比和LOD测定。
发明详述 现在，将参考附图，对目前公开的主题在下文中进行更充分地描述，在这些附图中，目前公开的主题的一些然而并非全部实施方式得以显示。实际上，目前公开的主题可以以许多不同的形式实施，且不应该被理解为限于在本文中阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式，以便本公开内容满足适用的法律要求。在全文中，同样的数字指同样的要素。
在受益于上文描述和相关附图中给出的教导的情况下，目前公开的主题所属的领域的技术人员将想到本文阐述的目前公开的主题的许多改变及其他实施方式。因此，可以理解目前公开的主题不限于所公开的具体实施方式
，并且改变及其它实施方式意图包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用的具体的术语，但它们仅以一般性和描述性的意义加以使用而不为了限制的目的。
I.概述 本发明提供允许确定草甘膦及其代谢物和/或降解残余物在各种测试基质中的存在或含量的方法和组合物。对于植物中的草甘膦和AMPA的分析而言存在分析方法。参见例如 Cowell et al.(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960；Alferness et al.(April 3，1993)“TouchdownDetermination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Corn Grain，CornForage，and Corn Fodder by Gas Chromatography and Mass-Selective Detection.”Zeneca Ag Products Analytical Method RR 92-042B，可在U.S.EPA PesticidesAnalytical Methods & Procedures站点(www.epa.gov/oppbead1/methods/ram12b.htm)获得；以及Method No.405in Manual of Pesticide Residue Analysis Volume I and II available fromBfR Federal Institure for Risk Assessment，official analytical methods forresidues of plant protection products and pesticides(L 00.00 16)(www.bfr.bund.de/cd/1652)。这样的方法仅仅分析草甘膦和AMPA，而对于检测则进一步要求衍生化分析物。本发明的方法和组合物允许检测和/或定量新的glyat代谢物、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA，并且进一步提供了使用LC/MS/MS技术而无需衍生化分析物来定量和确证分析草甘膦和相应的代谢物的联合、高度特异的残余法(residuemethod)。进一步提供的是从各种代谢物例如从AMPA纯化草甘膦的新方法。而且，本发明的方法和组合物通过使用弱的离子对试剂(例如磷酸)来制备用于LC/MS/MS技术的最终样品和标准溶液，进一步提高检测草甘膦和/或它的代谢物的总响应和线性。此外，所述方法可以使用提取法，其利用允许可接受的分析物提取效率的含水甲醇/稀酸溶液，并且所述方法可以进一步使用阳离子模式的质谱法。最终，用于草甘膦和AMPA的市售稳定同位素可被用于本发明的方法和组合物，作为用于基体效应归一化LC/MS/MS响应的内标。从而，本发明的新的方法和组合物提供草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的有效的定量分析而无基体效应。
如本文所使用，目标分析物包括草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的至少一种。如本文所使用，术语“草甘膦”或“N-(膦酰甲基)甘氨酸”是指具有如下所述的式(I)的化合物。

术语“N-乙酰草甘膦”或“N-乙酰-N-(膦酰甲基)甘氨酸”是指具有如下所述的式(II)的化合物。


酸游离形式 术语“AMPA”或“氨甲基膦酸”或“1-氨甲基膦酸”是指具有如下所述的式(III)的化合物。

术语“N-乙酰AMPA”或“(乙酰氨基甲基)膦酸”或“N-乙酰氨基甲基膦酸”是指具有如下所述的式(IV)的化合物。


(游离酸) 从而，提供了检测测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的存在或含量的各种方法和组合物。本发明的方法和组合物可用于监测各种测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的水平，其中所述测试样品包括农作物、农作物粗农产品和农作物加工部分(process fraction)。
II.确定测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一种的存在或含量。
提供确定N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA在测试样品中的存在或含量的方法和组合物。所述方法包括提供怀疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的测试样品，从该测试样品提取包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的组合物；和检测该提取物中的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。
进一步提供了确定测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它们的代谢物的至少一种的存在或含量的方法和组合物。所述方法包括提供怀疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它们的代谢物的至少一种的测试样品，从该测试样品提取包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它们的代谢物的至少一种的组合物；和检测该提取物中的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它们的代谢物的至少一种，其中在具体实施方式
中，草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的检测在没有衍生化草甘膦、N-乙酰草甘膦N-乙酰AMPA和/或AMPA的情况下进行。在各测试的基质中，这样的方法具有0.050mg/kg(ppm)或0.025mg/kg(取决于样品基质)的目标分析物的目标定量限(LOQ)并且在0.050mg/kgg和0.50mg/kg下确认。
如本文所使用，“测试样品”可以包括可包含一种或多种感兴趣的靶分析物的任何样品。在一些实施方式中，测试样品包括生物样品或环境样品。因此，测试样品可以来自于动物(例如哺乳动物，包括但不限于农业动物、家畜、狗、猫、马、人等等)。在其它实施方式中，测试样品不是细菌，例如大肠杆菌(E.coli.)。在其它实施方式中，测试样品来自于植物。
如本文所使用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从其可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、外植体、植物组织、饲料、稿秆、干草、外皮、粗渣、和在植物或植物部分中完整的植物细胞，其中所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等等。谷粒意图是指通过商业生长物产生的用于除了生长或繁殖该物种之外的目的的成熟种子。因此，来自植物的样品可以源自于该植物的任何一个部分或多个部分。
来源于植物的测试样品可以进一步包括粗农产品(RAC)或可包括在植物或其部分的制造期间获得的样品。示例性的玉米RAC包括例如饲料、谷粒和稿秆，而示例性的大豆RAC包括例如饲料、种子和外皮。在其它实施方式中，测试样品包括农作物加工部分，其包括固体加工部分或粗粉加工部分。另外的测试样品可以包括面粉、淀粉、粗渣、油、成品油、或从植物获得的粗粉。示例性的玉米加工部分包括面粉、粗渣、粗粉和淀粉。示例性的大豆加工部分包括粗粉和外皮。在一个实施方式中，测试样品源自于表达草甘膦乙酰转移酶(GLYAT)多肽的植物。参见，例如WO 02/36782、WO 2005/012515、美国申请公布第2004/0082770号和美国申请第11/507,751号，它们都通过引用并入本文。
在具体实施方式
，测试样品包括来自植物的固体基质部分。如本文所使用，术语“固体基质样品”是指固态的任何基质，例如但不限于面粉、粗渣、粗粉、淀粉、组织等等。
测试样品可以从任何植物种获得，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物或者水性农作物(watery crops)或酸性农作物(acid crops)。感兴趣的植物物种(species)的实例包括但是不限于玉米(corn)(玉蜀黍(Zeamays)，本文也称为“玉米(maize)”)、芸苔属各种(Brassica spp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))、尤其是可用作种子油来源(也称为油菜)的芸苔属各种(Brassica)、亚麻(亚麻属各种(Limum spp.))、紫花苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))、稻(水稻(Oryza sativa))、黑麦(黑麦(Secale cereale))、高粱(双色高粱(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如，黑黍(紫御谷(Pennisetumglaucum))、黍子(黍(Panicum miliaceum))、粟(小米(Setaria italica))、穇子(finger millet)(穇子(Eleusine coracana))、向日葵(葵花(Helianthusannuus))、红花(红花(Carthamus tinctorius))、小麦(小麦(Triticumaestivum))、大豆(大豆(Glycine max))、烟草(烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))、花生(花生(Arachis hypogaea))、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡属各种(Coffea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、菠萝(菠萝(Ananascomosus))、柠檬树(柑橘属各种(Citrus spp.))、可可(可可树属(Theobromacacao))、茶(山茶(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属各种(Musa spp.))、鳄梨(鳄梨(Persea americana))、无花果(无花果(Ficus casica))、石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(芒果(Mangifera indica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、番木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(腰果(Anacardium occidentale))、坚果(坚果(Macadamia integrifolia))、杏仁(扁桃(Prunus amygdalus))、甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(蔗属各种(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、水果、观赏植物(花)、甘蔗、针叶树、拟南芥属(Arabidopsis)。
蔬菜包括番茄(番茄(Lycopersicon esculentum))、莴苣(例如山莴苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(利马豆(Phaseolus limensis))、豌豆(山黧豆属各种(Lathyrus spp.))和香瓜属(Cucumis)的成员例如黄瓜(黄瓜(C.sativus))、罗马甜瓜(硬皮甜瓜(C.cantalupensis))和香瓜(香瓜(C.melo))。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属各种(Rhododendron spp.))、八仙花属(八仙花(Macrophylla hydrangea))、芙蓉属(芙蓉(Hibiscus rosasanensis))、玫瑰(蔷薇属各种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属各种(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属各种(Narcissus spp.))、牵牛花(牵牛花(Petunia hybrida))、康乃馨(麝香石竹(Dianthuscaryophyllus))、一品红(一品红(Euphorbia pulcherrima))和菊花。
还可以使用任何树木。可用于实施本发明的针叶树包括例如松树例如火炬松(火炬松(Pinus taeda))、湿地松(湿地松(Pinus elliotii))、西黄松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(扭叶松(Pinus contorta))和辐射松(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas fir)(花旗松(Pseudotsugamenziesii))；异叶铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(红杉(Sequoia sempervirens))；真冷杉(truefirs)例如银杉(太平洋冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(香脂冷杉(Abiesbalsamea))；和雪松例如北美香柏(美国西部侧柏(Thuja aplicata))和阿拉斯加黄色雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。阔叶树也可以被使用，其包括灰树、白杨、山毛榉、椴树、桦树、黑樱桃、黑胡桃、七叶树、美洲栗、三角叶杨、山茱萸、榆树、朴树、山核桃、冬青、洋槐、木兰、枫树、橡树、白杨、红桤木、紫荆、日本泡桐、檫树、枫香、美国梧桐、蓝果树、柳树、黄杨。
在具体实施方式
中，测试样品来自于农作物植物(例如，玉米(也称为“玉米(maize)”、紫花苜蓿、向日葵、芸苔(Brassica)、大豆、棉、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。
测试样品可源自其它感兴趣的植物，包括提供感兴趣的种子的谷物植物、含油种子植物和豆类植物。感兴趣的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉、大豆、红花、向日葵、芸苔(Brassica)、玉米、紫花苜蓿、棕榈、椰子等。豆类植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、苦豆、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
测试样品还可以源自于其它感兴趣的植物，包括草坪草，例如来自早熟禾属(Poa)、剪股草属(Agrotis)、羊茅属(Festua)、黑麦草属(Lolium)和结缕草属(Zoysia)的草坪草。另外的草坪草可以来自黍亚科。草坪草可以进一步包括但不限于格兰马草(格兰马草(Boutelouagracilis(H.B.K.)Lag.Ex Griffiths))；野牛草属(野牛草(Buchloedactyloids(Nutt.)Engelm.))；弱匍匐紫羊茅(弱匍匐紫羊茅(Festuca rubrassp.Litoralis))；紫羊茅(紫羊茅(Festuca rubra))；细弱剪股颖(细弱剪股颖(Agrostis tenuis Sibth.))；匍匐翦股颖(匍匐翦股颖(Agrostis palustrisHuds.))；扁穗冰草(扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.))；硬羊茅(硬羊茅(Festuca longifolia Thuill.))；草地早熟禾(草地早熟禾(Poapratensis L.))；黑麦草(黑麦草(Lolium perenne L.))；普通早熟禾(普通早熟禾(Poa trivialis L.))；垂穗草(垂穗草(Bouteloua curtipendula Michx.Torr.))；无芒雀麦草(无芒雀麦草(Bromus inermis Leyss.))；苇状羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea Schreb.))；早熟禾(早熟禾(Poa annua L.))；意大利黑麦草(多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam.))；小糠草(小糠草(Agrostis alba L.))；日本草坪草(日本结缕草(Zoysia japonica))；狗牙草(狗牙草(Cynodon dactylon)；百慕达草(Cynodon spp.L.C.Rich)；非洲狗牙根(Cynodon transvaalensis))；海滨雀稗(海滨雀稗(Paspalum vaginatumSwartz))；结缕草属(细叶结缕草(Zoysia spp.Willd)；日本结缕草(Zoysiajaponica)和沟叶结缕草(Z.matrella var.matrella))；百喜草(百喜草(Paspalum notatum Flugge))；地毯草(近缘地毯草(Axonopus affinisChase))；假俭草(假俭草(Eremochloa ophiuroides Munro Hack.))；隐花狼尾草(东非狼尾草(Pennisetum clandesinum Hochst Ex Chiov))；匍伏翦股颖(Browntop bent)(细弱翦股颖(Agrostis tenuis)，又名茵陈蒿(A.capillaris))；绒毛翦股颖(绒毛翦股颖(Agrostis canina))；黑麦草(黑麦草(Lolium perenne))；和钝叶草(钝叶草(Stenotaphrum secundatum Walt.Kuntze))。另外的感兴趣的草包括柳枝黍(柳枝黍(Panicum virgatum))。
在其它实施方式中，测试样品可以来自于动物。可以使用任何动物，包括例如农用牲畜诸如cops、猪、家禽(鸡、鸭等)、猪、羊等。这样的样品可源自于动物的任何部分，包括但不限于乳(全脂牛奶、脱脂乳、奶油)、蛋(整蛋、蛋黄、蛋白)、或任何肉类商品诸如肌肉、肾脏、肝脏、脂肪等等。
III.从测试样品提取草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA及其它代谢物 “提取”意图是允许将目标分析物从样品基质或者从其来源的样品移出的任何方法。如本文所使用，术语“提取”或其引申语不必须指从样品基质或从其来源的样品移出除了目标分析物(一种或多种)之外的所有材料或组分。相反，在一些实施方式中，术语“提取”是指相对于在样品基质中或在从其来源的样品中存在的一种或多种其它成分，富集一种或多种目标分析物的量的步骤。在一些实施方式中，“提取”步骤可用于除去可能干扰分析物检测的一种或多种样品成分，例如可能干扰通过质谱法检测分析物的一种或多种成分。在其它实施方式中，提取步骤用来从测试样品基质移出目标分析物，而在另外其它实施方式中，提取步骤用来将样品中的第一目标分析物与第二目标分析物纯化分离或者将目标分析物与干扰物质纯化分离。
各种提取可以用于从样品提取或纯化至少一种目标分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦)。可使用各种稀酸，包括例如包含稀甲酸溶液、稀盐酸溶液或稀磷酸溶液的溶液。在具体实施方式
中，提取使用例如包含约96％含水的0.1％甲酸/4％甲醇或者约96％含水的0.025N盐酸/4％甲醇或者在96％水/4％甲醇中的约0.1NHCL或者约0.02M磷酸的溶液。在另外其它实施方式中，提取溶液可以包括包含约0.01％至约10％甲酸、约0.01％至约1％甲酸、约0.1％至约1％甲酸、或约0.1％至约5％甲酸的稀甲酸溶液。在另外其它实施方式中，提取溶液可以包括包含约0.0025N至约0.25N盐酸、约0.025N至约0.25N盐酸、约0.0025N至约0.025N盐酸的稀盐酸溶液。在进一步的实施方式，稀磷酸溶液可以包含约0.002M至约0.2M磷酸、约0.002M至约0.02M磷酸或约2M至约0.02M磷酸。所使用的提取溶液可以根据测试样品而改变。例如，可使用稀盐酸代替甲酸来增加酸性，用于从各种基质例如玉米面粉和粗粉加工部分更有效提取N-乙酰草甘膦、草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA。可选地，稀磷酸可用于从油测试样品有效提取N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA。
在具体的实施方式中，用含水的稀酸/甲醇溶液进行提取。在进一步的实施方式，所使用的提取法足以允许从基质提取分析物的效率达到至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％99％或100％。在具体的实施方式中，各种目标分析物的提取效率通过代谢作用研究而非通过表面应用研究来建立。
可以进行多重液-液提取来从测试样品提取分析物(一种或多种)，包括1、2、3、4、5种或以上。如在实验部分中进一步详细概述的，进一步认识到，所使用的提取体积可以根据基质的含水量而改变。例如，具有较低含水量的测试样品(即稿秆、干草、壳等)可需要较大的提取溶液体积和增加的提取次数。
在稀酸提取之后，可以使用另外的提取步骤来从各种保留在样品中的污染物进一步纯化目标分析物。例如，可以进行水-有机物萃取步骤，例如稀酸/二氯甲烷分配。在这样的提取中，目标分析物保持在水相中，其接着可以施加于提取柱。在具体实施方式
中，如上所述，用于二氯甲烷提取的稀酸包括稀的甲酸溶液、稀盐酸溶液或稀的磷酸溶液。
通过使用固相提取(SPE)柱，可以从测试样品的其它成分提取或纯化一种或多种目标分析物或者使一种或多种目标分析物互相提取或纯化。如本文所使用，“提取柱”用来从非保持的材料提取保持的材料，从而允许获得“纯化”的样品，用于进一步纯化或分析。还可以使用多重提取柱，包括1、2、3、4、5种或以上。在具体的实施方式中，提取或纯化步骤包括(a)将样品布置在提取柱上；(b)在目标分析物(一种或多种)得以保持在提取柱上的条件下，洗涤提取柱；和，(c)从提取柱洗脱该保持的分析物(一种或多种)。在一些实施方式中，所使用的一种或多种提取柱是疏水性二氧化硅基键合相提取柱(hydrophobicsilica-based bonded phase extraction column)(即C-18柱)、阳离子交换提取柱(即间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，具有磺酸取代基)或阴离子交换提取柱(即间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，具有季胺取代基)或它们的组合物。在一个实施方案中，使用液-液提取、提取柱或它们的任何组合，从样品基质提取一种或多种目标分析物。
取决于所使用的测试样品和目标分析物，不同的提取柱可用于从该测试样品基质提取该目标分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦)。例如，对于固体基质样品提取物的分析，在水-有机物液-液提取之后，如上所述，疏水性二氧化硅基键合相提取柱可用于纯化草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦。在具体的实施方式中，疏水性二氧化硅基键合相提取柱包括C18提取柱。在疏水性二氧化硅基提取柱之后，可以使用另外的提取柱来进一步纯化目标分析物。
对于一些样品基质，固相提取步骤的应用可以与稀酸/甲醇提取步骤一起进行。例如，就肉商品基质而言，固相提取吸附剂(例如C18)可以被添加至匀化的组织样品。该匀化组织与固相提取吸附剂混合，并添加稀酸/甲醇溶液。可以进行洗脱和收集被固相提取吸附剂结合的分析物。
在另外其它实施方式中，对于乳和蛋商品而言，测试样品与含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)混合。然后，在离心后添加己烷。然后，对水层进行二氯甲烷提取。然后进行两次另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)提取。
在具体的实施方式中，在从提取的测试样品色谱分离目标分析物之前，将足够的浓度的弱离子配偶(pairing)试剂添加至提取物。弱离子配偶试剂的足够浓度是允许草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的响应和线性改善的浓度。在具体的实施方式中，弱离子配偶试剂是磷酸。在具体的实施方式中，最终提取物在含水0.02M磷酸中制备并在LC/MS/MS分析之前进行过滤。草甘膦和AMPA稳定同位素可以被添加至最终提取溶液，作为对于基体效应进行归一化的内标。
i.从固体基质或动物商品提取AMPA 在具体实施方式
中，通过将疏水二氧化硅基提取柱洗脱物布置在阳离子交换提取柱上，处理来自疏水二氧化硅基提取柱的一部分洗脱物，用于AMPA的分析。在具体实施方式
中，阳离子交换提取柱具有包括具有磺酸取代基的间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物的表面官能度。可使用的阳离子交换提取柱的非限制性实例包括MCX SPE柱(Waters Oasis)。如本文别处进一步详细概述的，可用各种方法将疏水二氧化硅基提取柱的洗脱物布置在阳离子交换提取柱上。
因此，从固体样品基质提取或纯化AMPA的方法可以包括(a)通过液-液提取从测试样品提取包含AMPA的组合物；(b)将该包含步骤(a)的AMPA的组合物布置在疏水性二氧化硅基键合相提取柱上；(c)从步骤(b)的提取柱获得包含AMPA的洗脱物；(d)将该包含步骤(c)的洗脱物布置在阳离子交换柱上；(e)在AMPA得以保持在该提取柱上的条件下，洗涤该提取柱；和，(f)从该阳离子交换提取柱洗脱保持的AMPA。在具体实施方式
中，从固体基质样品提取AMPA包括在二氯甲烷分配之后进行稀酸提取。
在一个非限制性实施方式中，测试样品提取如下进行。使用探针匀化器(probe homogenizer)，将AMPA从植物固体基质提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N盐酸)/甲醇(96/4)中。对于目标分析物的定量回收，进行多次提取(1、2、3、4次或以上)。过滤的含水部分的一部分用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并过滤除去微粒。然后，一部分提取物通过C18固相提取(SPE)柱体进行过滤。一部分从C18 SPE柱体收集的洗脱物被稀释并施加于阳离子交换OasisTM MCX SPE柱体、稀释并过滤。
在另一个非限制实施方式中，测试样品包括肉组织商品，并且如下进行提取。如下从肉组织商品提取AMPA(a)匀化该组织；(b)将固相提取吸附剂例如C18添加到该匀化的组织；(c)添加在96％水/4％甲醇中的0.1N HCL；(d)离心样品并且收集C18颗粒；(e)用水从该固相提取吸附剂洗脱分析物。然后，将一部分洗脱物施加于阳离子OasisTM MCXSPE柱体。
在另一个非限制实施方式中，测试样品包括乳或蛋商品，并且如下进行提取。将含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)溶液添加至该样品。进行己烷提取。对水层进行二氯甲烷提取。对水层进行额外的甲酸/甲醇提取(至少1、2、3次或以上)。然后，将一部分洗脱物施加于阳离子OasisTM MCS SPE柱体。
ii.从固体基质或动物商品提取草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦 在其它实施方式中，处理一部分来自疏水二氧化硅基提取柱的洗脱物，用于分析来自固体基质的草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。在具体实施方式
中，将一部分的该疏水二氧化硅基提取洗脱物布置在阴离子交换提取柱上。该阴离子交换提取柱可以包括表面官能度，所述表面官能度包括具有季胺取代基的间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物。这样的阴离子交换提取柱的非限制性实例包括MAXSPE柱。如本文别处进一步详细概述的，可用各种方法将疏水二氧化硅基提取柱的洗脱物布置在阴离子交换提取柱上。简言之，对于玉米、大豆饲料和干草基质，在于甲醇中提取(调节至基本pH)之后，可以使用具有季胺取代基的间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物提取柱。在其它方法中，对于大豆种子、粗粉和壳基质的分析，在提取物于水中稀释步骤之后，可以使用具有季胺取代基的间二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物提取柱。
因此，从植物固体样品基质提取或纯化草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的方法可以包括(a)通过液-液提取从测试样品提取包含草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的组合物；(b)将该包含步骤(a)的AMPA的组合物布置在疏水性二氧化硅基键合相提取柱上；(c)从步骤(b)的提取柱获得包含草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的洗脱物；(d)将该包含步骤(c)的洗脱物布置在阴离子交换柱上；(e)在草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦得以保持在该提取柱上的条件下，洗涤该提取柱；和，(f)从该提取柱洗脱保持的草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。在具体实施方式
中，在二氯甲烷分配之后从固体基质样品进行草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的水提取。
在一个非限制性实施方式中，测试样品提取如下进行。使用探针匀化器，将草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦从植物固体基质或者乳或蛋商品提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N盐酸)/甲醇(96/4)中。对于分析物的定量回收，进行多次提取(1、2、3、4次或以上)。当使用植物固体基质样品提取物时，一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并过滤除去微粒。当使用蛋或乳商品时，在二氯甲烷提取之前可以进行己烷提取。然后，一部分提取物通过C18固相提取(SPE)柱体进行过滤。一部分从C18SPE收集的洗脱物被稀释并施加于阴离子交换OasisTM MAX SPE柱体。在几次溶液漂洗后，用在甲醇水(9/1)溶液中的1％三氟乙酸从MAX柱体洗脱分析物。将MAX洗脱物蒸发至干燥并且再溶解于含水0.02M磷酸水溶液、过滤并分析草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。对于分配之后大豆样品(即种子和粗粉)的分析，可在蒸汽浴中将提取物样品加热大约15分钟，以在微粒过滤之前沉淀提取物中的其它物质。
在另一个非限制性实施方式中，测试样品包括肉商品，并且如下进行样品提取。通过匀化该组织以及随后添加固相提取吸附剂例如C18，从肉商品提取草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。将在96％水/4％甲醇中的0.1N HCL添加至该样品。离心该样品，并除去上清液。通过将水添加到颗粒，从固相提取吸附剂洗脱分析物。将TEA添加至该样品，之后进行乙腈提取。然后，将样品载荷在OasisTM MAXSPE柱体上。洗涤该柱，并且使用在甲醇水(90/10)中的1％TFA从该柱洗脱分析物。将MAX洗脱物蒸发至干燥并再溶解于含水0.02M磷酸水溶液。
iii.从油样品提取草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA 在另外其它实施方式中，当测试样品包括油样品时，可用单一步骤提取和纯化所有的目标分析物(草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA)。在这样的实施方式中，不需要使用提取柱。例如，测试样品可以经历一系列水-有机物萃取，例如采用稀酸或弱离子对试剂(例如0.02M磷酸)和二氯甲烷。在足够次数的提取之后，含水部分可用于目标分析物的检测。对于分析物的定量转移，可以重复提取2、3、4、5次或以上。在每次分配之后，离心可用于界定相分离。
因此，提供了从油样品基质提取或纯化草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的方法，其包括(a)进行测试样品的水-有机物提取，包括将足够浓度的弱离子对试剂或稀酸例如磷酸添加至该测试样品，其中该足够浓度的弱离子对试剂或稀酸允许改善草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的响应和线性；和，(ii)添加有机溶剂；(b)从该水-有机物分配的水相提取目标分析物；和，(c)重复步骤(a)和/或步骤(b)的任何一个足够的次数，以允许分析物的定量转移。在具体的实施方式中，水-有机物提取包括磷酸/二氯甲烷分配。
IV.确定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA及其他在测试样品中的存在或含量。
在从测试样品提取一种或多种目标分析物之后，可以使用允许检测一种或多种所述目标分析物的任何方法。在一个实施方案中，检测一种或多种目标分析物包括从提取的测试样品分离(在具体实施方式
中，色谱法分离)至少一种目标分析物并研究色谱法分离的分析物的至少一种以确定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的至少一种在测试样品中的存在或含量。
i.从提取的测试样品分离草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的至少一种 如本文所使用，“色谱法分离”使用“分析柱”或“色谱柱”，其具有足以实现测试样品基质成分的分离的色谱板。优选地，从分析柱洗脱的成分以这样的方式进行分离，其使得目标分析物(一种或多种)的存在或含量得以确定。“分析柱”可与“提取柱”不同，其中“提取柱”一般用来从非保持的材料纯化或提取保持的材料，从而获得“纯化”的样品，用于进一步纯化或分析。
在具体实施方式
中，目标分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦)的每一种可在检测之前彼此进行色谱法分离。然而，认识到，取决于所使用的检测方法，可以不必须分离通过色谱法彼此分离每一目标分析物。当作为混合物存在时，这样的检测方法允许每一目标分析物得到检测。
在具体实施方式
中，在上文的进一步详细描述的提取步骤之后，色谱法分离目标分析物包括(a)将包含提取的分析物(一种或多种)的组合物布置在分析柱上；和(b)从分析柱洗脱分析物(一种或多种)。在一个实施方案中，对目标分析物彼此或测试样品的其它组分进行色谱法分离，包括使用高效液相色谱(HPLC)柱。可以使用可充分解析目标分析物并允许它们的检测和/或定量的任何HPLC柱。在具体实施方式
中，HPLC柱包括使用己基烷基连接体(hexyle alkyl linker)的苯相(phenyl phase)。
ii.检测草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA及其它代谢物 “检测”意图确定目标分析物(即草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA)在测试样品中的存在或含量。所述检测方法不被限制并可以是定性或定量的。在一个实施方案中，检测草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA包括通过质谱仪分析色谱法分离的分析物。在一些非限制性实施方式中，分离和/或检测并不需要衍生化所述目标分析物。在具体实施方式
中，进行正离子质谱法来检测目标分析物。
本文中所用的术语“质谱法”或“MS”通常指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。在MS技术中，一种或多种目标分子被离子化，并且离子接着被引入质谱仪，在那里，由于磁场和电场的组合，离子沿着空间中取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径行走。见例如美国专利第6,107,623号，名称为“Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry”，通过引用由此并入其全部内容。
在“四极”或“四极离子阱”质谱仪中，振荡射频(RF)场中的离子经历与在电极之间施加的直流(DC)电势、射频信号的振幅和m/z成比例的力。可以选择电压和振幅，以便仅具有特定m/z的离子移动四极的长度，而全部其它离子偏转。因此，四极仪器可以作为注入到所述仪器的离子的“滤质器”和“质量检测器″。
进一步地，MS技术的分辨率可以通过使用“串联质谱”或“MS/MS”加以提高。串联质谱法(MS/MS)是给予一组质谱法的名称，其中从样品产生的“母(parent)”离子被裂解而产生“子”离子，接着“子(daughter)”离子通过第二MS步骤进行质量分析。MS/MS方法可用于复杂混合物的分析，尤其是生物样品，部分是因为MS/MS的特异性可以最小化在质谱分析之前对大规模样品净化的需要。在MS/MS方法的实例中，母离子从样品产生并通过第一滤质器(mass fiter)，以选择具有特定质荷比的那些离子。然后，这些离子被断裂，一般通过在适当的离子碰撞单元中用中性气体分子碰撞进行，以产生子离子，其质谱通过第二质量分析器记录。如此生成的子离子光谱指示母离子的结构，并且该两个阶段的质量过滤可以从存在于复杂混合物的传统质谱中的干扰物质除去离子。
最常见类型的MS/MS仪器是三重四极型(triple quadrupole)(参见，例如Yost，Enke in Ch.8of Tandem Mass Spectrometry，Ed.McLafferty，pub.John Wiley and Sons，1983)。三重四极MS/MS仪器一般由通过断裂元件(即碰撞单元)分开的两个四极滤质器组成，(通常四极滤质器在仅RF模式(RF only mode)下作为离子容纳装置进行操作并含有压力在1和10毫托之间的碰撞气体)。许多其它类型“混合”串联质谱仪是已知的，尽管，包括扇形磁场分析器和四极过滤器的各种组合。这些混合仪器经常包括高分辨率扇形磁场分析器(即，包括以双聚焦组合排列的磁性和静电扇形两者的分析器)作为任一个或两个滤质器。高分辨率滤质器的使用在将化学噪音降低至极低水平方面卓有成效。
如本文所使用，术语“电子电离”是指其中在气相或蒸气相中的一种或多种目标分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物(一种或多种)的撞击产生分析物离子，其然后经受质谱法技术。
如本文所使用，术语“化学电离”是指其中试剂气体(例如氨)经受电子撞击并且通过试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成分析物离子的方法。
如本文所使用，术语“快原子轰击”是指其中高能原子(通常为Xe或Ar)束撞击非挥发性测试样品而释放出并电离包含于样品中的分子。样品溶于粘性液体基质，例如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品的适当基质的选择是一种经验过程。
如本文所使用，术语“场致解吸(field desorption)”是指其中非挥发性测试样品被置于电离表面并且强电场被用于产生分析物离子的方法。
如本文所使用，术语“基质辅助激光解吸离子化”或“MALDI”是指其中非挥发性样品暴露于激光辐照的方法，其通过各种电离通道，包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和簇衰变(cluster decay)，解吸出并电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，所述能量吸收基质促进分析物分子的解吸。
如本文所使用，术语“表面增强激光解吸离子化”或“SELDI”是指其中非挥发性样品暴露于激光辐照的另一种方法，其通过各种电离通道，包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和簇衰变，解吸出并电离样品中的分析物。对于SELDI，样品一般结合于优先保持一种或多种目标分析物的表面。当在MALDI中，该过程也可使用能量吸收材料来促进离子化。
如本文所使用，术语“电喷射离子化作用”或“ESI”是指其中溶液沿着短长度的毛细管通过的方法，向该毛细管的末端施加高的正或负电势。到达该管末端的溶液被汽化(使成雾状)成在溶剂蒸汽中具有微细小滴的射流或喷雾。该小滴的雾流经蒸发室，该蒸发室被稍微加热，以防止冷凝和汽化溶剂。当小滴变得更小时，电表面电荷密度增加，直到同性电荷之间的自然排斥使得离子以及中性分子得以释放的时侯。
如本文所使用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱法；然而，APCI通过在大气压下发生于等离子区中的离子-分子反应而产生离子。等离子区通过在喷雾毛细管和反电极之间的放电而得以保持。然后，通常利用一组差动泵撇取器站(differentiallypumped skimmer stages)将离子提取入质量分析器。干燥和预热的N2气体逆流可用来改善溶剂的去除。对于分析极性较低的种类，APCI中的气-相离子化可以比ESI更有效。
如本文所使用，术语“大气压光致电离”(“APPI”)是指质谱法的形式，其中分子M的光致电离的机理是光子吸收和电子发射，形成分子M+。因为光子能量通常恰在电离电势之上，所以该分子离子较不易于解离。在很多情况下，在不需要色谱法的情况下分析样品可以是可能的，因此节约大量的时间和费用。在存在水汽或质子溶剂的情况下，该分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有高质子亲和力，这易于发生。这并未影响定量准确性，这是因为M+和MH+的和是常数。在质子溶剂中的药物化合物通常作为MH+被观察到，而非极性化合物例如萘或睾酮通常形成M+。Robb，D.B.，Covey，T.R.和Bruins，A.P(2000)参见，例如Robb等，Atmospheric pressurephotoionizationAn ionization method for liquid chromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15)3653-3659。
如本文所使用，术语“感应耦合等离子体”是指其中样品在足以和离子化大多数元素的高温下，与部分电离的气体相互作用的方法。
如本文所使用，术语“离子化”和“电离”是指产生净电荷等于一个或多个电子单位的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。
如本文所使用，术语“解吸”是指从表面和/或分析物进入气相的入口处分析物的去除。
在其中先驱离子被分离以进一步裂解的那些实施方式中，例如MS/MS，碰撞诱导解离(“CID”)经常被用于产生碎片离子，用于进一步检测。在CID中，先驱离子通过与惰性气体碰撞获得能量，接着通过称为“单分子分解”的过程而裂解。必须在先驱离子中存储足够的能量，以便该离子内的某些键可以由于振动能增加而断裂。
在一些实施方式中，纯化或分离步骤的一个或多个“流线(online)”进行。如本文所使用，术语“流线”是指纯化或分离步骤以这样的方式进行，测试样品被布置入(例如注入)这样的系统中，其中该系统的各个部件在操作上连接，并且在一些实施方式中，彼此流体连通。这样的流线系统的代表性部件包括但不限于自动进样器；一个或多个注射口；一个或多个柱，包括但不限于提取柱，包括提取柱，并且在一些实施方式中，包括分析柱；检测系统，例如质谱仪系统；一个或多个泵；一个或多个阀；和必要的铅锤。在这样的“流线”系统中，测试样品和/或目标分析物可以从该系统的一个部件通过到达另一个部件，而不需要退出该系统，例如，不需要必须进行收集然后布置入该系统的另一个部件。
在一些实施方式中，流线纯化或分离方法可以被自动化。在这样的实施方式中，一旦过程被被建立并开始，则所述步骤可以在不需要操作员干预的情况下进行。本领域普通技术人员还将理解，流线自动化步骤可以包括利用控制所述系统各个部件——包括泵、阀、自动进样器等等——的软件。这样的软件可用于通过样品溶质添加和流速的精确计时来优化提取工艺。
相比之下，术语“离线(offline)”是指纯化、分离或提取步骤与随后的纯化或分离步骤和/或分析步骤分开进行。在这样的离线步骤中，目标分析物通常例如在提取柱上或通过液-液提取法与样品基质中的其它成分分离，然后进行收集，以接着引入另一个色谱系统或检测器系统。就操作员而言，离线步骤通常需要人工干预。
V.本发明的
具体实施例方式 在非限制性实施方式中，确定N-乙酰草甘膦在测试样品中的存在或含量包括(a)提供怀疑包含N-乙酰草甘膦的测试样品；(b)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含N-乙酰草甘膦的组合物；(c)将步骤(b)的包含N-乙酰草甘膦的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱N-乙酰草甘膦；(d)将从步骤(c)洗脱的N-乙酰草甘膦布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱N-乙酰草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足够浓度的磷酸至步骤(d)所述的洗脱的N-乙酰草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰草甘膦的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(f)使用苯基-己基高效液相色谱(HPLC)分析柱，色谱法分离N-乙酰草甘膦与步骤(e)的组合物中的其它组分；和(g)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(f)的色谱法分离的样品，以确定N-乙酰草甘膦在所述测试样品中的存在或含量。在具体实施方式
中，液-液提取法包括稀酸和二氯甲烷提取。在进一步的实施方式中，测试样品包括来自植物的固体基质样品或者是乳或蛋商品。
在非限制性实施方式中，确定N-乙酰草甘膦在测试样品中的存在或含量包括(a)提供怀疑包含N-乙酰草甘膦的测试样品；(b)将所述测试样品与固相提取吸附剂在允许所述固相提取吸附剂结合N-乙酰草甘膦的条件下混合；(c)通过液-液提取法，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的N-乙酰草甘膦；(d)从所述固相提取吸附剂洗脱所述N-乙酰草甘膦；(e)通过液-液提取法从步骤(d)的洗脱物提取包含N-乙酰草甘膦的组合物；(f)将从步骤(e)洗脱的N-乙酰草甘膦布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱N-乙酰草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足够浓度的磷酸至步骤(f)所述的洗脱的N-乙酰草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰草甘膦的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(h)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离N-乙酰草甘膦与步骤(g)的组合物中的其它组分；和(i)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(h)的色谱法分离的样品，以确定N-乙酰草甘膦在所述测试样品中的存在或含量。在具体实施方式
中，步骤(c)的液-液提取法包括稀酸和甲醇提取。在进一步的实施方式，测试样品包含肉组织商品。
在其它非限制性实施方式中，确定草甘膦在测试样品中的存在或含量的方法包括(a)提供怀疑包含草甘膦的测试样品；(b)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含草甘膦的组合物；(c)将步骤(b)的包含草甘膦的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱草甘膦；(d)将从步骤(c)洗脱的草甘膦布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足够浓度的磷酸至步骤(d)所述的洗脱的草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间改善草甘膦的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(f)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)柱，色谱法分离草甘膦与步骤(e)的其它组分；和(g)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(f)的色谱法分离的样品，以确定草甘膦在所述测试样品中的存在或含量；其中所述草甘膦的检测在没有衍生化所述草甘膦的情况下进行。在具体实施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在进一步的实施方式中，测试样品包括来自植物或者蛋或乳商品的固体基质样品。
在非限制性实施方式中，确定草甘膦在测试样品中的存在或含量包括(a)提供怀疑包含草甘膦的测试样品；(b)将所述测试样品与固相提取吸附剂在允许所述固相提取吸附剂结合草甘膦的条件下混合；(c)通过液-液提取法，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的草甘膦；(d)从所述固相提取吸附剂洗脱所述草甘膦；(e)通过液-液提取法从步骤(d)的洗脱物提取包含草甘膦的组合物；(f)将从步骤(e)洗脱的草甘膦布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足够浓度的磷酸至步骤(f)所述的洗脱的草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间改善草甘膦的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(h)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离草甘膦与步骤(g)的组合物中的其它组分；和(i)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(h)的色谱法分离的样品，以确定草甘膦在所述测试样品中的存在或含量。在具体实施方式
中，步骤(c)的液-液提取法包括稀酸和甲醇提取。在进一步的实施方式，测试样品包含肉组织商品。
在其它非限制性实施方式中，确定氨甲基膦酸在测试样品中的存在或含量的方法包括(a)提供怀疑包含AMPA的测试样品；(b)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含AMPA的组合物；(c)将步骤(b)的包含AMPA的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱AMPA；(d)将从步骤(c)洗脱的AMPA布置在阳离子交换柱上，并从那里洗脱AMPA，其中所述阳离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含磺酸取代基的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足够浓度的磷酸至步骤(d)所述的洗脱物AMPA，其中所述足够浓度允许在检测期间AMPA的响应和线性改善或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(f)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离AMPA与步骤(e)的其它组分；和(g)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(f)的色谱法分离的样品，以确定AMPA在所述测试样品中的存在或含量；其中所述AMPA的检测在没有衍生化所述AMPA的情况下进行。在具体实施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在进一步的实施方式中，测试样品包括来自植物或者乳或蛋商品的固体基质样品。
在另一个非限制性实施方式中，确定氨甲基膦酸(AMPA)在测试样品中的存在或含量的方法包括(a)提供怀疑包含AMPA的测试样品；(b)将所述测试样品与固相提取吸附剂在允许所述固相提取吸附剂结合AMPA的条件下混合；(c)通过液-液提取法，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的AMPA；(d)从所述固相提取吸附剂洗脱所述AMPA；(e)将从步骤(d)洗脱的AMPA布置在阳离子交换柱上，并从那里洗脱AMPA，其中所述阳离子交换柱包括这样的官能表面，其具有含磺酸取代基的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(f)添加足够浓度的磷酸至步骤(d)所述的洗脱的AMPA，其中所述足够浓度允许在检测期间AMPA的响应和线性改善；(g)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离AMPA与步骤(f)的洗脱物中的其它组分；和(h)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(g)的色谱法分离的样品，以确定AMPA在所述测试样品中的存在或含量。在进一步的实施方式，测试样品包含肉组织商品。
在其它非限制性实施方式中，确定N-乙酰AMPA在测试样品中的存在或含量的方法包括(a)提供怀疑包含N-乙酰AMPA的测试样品；(b)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含N-乙酰AMPA的组合物；(c)将步骤(b)的包含N-乙酰AMPA的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱N-乙酰AMPA；(d)将从步骤(c)洗脱的N-乙酰AMPA布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱N-乙酰AMPA，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季胺的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足够浓度的磷酸至步骤(d)所述的洗脱的N-乙酰AMPA，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰AMPA的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(f)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离N-乙酰AMPA与步骤(e)的其它组分；和(g)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(f)的色谱法分离的样品，以确定N-乙酰AMPA在所述测试样品中的存在或含量。在具体实施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在进一步的实施方式中，测试样品包括来自植物或者乳或蛋商品的固体基质样品。
在非限制性实施方式中，确定N-乙酰AMPA在测试样品中的存在或含量包括(a)提供怀疑包含N-乙酰AMPA的测试样品；(b)将所述测试样品与固相提取吸附剂在允许所述固相提取吸附剂结合N-乙酰AMPA的条件下混合；(c)通过液-液提取法，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的N-乙酰AMPA；(d)从所述固相提取吸附剂洗脱所述N-乙酰AMPA；(e)通过液-液提取法从步骤(d)的包含N-乙酰AMPA的组合物提取包含N-乙酰AMPA的组合物；(f)将从步骤(e)洗脱的N-乙酰AMPA布置在阴离子交换柱上，并从那里洗脱N-乙酰AMPA，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足够浓度的磷酸至步骤(f)所述的洗脱的N-乙酰AMPA，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰AMPA的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(h)使用苯基-己基高效液相色谱法(HPLC)分析柱，色谱法分离N-乙酰AMPA与步骤(g)的组合物中的其它组分；和(i)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(h)的色谱法分离的样品，以确定N-乙酰AMPA在所述测试样品中的存在或含量。在具体实施方式
中，液-液提取法包括稀酸和二氯甲烷提取。在进一步的实施方式，测试样品包含肉组织商品。
在其它非限制性实施方式中，确定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一种在测试样品中的存在或含量的方法包括(a)提供怀疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一种的测试样品；(b)添加足够浓度的磷酸至(a)的测试样品，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰草甘膦、AMPA、草甘膦或N-乙酰AMPA的响应和线性或者其中所述足够浓度包括约0.02M磷酸的最终浓度；(c)通过水-有机物萃取从所述测试样品提取包含AMPA、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或草甘膦的至少一种的组合物；(d)使用高效液相色谱法(HPLC)柱，包括苯基-己基分析柱，色谱法分离步骤(c)的AMPA、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或草甘膦的至少一种；和(e)通过以电喷射离子化作用模式操作的串联四极质谱仪分析AMPA、草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的至少一种在所述测试样品中的存在或含量。
在其它非限制实施方式，提供了从AMPA纯化草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的方法。所述方法包括(a)提供怀疑包含草甘膦、N-乙酰AMPA、N-乙酰草甘膦或AMPA的至少一种的测试样品；(b)从所述测试样品提取包含N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的组合物；(c)将步骤(b)的组合物布置在阴离子交换提取柱上并从那里洗脱N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和草甘膦的至少一种，从而从AMPA纯化草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦；或者，将步骤(b)的组合物布置在阳离子交换提取柱上并从那里洗脱AMPA，从而从AMPA纯化草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦。
实验 实施例1 在一个实施方案中，开发出测定转基因农作物和农作物部分(fraction)基质中草甘膦和相关代谢物或降解残余物的分析法。草甘膦代谢物或分析物是N-乙酰草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)和N-乙酰AMPA。N-乙酰草甘膦是与包含草甘膦N-乙酰转移酶(glyat)的转基因农作物有关的代谢物。在每种检验的基质中方法目标定量限(LOQ)是0.050mg/kg(ppm)。在正离子模式检测中，使用电雾化接口(ESI)操作的LC/MS/MS系统，在0.050mg/kg和0.50mg/kg下验证所述方法。该分析法被开发来支持基因改造农作物的注册所需的残余物数据收集。
来源于表达GLYAT的植物的粗农产品和固体加工部分产品在酸性(0.1％甲酸或0.025N盐酸)水/甲醇(96/4)溶液中提取3次。一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并过滤。一部分含水部分通过C18SPE柱体进行过滤。一部分来自C18SPE的洗脱物被稀释并施加于MAX SPE柱体。在几次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(9/1)溶液中，从MAX吸附剂洗脱分析物。将MAX洗脱物蒸发至干燥并且再溶解于0.02M磷酸水溶液、过滤并分析草甘膦、N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。来自C18SPE的单独的一部分洗脱物在MCX SPE柱体上处理、稀释、过滤并对于AMPA进行分析。
加工油商品用二氯甲烷和0.02M磷酸水溶液分配。离心所述溶液以分辨有机部分和含水部分，并收集含水部分。剩余的基质和二氯甲烷部分再次用0.02M磷酸水溶液分配，且含水部分被收集并与第一含水部分合并，用于所述的定量回收。稀释、过滤所合并的含水提取物并对于草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA进行分析。
以正离子LC/MS/MS(液相色谱/质谱/质谱)模式操作，使用采用反相色谱的HPLC和具有电雾化源的三重四极质谱仪，分析最终的提取物。当需要内标来对基体效应进行响应归一化时，就在LC/MS/MS分析之前，加入草甘膦(1，2-13C215N)和AMPA(13C15N)的稳定同位素标准物。
从0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg(10×LOQ)的各种加标玉米和大豆基质的样品的回收支持了该方法的令人满意的表现。表17A、B和C、18A和B、19、20和21总结了在样品基质中各种分析物的平均回收率结果。
表17A.玉米基质
表17B.玉米基质
表17C.玉米基质
表18A.大豆基质
表18B.大豆基质
表19.油基质(仅N-乙酰AMPA)
表20.李子基质
表21.酸橙基质
材料 表22.设备

表23.
表24.试剂
参考分析标准物 草甘膦的参考分析标准物(DPX-B2856-011，96％纯)和N-乙酰草甘膦、钠盐的参考分析标准物(IN-MCX20-000，67.4％纯，为游离酸)从Sigma Aldrich获得。AMPA的参考分析标准物(IN-YB726-001，99.53％纯)获自Alfa Aesar。N-乙酰AMPA的参考分析标准物在E.I.du Pont deNemours and Company，DuPont Agricultural Products，Wilmington，DE获得。表征数据由DuPont Agricultural Products，E.I.du Pont de Nemoursand Company，Wilmington，Del归档。
内标 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C15N(AMPA)稳定同位素标准物获自GmbH，用作内标。结构和具体信息如下。

草甘膦1，2-13C215N
氨甲基膦酸13C15N 实施例2-分析方法的原理 使用探针匀化器，将草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA从植物组织和各种农作物的固体加工部分基质提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N盐酸)/甲醇(96/4)中。用稀盐酸代替甲酸来增加酸性，以更有效地从玉米面粉和玉米粗粉加工部分提取N-乙酰草甘膦。进行多次(3)提取来定量回收分析物和消除作为回收因素的基质含水量。额外的提取溶液体积对于稿秆、干草和壳是必需的，原因在于在这些基质中含水量较低。
纯化固体基质样品提取物中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA 一部分的提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并过滤(0.2-1.0μm)，以除去微粒。在通过C18SPE柱体过滤后进行收集大约10ml的含水部分。一部分从C18SPE收集的洗脱物被稀释并施加于MAXSPE柱体。在几次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(9/1)溶液中，从MAX吸附剂洗脱分析物。将MAX洗脱物蒸发至干燥并且再溶解于含水0.02M磷酸水溶液、过滤并分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。对于大豆样品的分析，对该步骤进行小的改进。对于大豆种子和粗粉，分配之后，可在蒸汽浴中将提取物样品加热大约15分钟，以在微粒过滤之前沉淀提取物中的其它物质。
在固体基质样品提取物中的AMPA的纯化 从上面描述的C18SPE收集的第二部分洗脱物通过MCX SPE柱体处理、稀释、过滤并对于AMPA进行分析。对于AMPA，需要单独的分析物纯化步骤，因为使用MAX SPE纯化的回收率低。
分析油样品中的草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA 用二氯甲烷稀释一部分的样品，并且分析物被液-液分配入0.02M磷酸水溶液。对于分析物的定量转移，样品被分配两次。在每次分配中，离心可用于界定相分离。
在LC/MS/MS分析之前，过滤(0.2μm)全部最终提取物，以除去微粒，作为HPLC系统的预防性维护手段。磷酸在最终样品溶液中的使用，显示草甘膦的总响应和线性得到改善。需要在最终的提取溶液中使用草甘膦和AMPA稳定同位素作为内标以在大豆基质的分析中对于基体效应进行归一化，并且被推荐作改善方法重现性的一般用途。稳定同位素内标就在LC/MS/MS分析之前被最初添加到最终的提取物，但是该步骤被修改成就在SPE纯化之前添加，以对于SPE性能和基体效应进行归一化。用作内标的草甘膦和AMPA的稳定同位素形式与草甘膦和AMPA的表现相同。通过使用苯基-己基分析柱的HPLC反相色谱，联接正离子模式的电喷射离子化作用，连同MS/MS检测一起，解析分析物。相同的色谱条件用于草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA分析。对于每种分析物，获得两个分子离子跃迁，除了AMPA(在正离子模式中仅可获得1个分子离子跃迁)。对于每种分析物，使用单一分子离子跃迁进行定量分析。除AMPA之外，2种检测的MS/MS碎片离子的相对丰度为各分析物提供了确认证据。
分析步骤 试剂溶液 提取溶液A96％的0.1％甲酸水溶液/4％的甲醇。
提取溶液B96％的0.025N盐酸水溶液/4％的甲醇。
80％或95％甲醇水溶液 在80％甲醇/水溶液中的0.1M乙酸 在95％甲醇/5％水中的0.25％氢氧化铵 0.25％氢氧化铵水溶液每升体积，10ml氢氧化铵溶液(最低25％)被加入小体积的HPLC级净化水，然后用HPLC级净化水稀释至最终体积。这是MAX SPE的调节溶液(12ml/样品，水稀释法)。注1ml 25％氢氧化铵稀释至100ml≈0.25％NH4OH。
洗脱溶液，在90％甲醇/10％水中的1％TFA。
1.0M磷酸溶液每10ml体积，0.67ml浓磷酸(最小85％)被添加到在15-ml聚丙烯离心管中的HPLC级净化水，并用HPLC级净化水采用管上梯度稀释至最终体积。
样品和标准物终溶液，0.02M磷酸水溶液 0.2M甲酸水溶液，含水流动相 储备标准物的制备和稳定性 使用纯度大于95％的标准物。在分析天平上称最少大约10mg的标准物，该分析天平提供精确到三位有效数字的重量，或者标准物的量被增加至满足该条件。
因为以草甘膦游离酸当量确定残留容限，所以以草甘膦游离酸当量制备各种分析物的储备标准物溶液，以便能够母体游离酸当量确定加标和回收率。需要时，通过添加适当量的标准物至100-ml容量瓶并用水稀释到最终体积(水是指HPLC级水或等效水)，制备草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA或N-乙酰AMPA的各个游离酸当量储备标准物溶液。下列计算和表25提供了100ml以各种分析物的草甘膦游离酸当量计100μg/ml(ppm)进行制备的指导。

表25 对每种分析物称重的量为至少10mg，因此各分析物储备溶液浓度以母体释放酸当量计可超过100μg/ml。储备标准物溶液可以以更高的浓度制备(不超过1mg/ml)。观察到大约10mg的最低标准物重量和至少10ml的最终标准物体积。这些溶液在等于或低于4℃下储存并且稳定至少9个月。
内标的制备和稳定性 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C 15N(AMPA)稳定同位素标准物被提供于包含1.1ml标称浓度为100mg/L(μg/ml)的水溶液的琥珀色安瓿瓶中。各标准溶液被转入单独的琥珀色瓶，并在20℃或以下在黑暗中储存。通过按照下文概述的方案分析大约500ng/ml的溶液，验证各标准物的同位素纯度。
通过以在100ml的0.02M磷酸水溶液或HPLC级净化水中0.1ml的比率稀释100μg/ml储备溶液，制备含有草甘膦和AMPA同位素的中间100ng/ml内标溶液。内标以在最终溶液体积中50μL/ml或5ng/ml的比率被包括在最终提取物和校准用标准溶液中。当250μL的内标被施加于5ml的最终提取物时，每100ml的100ng/ml标准物溶液可被用于最高达到400个样品。
使用玻璃移液管，将100μg/ml标准物(草甘膦1，2-13C215N、100μg/ml×1.1ml和氨甲基膦酸13C 15N(AMPA)、100μg/ml×1.1ml)各自转移入螺旋盖琥珀色自动进样器小瓶。0.025ml试样的100μg/ml标准物被转入15ml聚丙烯离心管并用5ml 0.02M H3PO4稀释，以制备单独的500ng/ml溶液。0.10ml试样的每种100μg/ml标准物被合并入一个100ml容量瓶中并用0.02M H3PO4稀释至容量，以制备100ng/ml的混合溶液。该溶液被分入2×50ml聚丙烯离心管。全部标准物被储存在致冷器中。该500ng/ml溶液的分析被示于图25。
中间和加标标准物的制备和稳定性 通过各储备溶液的稀释，以草甘膦游离酸当量浓度制备加标溶液。如果要求草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA或N-乙酰AMPA加标在大于0.5mg/kg(10×LOQ)的水平，则各储备标准物溶液应该被用于加标样品。对于10×LOQ和LOQ的样品加标，分别制备10.0μg/ml和1.0μg/ml加标溶液。对于其它加标水平，当需要时，可以配制可供选择的浓度。
10.0μg/ml加标溶液每种分析物的储备溶液被适当地扩大入共同的容量瓶中、用HPLC级净化水稀释至容量、盖上盖并充分混合。例如，对于每种要求的分析物，1.00ml的100μg/ml储备溶液每种分析物的储备溶液被合并入10ml容量瓶中并用水稀释至最终容积、盖上盖并充分混合。
储备溶液浓度将改变并且调整用于制备加标溶液的每种分析物储备溶液的所需体积，以校正使用下列计算确定的最终浓度。

例如，为从分别以草甘膦游离酸当量浓度计算115μg/ml、186μg/ml和206μg/ml的草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA储备溶液制备50ml的10μg/ml加标溶液，下列储备溶液体积被添加至50ml容量瓶。
草甘膦＝10μg/ml×50ml/115μg/ml＝4.35ml储备溶液 N-乙酰草甘膦＝10μg/ml×50ml/186μg/ml＝2.69ml储备溶液 AMPA＝10μg/ml×50ml/206μg/ml＝2.42ml储备溶液 10ml加标溶液用HPLC级净化水适当地稀释每种分析物的10.0μg/ml加标溶液(优选的)或储备溶液入共同的容量瓶中。例如，1.0ml的10.0μg/ml加标溶液被转入10ml容量瓶中并用水稀释至容积、盖上盖并充分混合。在等于或低于4℃储存并且每月更换。
色谱标准物的制备和稳定性 通过各储备标准物的稀释，以草甘膦游离酸当量浓度制备校准标准物。草甘膦和AMPA稳定同位素可以作为内标被用于校准标准物和最终提取物溶液，以对于基体效应进行回收率归一化，用于样品分析。推荐最少5种以上在大约50％的LOQ当量最终浓度至≥120％的最高期望最终样品浓度的范围内的校准标准物用于定量。AMPA分析被单独进行，并具有2.0ng/ml的LOQ当量终浓度。草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的LOQ当量终浓度是1.0ng/ml。
例如，通过将250μL试样稀释至最终体积25.0ml的标准物制备溶液(0.02M磷酸水溶液)，从1.0和10.0μg/ml加标溶液，制备10.0ng/ml和100ng/ml的中间标准物溶液。添加在下文中表26所示的内标，通过这些中间标准物的系列稀释，制备校准标准物。
表26 浓度以草甘膦游离酸当量计。
将校准标准物保持在4℃或以下，并且每两周更换一次。如果得到稳定性试验数据的支持，校准标准物使用可以被延长。
样品的来源(和表征) 从包含草甘膦乙酰转移酶基因(glyat)的转基因杂合玉米收集玉米饲料、颗粒和稿秆基质测试样品。加工玉米面粉、淀粉、硬渣、精炼油(湿磨)、粗粉(干磨)和精炼油(干磨)样品，且也进行收集。大豆饲料、种子和干草来自于包含glyat的大豆品系并从温室植物收集。加工大豆外皮，并且还制备来自含有glyat的大豆品系的大豆粉。在当地超市购买李子和酸橙。
样品的储存和制备 在样品预加工、提取和分析之前，全部样品都在-20±5℃下储存。为分析作准备，对于饲料和稿秆，采用

食品处理器(型号#84145)，而对于谷粒，采用Quaker研磨机(型号4E)，从冷冻保藏和采用干冰的地面存储移出RAC样品。在研磨加工期间，充分混合样品，确保均一性。使大多数干冰升华，然后样品返回冷冻器储存，直到提取和分析。当收到时，加工部分样品是均匀的，并且不需要进一步预加工。
样品加标方法 在提取容器(250ml瓶或50ml离心管)中，根据需要，以草甘膦游离酸当量浓度对未处理的对照样品进行加标。包含测试分析物混合物的10.0和1.0μg/ml加标标准物被用来加标测试样品。表27提供适合用于目前公开的方法的示例性加标。
表27
浓度以草甘膦游离酸当量计。
*在应用之前，加标试样在5ml水稀释，以获得在极干基质上的更好的分析物分布。
对于每种固体基质样品，称出适当量到清洁的250ml PPCO离心瓶中。对于每种油样品，称出2.0±0.02g的样品到清洁的50ml玻璃或聚丙烯离心管中。对于干燥商品(例如，稿秆、干草外皮)，加标试样应该在加标之前在小瓶或管中稀释在5ml HPLC级净化水中，以便分析物更好地分散在基质中。在加标之后，使固体基质样品在通风橱中静置大约15分钟，以允许加标溶液扩散。
实施例3-分析物提取方法 提供了固体基质的分析物提取方法，固体基质包括玉米RAC(饲料、谷粒、稿秆)、玉米加工部分(面粉、硬渣、粗粉、淀粉)、大豆RAC(饲料、种子、外皮)和大豆加工部分(粗粉、外皮)。样品量、提取溶液和提取溶液体积随商品改变。稿秆、干草和外皮要求2×样品量(10.0g)和提取物体积(200ml)来补偿干燥商品。在本文别处提供玉米和大豆油加工部分方法。
固体基质样品 第一次提取 1.0 将正确量的样品称入适当的容器，如上所示。
2.0 如上所示，对样品进行加标，并使固体基质在通风厨中风干15分钟。
3.1 对于饲料、谷粒、种子、硬渣、淀粉或大豆粉样品，将50ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至样品。该步骤被应用于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)农作物类型。
对于稿秆、干草或外外皮，将100ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至样品。对于干为基质样品，用于稀释加标溶液5ml的管或小瓶用该提取溶液漂洗，以在该步骤期间将分析物定量转移至样品。
3.2 对于玉米面粉或玉米粗粉，将50ml提取溶液B(96％0.025N盐酸水溶液/4％甲醇)添加至样品。
4.0 样品被盖上盖并使之静置15分钟，如此提取溶液可渗透入基质。
5.0 样品被打开盖，并在40-50％的总电动机转速或在有效匀化样品而无过热或起泡的速度下，使用Tissumizer匀化2分钟。
6.0 样品被盖上盖并以13,000rpm离心15分钟，以实现上清液的充分澄清。
7.0 将上清液倾析入干净的刻度量筒(根据最终容量的需要为100ml或250ml)。可通过过滤纸倾析上清液，以净化提取物溶液。当倾析时，用汤匙或抹刀按压外皮，以回收额外的提取溶液(30-40ml可能保持在颗粒中)。
第二次提取 8.1 对于饲料、谷粒、种子、硬渣、淀粉、粗粉或面粉样品，将25ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至样品。应用该步骤于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)农作物类型。注粗粉和面粉基质的第二次和第三次提取使用提取溶液A。
8.2 对于稿秆、干草或外皮样品，将50ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至样品。
9.0 在40-50％的总电动机转速或在有效匀化样品而无过热或起泡的速度下，使用

匀化样品2分钟。
10.0 样品被盖上盖并以13,000rpm离心15分钟，以实现上清液的充分澄清。通过过滤纸倾析上清液，以净化提取物溶液。
11.0 倾析上清液并合并成至各自的刻度量筒。
第三次提取 12.0 重复步骤8.1至11.0 13.1 对于饲料、谷粒、种子、硬渣、淀粉、粗粉或面粉样品，用HPLC级水将最终提取物体积调节至100ml或确定超过100ml的精确体积。应用该步骤于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)农作物类型。
13.2 对于稿秆、谷粒或外皮样品，用HPLC级水将最终提取物体积调节至200ml或确定超过200ml的精确体积。
14.0 将上清液转入干净的聚丙烯瓶。将样品从刻度量筒倒回瓶中，以混合溶液。将装满的瓶盖上盖。粗提取物可在等于或低于4℃储存。
实施例4-分析物纯化方法 对于固体基质样品提取物的分析，二氯甲烷分配和C18SPE过滤方法(如下所概述)被最初用于全部分析物的纯化。处理一部分C18SPE洗脱物，用于通过强阳离子交换MCX SPE(如下所概述)进行AMPA的分析。处理单独的一部分C18SPE洗脱物，用于通过强阴离子交换MCX SPE(如下所概述)进行草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的分析。由于分析物在所选择的SPE固定相上的特征和行为，需要单独的方法。对于油加工部分的分析，单一方法被用于所有分析物的提取和纯化(见下文)。
A.固体基质样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、以及AMPA和N-乙酰AMPA的初始纯化方法 二氯甲烷分配 1.0 将30ml样品提取物转入50-ml聚丙烯离心管，并将10ml的二氯甲烷加入样品部分，将样品部分盖上盖，并摇动或涡旋至少30秒(使用管上梯度，用于容积计量)。对于大豆种子或粗粉，使用20ml的二氯甲烷。样品在足够的rpm(例如3000rpm)离心10分钟，以形成明显的层(上文的含水蛋白质和二氯甲烷)。较少的提取物试样可用于调节各分析物纯化方法(例如，当不需要AMPA分析或为分开2种纯化方法时，可使用15ml的提取物和5ml的二氯甲烷)。
2.1 对于除了大豆种子和粗粉之外的所有固体基质，在不干扰沉淀或二氯甲烷层的情况下尽可能多的含水部分被回收，并通过1.0μm或以下的亲水性过滤器过滤到干净的50ml聚丙烯离心管中。(倒空最初的离心管并节省来收集在C18SPE过滤步骤4.0中的废弃提取物)。至少15ml的含水部分被回收并过滤，以采用14ml进行接下来的C18SPE纯化。如果过滤困难，处理较小体积的提取物可能是有帮助的。过滤对于离子交换SPE性能是一个重要的前提。
2.2 对于大豆种子和粗粉样品，在不干扰沉淀或二氯甲烷层的情况下尽可能多地回收含水部分，并将其添加至干净的玻璃管。(倒空最初的离心管并节省来收集在C18SPE过滤步骤4.0中的废弃提取物)。将含水提取物样品置于蒸汽浴至少15分钟，以进一步沉淀基质，然后经1.0-μm或以下的亲水性过滤器(尼龙或玻璃微纤维)过滤入干净的50ml聚丙烯离心管中。
C18SPE过滤 1.0 废料收集管被安装在真空歧管中，以收集初始的样品载荷容量。注废料收集管用来防止步骤3.0期间的交叉污染。
2.0 C18SPE(6cc/500mg，Varian#_12102052)柱体用1ml甲醇、继之以2CV(CV＝6ml)的提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％的甲醇)进行调节。对于慢滴注速率(1-2ml/min)，在需要时施加真空或正压。注意可用0.2M甲酸水溶液代替提取溶液A，用于C18SPE调节。
3.0 当最后的的调节溶液进入吸附剂时，来自二氯甲烷分配纯化步骤2.0的4.0ml含水样品提取物被添加在SPE柱上。
4.0 在滴注停止之后，移动废料收集管并安装干净的15ml离心管。加入来自步骤2.0的10.0ml含水样品提取物、洗脱并收集洗脱物。提取物溶液可在4℃或以下储存。
B.固体基质样品的AMPA纯化方法 两种方法被用于AMPA的MCX SPE纯化。MCX SPE过滤纯化方法最初被开发用于玉米基质，以从提取物过滤基质而不保留AMPA。后来，MCX SPE纯化方法被开发来降低大豆基质的基质抑制。MCXSPE纯化方法适合用于全部固体基质样品。纯化方法还被用于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)作物类型。
AMPA MCXSPE过滤纯化 1.0 Oasis MCX SPE柱体用1CV(CV＝6ml)甲醇和1CV提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％的甲醇)进行依次调节。轻微真空可被用于控制慢滴注(1-2ml/min)下的洗脱。轻微真空被施加或持续，直到滴注停止。
2.0 15ml离心管被安装在SPE柱体之下在真空歧管之中，而0.25ml的100ng/ml内标被施加于各SPF柱体中的吸附剂床顶端。
3.0 4.0ml的C18过滤提取物被施加于MCX SPE柱体。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可施加轻微真空。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
4.0 从 真空歧管回收样品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸发至4ml以下。
5.0 然后，0.1ml1M磷酸水溶液用水稀释至5.0ml的最终体积。盖上盖并涡旋最终提取物。
6.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最终提取物被过滤(0.2μm尼龙)。最终溶液可在4℃或以下储存。
AMPA MCXSPE过滤 1.0 用甲醇在含有0.25ml的100ng/ml内标的50ml离心管中，将4ml的C18过滤提取物稀释至20ml，并将其施加于MCX SPE柱体。
如果需要，可施加轻微真空。注意在一些基质的稀的甲醇/提取物水溶液中可观察到沉淀。
2.0 Oasis MCX SPE柱体用1CV(CV＝6ml)的甲醇和1CV的提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％甲醇)∶甲醇(1∶4，v∶v)溶液依次调节。轻微真空可被施加来控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脱。轻微真空被施加或持续，直到滴注停止。
3.0 稀提取样品(步骤1.0)被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可施加轻微真空。
4.0 2ml甲醇被添加至样品管、混合并添加到SPE柱体，用于定量转移和吸附剂漂洗。施加真空或正压，直到滴注停止。
5.0 15ml离心管被安装在SPE柱体之下在真空歧管之中。
6.0 4.0ml的HPLC级水被施加于MCX SPE柱体。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可施加轻微真空。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
7.0 从真空歧管回收样品，并使样品在N-Evap上在45-50℃下蒸发至4ml以下。
8.0 0.1ml 1M磷酸水溶液+0.25ml的100ng/ml内标被添加至样品，然后用水稀释至5.0ml的最终体积。盖上盖并涡旋最终提取物。
9.0 一部分最终提取物被过滤(0.2μm尼龙)，用于LC/MS/MS分析。最终溶液可在4℃或以下储存。
C.在固体基质样品中草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA分析物纯化方法 两种方法被应用于MAX SPE提取物纯化，进行草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA分析。在提取物(调节至基本pH)在甲醇中稀释这一步骤之后进行MAX SPE纯化通常被用于玉米基质和大豆饲料和干草基质。MAX SPE纯化与甲醇稀释一起可用于酸性(例如酸橙)作物类型。在提取物在水中稀释这一步骤之后进行MAX SPE纯化被用于大豆种子、粗粉和外壳基质的分析。MAX SPE纯化与水稀释步骤一起被用于水性(例如李子)作物类型。
MAX SPE纯化(提取物在甲醇中稀释步骤) 1.0a 除了酸性农作物，2.0ml的C18纯化提取物被转移(来自步骤4.0，SPE过滤)至包含80μL氢氧化铵溶液(最低25％)和0.25ml 100ng/ml内标的50ml刻度离心管，然后用甲醇稀释至大约20ml。
1.0b 对于酸性农作物，2.0ml的C18纯化提取物(来自步骤4.0，SPE过滤)被转移至包含0.1ml三乙胺(TEA)和0.25ml 100ng/ml内标的50ml刻度离心管，然后用甲醇稀释到大约20ml。注意施加于MAX SPE柱体的提取物体积可在1.0至4.0ml的范围内改变。添加的碱(氢氧化铵或TEA)的量应该适当调节，而100ng/ml内标的量应该对于步骤8.0中的最终提取物体积的任何变化进行调节(0.05ml内标/ml最终提取物体积)，但是用甲醇稀释至20ml，漂洗体积和8ml洗脱不应该变化。
2.0a 除了酸性农作物，MAX SPE(6cc/500mg)柱体用1CV(CV＝6ml)的甲醇、继之以2CV 0.25％氢氧化铵在95％甲醇/水中的溶液调节。需要时施加真空，以控制流动至2-5ml/min。
2.0b 除了酸性农作物，MAX SPE(6cc/500mg)柱体用1CV(CV＝6ml)的甲醇、继之以2CV 0.1％TEA在80％甲醇/水的溶液调节。需要时施加真空，以控制流动至2-5ml/min。
3.0 当最后的调节溶液进入吸附剂，装载碱调节的样品提取物溶液(步骤1.0)。对于颗粒样品，可能需要施加轻微真空，但是保持滴注速率缓慢。
4.0 在最后的样品溶液进入吸附剂之后，15ml的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被顺序添加，以漂洗SPE柱体。注15ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸被顺序添加并从各自倒空的样品提取物管分配，进行样品提取物到SPE柱体的定量转移。最终10ml的95％甲醇/水漂洗液以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱体。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以从SPE吸附剂除去过量的溶液，并且收集小瓶或管被安装在真空歧管中。注50ml玻璃离心管(重复使用)或20ml玻璃闪烁瓶(在使用之后丢弃)用于样品收集。为了最快蒸发，使用具有平面、圆的或稍微倾斜的底部的收集容器。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脱溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)洗脱。通过重力注入进行洗脱。在添加第二部分之前，第一部分通过SPE柱体之后等待至少5分钟。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
7.0 从SPE槽移出样品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸发至完全干燥。注允许额外的15分钟干燥，以确保TFA完全蒸发。
8.0 5.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至样品。样品被盖上盖、涡旋混合、超声处理至少5min并涡旋。注如果使用其它体积的C18提取物(步骤1.0)，则最终的提取物体积和组成应该被调整，如此分析物浓度是一致的(例如，如果通过该纯化方法处理1.0ml来自C18SPE的提取物，则在步骤1.0中，最终的提取物样品应该以2.5ml重构，其中添加0.125ml的100ng/ml内标)。
9.0 一部分最终提取物被过滤(0.2μm尼龙)入自动进样器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MAX SPE纯化(提取物水中稀释步骤) 1.0 2.0ml的C18纯化提取物被转入包含0.25ml的100ng/ml内标的50ml刻度离心管并用HPLC级水稀释至大约20ml。注意施加于MAX SPE柱体的提取物体积可在1.0至4.0ml的范围内改变。100ng/ml内标的量应该对于步骤8.0中的最终提取物体积的任何变化进行调节(0.05ml内标/ml最终提取物体积)，但是用水稀释至20ml，漂洗体积和8ml洗脱不应该变化。
2.0 MAX SPE (6cc/500mg)柱体用1CV(CV＝6ml)的甲醇、继之以2CV 0.25％氢氧化铵在HPLC级水中的溶液来调节。需要时施加真空，以控制流动至2-5ml/min。
3.0 当最后的调节溶液进入吸附剂，装载样品提取物溶液。对于颗粒样品，可能需要施加轻微真空，但是保持滴注速率缓慢。
4.0 在最后的样品溶液进入吸附剂之后，15ml的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被添加，以漂洗SPE 柱体。注15ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸应该顺序添加到各自倒空的样品提取物管并从那里分配，进行样品提取物到SPE柱体的定量转移。最终10ml的95％甲醇/水漂洗液以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱体。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以从SPE吸附剂除去过量的溶液，然后且收集小瓶或管被安装在真空歧管中。注50ml玻璃离心管(重复使用)或20ml玻璃闪烁瓶(在使用之后丢弃)用于样品收集。为了最快蒸发，使用具有平面、圆的或稍微倾斜的底部的收集容器。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脱溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)洗脱。洗脱通过重力给料。在第一部分通过SPE柱体之后，在添加第二部分之前，过去至少5分钟。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
7.0 从SPE槽移出样品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸发至完全干燥。注允许额外的15分钟干燥，以确保TFA完全蒸发。
8.0 5ml的0.02M磷酸水溶液被添加至样品。样品被盖上盖、涡旋混合、超声处理至少5min并涡旋。注如果使用其它体积的C18提取物(步骤1.0)，则最终的提取物体积和组成应该被调整，如此分析物浓度是一致的(例如，如果通过该纯化方法处理1.0ml来自C18SPE的提取物，则最终的提取物样品应该以2.5ml重构，其中添加1.25ml的100ng/ml内标)。
9.0 一部分最终提取物溶液被过滤(0.2μm尼龙)入自动进样器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
D.在油基质样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、以及AMPA和N-乙酰AMPA提取和纯化方法 1.0 对于每一样品，将2.0±0.02g的样品称入干净的50ml玻璃或聚丙烯离心管。
2.0 对于加标样品，样品被如上所示进行适当加标。
3.0 15.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至样品。
4.0 15.0ml的二氯甲烷被添加至样品，然后该样品被盖上盖、涡旋混合至少30秒。
5.0 样品在3000rpm下离心大约10分钟。
6.0 含水部分被转入干净的50ml量筒。尽可能多的该部分被回收而不干扰有机层。) 7.0 另外15.0ml的0.02m磷酸水溶液被添加至样品，然后该样品被盖上盖、涡旋混合至少30秒。
8.0 样品在3000rpm下离心大约10分钟。
9.0 含水部分在各自的50ml量筒中与第一分配合并。(尽可能多的该部分被回收而不干扰有机层。) 10.0 用0.02M磷酸水溶液将含水样品稀释至40ml最终体积。
11.0 最终样品提取物被转入干净的瓶子。(将样品在量筒和瓶子之间来回倒，以确保均一性。) 12.0 如果使用稳定同位素草甘膦和AMPA内标，最终样品通过合并4ml提取物+0.25ml的100ng/mlIS+0.75ml的0.02M磷酸水溶液而制备，并且在LC/MS/MS分析之前过滤(0.2μm)样品。如果不使用稳定同位素内标，则用1ml的0.02M磷酸水溶液稀释4ml的该提取物并在LC/MS/MS分析之前过滤(0.2μm)。
实施例5-分析物的检测 Agilent HP 1100HPLC和Waters Quattro Premier三重四极质谱仪被用于LC/MS/MS分析。典型的设备部件和操作条件如下 Agilent HP1100 G1322A真空脱气器，G1311A四联泵，G1367A冷冻自动 HPLC 进样器，G1330A冷冻器，G1316A柱室 注射体积25μL(可以改变以校正MS灵敏度) 保护柱Waters Nova-Pak C18 (任选，优选)(3.9mm i.d.×20mm，4μm直径颗粒) HPLC柱Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(15.0cm×4.6mm i.d.，3μm直径颗粒) 柱温40℃ 流动相A＝0.2M甲酸水溶液 B＝甲醇 Waters QuattroESI接口，MassLynx版本4SP4软件 Premier 接口电雾化(ESI) 极性正离子 模式MRM 表28 HPLC条件
示于表28的大约的分析物保留时间(通过保留时间排序)如下 AMPA＝4.6min 草甘膦＝5.3min N-乙酰AMPA＝7.1min N-乙酰草甘膦＝7.4min 注根据HPLC柱和甲酸流动相的条件，分析物保留时间可能变化。预期保留时间随柱退化而缩短。流动相中较低的甲酸浓度延长了保留时间并使分析物的峰形变宽。
表29 质谱条件
在其它仪器上的质量赋值可能变化±0.5个原子质量单位(amu)。可调节停留时间来优化响应。
校准方法 使用标准质谱仪调谐并校准技术。如果需要建立对质量校准的信心(在数字控制之下的现代质谱仪通常不需要频繁的质量校准，尤其对于定量模式，使用供应商推荐的校准溶液。可通过注入一种或多种测试分析物来进行MS系统的优化调谐。该方法采用如上所述制备的内部和外部校准标准物。
使用

函数AVERAGE、STDEV(标准偏差)和RSD(相对标准偏差StDev/平均值)，基于外部校准标准物的平均响应因子(分析物峰面积响应/分析物浓度)进行仪器校准。对于平均响应因子校准，应该观察到小于或等于20％的％RSD。监测使用

函数SLOPE、INTERCEPT和RSQ(r-平方；使用

函数RSQ确定的Pearson积矩相关系数的平方)获得的外部校准标准物的线性回归响应，以建立校准曲线线性。有效定量的接受准则是(1)对于校准曲线，RSQ值＞0.99；和(2)对于各校准标准物响应因子，％RSD≤20％。可以使用包括有或者没有进行加权(例如1/X)的线性回归在内的可选方法，如果它们对校准标准物响应提供一当量以上一致性拟合的样品响应的话。
草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的标称LC/MS/MS校准范围是0.5-20.0ng/ml，而AMPA的标称LC/MS/MS校准范围是1.0-50.0ng/ml。草甘膦和N-乙酰草甘膦分析的LOQ当量最终提取物浓度是1.0ng/ml。AMPA分析的LOQ当量最终提取物浓度是2.0ng/ml。通常，对于定量LC/MS/MS分析，分析5个校准溶液(需要最少4个校准溶液)。
净回收率可以仅对于加标样品进行计算(对于现场样品则不可接受)。净回收率可以仅当对照样品中的残余可积分并＜LOQ的50％时进行计算并报告。当对照残余＞LOQ的50％时，使用该对照以LOQ制备的回收样品无效。当对照残余＜LOQ的50％时，在加标样品中得到的校正ppm(mg/kg)通过从在加标样品中得到的面积数减去在对照中得到的面积数加以计算。如果计算了净回收率，则那些结果必须被唯一地识别或存在于校正ppm(mg/kg)的单独的电子数据表列标题。
样品分析 常规进行至少2个校准标准物的初步运转，以证明适当的仪器响应并确保LC/MS/MS系统得到平衡。如果分析多组，则在所述组的最后一次和第一次注射之间进行溶剂空白注射，以最小化组间携带的风险。校准标准物分析在第一个样品分析之前并且在最后一次样品分析之后进行，如此样品分析处于外标校准之间。通常，注射顺序从最低到最高预期分析物浓度加以组织。校准标准物试验与测试样品掺杂进行，并且在各分析组中可在每1-3个样品前后进行分析。如果储存的话，提取物和校准标准物被冷藏。通常，在分析组中，对于可接受的定量结果，需要加标样品回收率(70-120％)。
计算 方法 在农作物基质中，草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA残余被测量为以mg/kg(ppm)计的草甘膦游离酸当量。定量基于平均响应因子，平均响应因子根据与样品提取物同时分析的多个校准标准物进行确定。使用以两位有效数字报告的不舍入的值，进行全部计算。加标样品回收率以四舍五入的整数百分比(％)报告。
确定通过平均响应因子分析在残余样品中发现的mg/kg的计算如下 无内标校准
有内标校准
其中， PA 是分析物峰面积， FV 是最终提取物体积(ml)， XV 是总提取物体积(ml)， ARF 是平均响应因子
IS 是样品提取物中内标的峰面积， ARFIS 是采用内标的平均响应因子
AF 是等分试样因子(XV稀释至FV的ml)， SW 是提取的样品部分的样品重量(5.0g)，和 UC 单位换算 μg/1000ng×mg/1000μg×1000g/kg＝mg·g/1000ng·kg 来自加标样品的回收率百分比(以四舍五入整数报告)如下计算
无内标的实例 在玉米颗粒样品中的N-乙酰草甘膦颗粒10X062905-1 (参考表2、图8、表30-40)
注从加标样品面积减去对照样品面积39
在玉米颗粒样品中的AMPA颗粒-LOQ052905-3 (参考表2、图8、表30-40)

采用内标的实例 在大豆种子样品中的草甘膦大豆种子AX 10X1 1004 (参考表10、
图16、表30-40)

在大豆种子样品中的AMPA大豆种子CX L1 1004 (参考表10、
图16、表30-40)

表30.玉米粒-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表31.玉米粒-AMPA
表32.玉米油-草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA
表33.大豆种子-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表34.大豆种子-AMPA
表35.大豆粗粉-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表36.大豆粗粉--AMPA
表37.李子-草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积.类型(B空白，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物).SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb).发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000). 表38.李子-AMPA
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积.类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物).SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb).发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000). 表39.酸橙-草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积.类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物).SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb).发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表40.酸橙--AMPA
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积.类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物).SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb).发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
结果 检测器响应 采用正离子ESI和串联质谱法检测的三重四极质谱仪用于样品提取物分析。通过标准物溶液的分析，草甘膦、N-乙酰草甘膦以及AMPA和N-乙酰AMPA的全扫描总离子和MRM谱分别提供于
图1-图3。
对于草甘膦和N-乙酰草甘膦在0.5-20ng/ml的范围内或者对于AMPA在1.0-50ng/ml的范围内，校准标准物一般产生校准标准物响应因子(峰面积/浓度)的％RSD＜20％的线性响应(r2＞0.99)。每种分析物的典型校准曲线使用校准标准物从包括0.5-100ng/ml的扩展范围的确认组进行绘制，并在图4中给出。校准标准物的典型离子色谱提供于图6。稳定同位素草甘膦和AMPA标准物的典型离子色谱提供于图25。
对于玉米和大豆基质，来自未处理的对照样品、0.050ppm(LOQ)加标样品和0.50ppm加标样品的提取物的典型色谱提供于图8-图21。对照 在玉米和大豆基质的对照提取物的色谱中，在草甘膦、AMPA或N-乙酰草甘膦洗脱的色谱保留时间下，没有观察到显著的基质干扰。因为基因改造植物和包含草甘膦的除草剂在美国广泛用于大豆农作物种植，所以市售样品(包括有机样品)通常包含草甘膦和AMPA残留。用于本研究的大豆对照样品是来自认证研究中的田间地块的未处理的对照。
回收率(准确度与精度) 玉米基质的回收率结果提供于表1-表8(分别为饲料、谷粒、稿秆、油、面粉、硬渣、淀粉和粗粉)。大豆基质的回收率结果提供于表9-表14(分别为饲料、种子、干草、油、粗粉和外壳)。在玉米和大豆基质中在0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg加标水平下的平均结果以及总结果提供于概要部分的表格中。来自玉米粒、玉米油、大豆种子和大豆粉的各样品组分析的典型回收率结果提供于表30-40。

表1B玉米饲料验证结果(续表)

表2B玉米粒验证结果(续表)

表3B玉米稿秆验证结果(续表)
表4A玉米油验证结果
表4B玉米油验证结果(续表)
对于N-乙酰AMPA，合并玉米和大豆油验证回收率 表5玉米面粉验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素. 表6玉米硬渣验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素. 表7玉米淀粉验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
*结果是同一提取物的2次注射(25μL和50μL注射体积)的平均值 表8玉米粗粉验证结果
作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素. 表9A大豆饲料验证结果
下划线表示从样品峰面积减去对照样品峰面积，以确定最终结果。
*用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。草甘膦和N-乙酰草甘膦是处理2次的同一最终提取物的分析的平均值。
表9B大豆饲料验证结果(续表)
表10A大豆种子验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
表10A大豆种子验证结果(续表)
表11A大豆甘草验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
*同一提取物(再纯化)的2次分析的平均值。
表11B大豆甘草验证结果(续表)
表12大豆油验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
对于N-乙酰AMPA回收率数据，见表4 表13大豆粗粉验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
*对于AMPA分析，样品组不同 表14大豆外皮验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素。
*对于AMPA，同一提取物的2次分析的平均值。
表15李子验证结果
表16酸橙验证结果
提取效率 在代谢研究中，使用tissumizer均化和手动(Wrist-action)振荡器，在0.1％甲酸/甲醇(96/4，v∶v)中提取玉米饲料、谷粒或稿秆样品3次。在该方法中应用的最大的提取物与样品比是6比1(150ml比25g)，尽管该比率随商品和提取重复而变化。
在该残留物分析法中，样品大小被降低至5.0g并且各商品和重复的溶剂与样品比为至少5比1。表41对比了对于每种基质用于代谢和残留物方法的样品量和比率。
表41
在该残留物分析法中提取步骤与应用于从农作物定量提取草甘膦相关残留物的提取步骤一致。
通过在原始研究中的后置柱衍生化荧光(PCD-荧光)方法(Cowell等(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960)和通过该LC/MS/MS方法，分析来自认证现场研究的遭受残留的样品的草甘膦和AMPA残留物。在这些研究中的玉米包含EPSPS酶变体遗传修饰，因此N-乙酰草甘膦代谢物不形成。表42概括了从2个试验区收集的未处理的(对照)和处理的玉米粒样品的以mg/kg(ppm)草甘膦游离酸当量计的结果。
表42
S00227147(对照)、S00227149和S00227154样品从相同的试验区收集并且使用后置柱衍生荧光检测，观察到增加AMPA残余的干扰。
表43概括了从现场研究的2个试验区收集的未处理的(对照)和处理的玉米粒、饲料和稿秆样品的以mg/kg(ppm)草甘膦游离酸当量计的结果。
表43
来自两个方法的分析结果显示出玉米中草甘膦和AMPA的一致结果，并证实该分析法的提取效率。
定量限(LOQ) 对于在玉米和大豆基质中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA，在该方法中验证的LOQ是0.050ppm(mg/kg)。LOQ被定义为最低加标水平，在该水平下，达到70-120％的平均回收率和RSD＜20％。另外，在该加标水平，对于最小响应的分析物AMPA，分析物峰一致地表现出约5-20比1的信噪比。
背景评价 串联质谱分析存在的背景水平最小。通常，样品提取物溶液和校准标准物溶液的色谱图显得相同。检测的每种基质的对照样品色谱提供于图9-图21。
检测限(LOD) LOD定义为在基质中响应相当于大约3比1的信噪比(s/n)的分析物浓度。对于各分析物，使用下列方程式，通过在LOQ加标样品中确定的sn响应，估计LOD。

对于草甘膦，估计的LOD为0.004mg/kg，对于N-乙酰草甘膦为0.006mg/kg，而对于AMPA为0.007mg/kg；对于N-乙酰AMPA为0.006mg/kg。显示出各分析物的s/n测定值和计算的估计值的各个色谱提供于图26。观察到LOD偏差，并且使用该方法的每一实验室应该估计LOD值。
对于草甘膦和N-乙酰草甘膦，监测分子离子的两个独立的MS/MS跃迁。从校准标准物响应，确定两个碎片离子的相对响应值比(基础峰/二级峰)，用于证实基质样品中的分析物。可接受的证实标准是相比于在校准标准物中观察到的平均响应共洗脱峰(±5％)和当量离子比(±30％)在与样品同时分析的LOQ当量浓度以上。在分析组中测定的各分析物的计算的响应比和保留时间示于表43-48。使用现有规范方法，可以确定草甘膦和AMPA的证实。参见，例如Cowell等(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960；Alferness等(April 3，1993)“TouchdownDetermination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in CornGrain，Corn Forage，and Corn Fodder by Gas Chromatography andMass-Selective Detection”；Zeneca Ag Products Analytical Method RR92-042B，可从U.S.EPA PesticidesAnalytical Methods & Procedures网站(www.epa.gov/oppbead1/methods/ram12b.htm)获得；以及可从BfRFederal Institure for Risk Assessment获得的Manual of Pesticide ResidueAnalysis卷I和II中的第405个方法，植物保护产品和除草剂的残留的官方分析方法(L 00.0016)(www.bfr.bund.de/cd/1652)。
表43.玉米饲料典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果。

比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表44.玉米粒典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表45玉米稿秆典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表46大豆饲料典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表47.大豆种子典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表48.大豆甘草典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦确认结果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留时间(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 进行该方法的其它确认试验。在玉米(饲料、颗粒和稿秆)和大豆(饲料、种子和干草)基质中，以0.050和0.50ppm水平对草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA进行加标。使用VirTishearTM(Virtis Company Inc.，Gardiner，NY)匀化器，代替TissumizerTM匀化器，来在提取期间浸软组织。使用Applied Biosystems/MDS SCIEX API 4000质谱仪代替QuattroPremier。注射体积被增加，以补偿质谱仪灵敏度的下降。发现可接受的结果。数据未示出。API 4000 LC-MS/MS系统的仪器条件提供于表49和图27-30。
表49API 4000LC/MS/MS条件和色谱
调节期间(min)值，使其与在第4.3.2节报道的、使用保护柱的HPLC的时间一致。
总之，目前公开的分析法适于在玉米和大豆基质中草甘膦、N-乙酰草甘膦以及AMPA和N-乙酰AMPA残余的定量。结果证实了0.050mg/kg(ppm)的LOQ，其中对于草甘膦的LOD估计值为0.004mg/kg，对于N-乙酰草甘膦为0.006mg/kg，而对于AMPA为0.007mg/kg。
该分析法步骤被成功地应用于李子和酸橙，证明分别在水性和酸性农作物基质的适用性，即使这些作物类型不包含gat特性和N-乙酰草甘膦。
在验证试验中各分析物和基质的总平均回收率的范围从75％(大豆皮中的草甘膦)到109％(大豆油中的AMPA)，其中最大RSD为19％(玉米油中的AMPA)。
基于保留时间和在样品分析期间检测的两个MS/MS母体-至-碎片离子跃迁的相对比，在0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg加标水平，证明草甘膦和N-乙酰草甘膦的残余证实。
实施例6 概述 检测N-乙酰草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)和N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)。该研究被设计来证明本方法的实用性、重现性和效率。本方法被设计来测量植物基质中的草甘膦和代谢物，其中定量限(LOQ)为0.05ppm。在葡萄和大豆种子中，对于以0.05ppm加标五次的对照，通过获得各个在70至120％的可接受范围内的回收率，证实草甘膦和代谢物两者以草甘膦当量计为0.05ppm的该方法的报告LOQ。
对于在该方法LOQ和每种基质的各自的容许水平下葡萄和大豆种子中的草甘膦和代谢物的定量，成功地验证了本方法的性能。在葡萄中，用一个试验成功验证了该方法。对于大豆种子的成功验证，需要两个试验。结果概述提供于下表中。
表54.回收率概述
在该方法期间进行的微小方法修改是在LC/MS/MS分析之前将20ppm加标样品的最终大豆种子提取物稀释100倍，以调节校准曲线内的残余浓度。调节仪表参数来增加灵敏度。
具有多个反应监控(MRM)检测的LC/MS/MS在与未加标的样品中草甘膦和代谢物相当的保留时间下免于受到干扰。在葡萄和大豆种子中，对于以连个水平加标的对照样品的五次重复分析，实现了可接受的回收率(70至120％)。在大豆种子中N-乙酰AMPA的一个126％的回收率被接受，这是基于大豆种子的回收率相一致并且在各加标水平下的该代谢物的平均回收率在70至120％的可接受范围之内。
对于全部基质，未加标的对照样品显示出无可检测的草甘膦或代谢物残余。
在该研究中，加标水平被选择来提供在该方法LOQ和在提出的容许水平下的方法性能数据。在所有基质中，对于所有分析物，以草甘膦当量计，LOQ为0.050ppm。对于所有分析物，葡萄以草甘膦当量计0.20ppm的所提出的容许水平加标，而大豆种子以草甘膦当量计20.0ppm的所提出的容许水平加标。在该概述表中给出的结果反映了各化合物的实际浓度；而不是草甘膦当量。
在没有任何重大修改的情况下进行该分析法。对于大豆种子，在第二次尝试，实现成功的确认组，而对于葡萄，在第一次尝试，实现成功的确认组。该独立的实验室研究证明了该分析法适用于大豆种子和葡萄中的草甘膦和代谢物的定量。
测试系统 本方法适用于在各种农作物基质中草甘膦和草甘膦代谢物的定量。葡萄和大豆种子被选择来验证该分析法。葡萄对照基质从外面来源(有机食品店)购买。样品被冷冻保藏并在被分析以证实该对照在适当的保留时间无干扰物之前进行处理。大豆种子对照基质由ABCLaboratories，Inc.，7200E.ABC Lane，Columbia，MO提供。
设备 下列设备细目用于进行该独立的实验室确认。
仪器/色谱法 MDS Sciex API 4000LC-MS/MS系统，包括 MDS Sciex API 4000MS/MS，系列号V04560403(AppliedBiosystems Group，Foster City，CA)，配备有TurboIonSpray接口和Analyst软件版本1.4 HPLC柱4.6mm i.d.×150mm，Phenomenex Luna Phenyl Hexyl，系列号208752-1，3-μm直径填充部件编号00F-4256-E0(Phenomenex，Torrance，CA) 十孔电动阀，系列号EM2M06183 (ValcoInstruments Co.Inc.，Houston，TX) Shimadzu LC-10ADVP HPLC泵，系列号C20964153748US和C20964153747US(Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu SiL-HTC自动进样器，系列号L20024250137US (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu CTO-10AVP Colurnn Oven，系列号C2102 41 50408 (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu DGU-14A脱气器，系列号SS132668 (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Phenomenex C18保护柱，4×3mm，部件编号AJO-4287 固相提取设备/供应商 24-孔SPE真空歧管(Burdick and Jackson，Muskegon，MI) Bond Elut SPE柱体C18，500mg/6cc，Cat No.12102052，Lot No.0723704(Varian，Inc.Palo Alto，CA) Oasis MAX SPE柱体，500mg/6ml，目录号1860000865，Lot No.001336341A(Waters Corporation，Millford，MA) Oasis MCX SPE柱体，500mg/6ml，目录号1860000776，Lot No.002236322A(Waters Corporation，Millford，MA) 实验室器皿 15ml聚丙烯离心管，部件编号20171-024 (VWR，West Chester，PA 19380) 50ml聚丙烯离心管，部件编号89004-367 (VWR，West Chester，PA 19380) 带盖硼硅酸盐玻璃闪烁瓶，20ml部件编号986546 (Wheaton，Millville NJ 08332) HPLC瓶，2ml，部件编号5182-0716 (Agilent Technologies，Palo Alto，CA 94306) HPLC瓶盖，部件编号5182-0717 (Agilent Technologies，Palo Alto，CA 94306) 一次性移液管，3ml，部件编号16001-176 (VWR，West Chester，PA 19380) Pyrex量筒，100ml，带塞，部件编号CLS2982250和CLS3022250 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) HDPE广口聚丙烯瓶，250ml，带无衬垫盖，部件编号209548SP (Wheaton，Millville，NJ 08332) 注射过滤器，尼龙0.45μm，30-mm直径过滤器单元，部件编号F2500-1 (National Scientific，Rockwood，TN37854) 注射过滤器，尼龙0.20μm，17-mm直径过滤器单元，部件编号F2513-2 (National Scientific，Rockwood，TN 37854) 试剂 丙酮-HPLC-级，目录号AX0115-1，EMD (Chemicals，Gibbstown，NJ) 冰醋酸，目录号9515-03(J.T.Baker，Philipsburg，NJ) 乙腈-HPLC-级，目录号AX0145-1(仅用于LC/MS/MS针漂洗)(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ) 氢氧化铵-28％NH3水溶液，99.99+％纯(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 二氯甲烷-HPLC-级，目录号DXO838-1(EMD chemicals，Gibbstown，NJ) 甲酸，99.0％纯，Fluka，目录号06440(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 甲醇-HPLC-级，目录号MX0475-1(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ) 磷酸-Baker Analyzed 86.0％纯，目录号7664-38-2(J.T.Baker，Philipsburg，NJ) 三氟乙酸，99.0％纯，Fluka，目录号91703(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 水-超高纯度，获自Purelab Classic UV UHP水系统 分析法原理 使用探针匀化器，将草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA从葡萄和大豆种子样品提取入稀含水酸/甲醇(96/4，v/v)。进行三次提取，用于分析物的定量回收，然后继续纯化和分析。
草甘膦和N-乙酰草甘膦的纯化一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并过滤，以除去微粒。大约10ml的含水部分在通过C18SPE柱体过滤后进行收集。一部分从C18SPE收集的洗脱物被稀释并施加于MAX SPE柱体。在几次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(90/10)溶液中，从MAX吸附剂洗脱分析物。将MAX洗脱物蒸发至干燥并且再溶解于0.02M磷酸水溶液、过滤并分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。分配之后，使大豆种子样品经受蒸汽浴大约15分钟，以在微粒过滤之前沉淀提取物中的其它物质。
AMPA和N-乙酰AMPA的纯化从上面描述的C18SPE收集的第二部分洗脱物通过MCX SPE柱体处理。将样品施加于柱体，然后用水和甲醇洗脱。N-Evap用来吹净溶剂；添加浓缩的磷酸水溶液，以便最终溶液等于0.02M磷酸水溶液。然后，分析样品的AMPA和N-乙酰AMPA。在施加到柱体之前，大豆种子样品在甲醇中稀释。
修改、解释和关键步骤 对于大豆种子中草甘膦的确认，进行微小的方法修改。在LC/MS/MS分析之前，最终提取物被稀释100倍，以在校准曲线的范围内并入残留物。
修改一些API 4000LC/MS/MS仪器参数，以优化灵敏度。该修改包括增加源温、调节碰撞能电势和调节气流设置。
在该方法的实施例4A的步骤2.2中，蒸汽浴温度不被指定。在与赞助者的通信过程中，85℃的温度被推荐来更有效地从基质沉淀蛋白质。
在实施例4C的步骤5.0中，推荐使用具有平面底部或稍微斜率底部的50ml或20ml收集容器。由此，假定15-ml离心管将是适当的。然而，基于在第3组大豆种子试验1中获得的低回收率，由此确定具有更扁平底部和更大表面积的20ml闪烁管为有效蒸发所需。
仪器 色谱法反相液相色谱用来从共提取剂分离草甘膦和它的代谢物。选择Phenomenex Luna Phenyl Hexyl柱。
表55.HPLC条件
LC/MS/MS分析 使用MDS Sciex API 4000LC/MS/MS——其配备有TurboIonSpray源并在MRM、正离子模式下操作，进行草甘膦和它的代谢物的分析。在Analyst软件版本1.4上，使用具有1/x加权的线性回归，基于每种分析物的单离子跃迁的积分面积，进行定量。典型实验条件的概要提供于表56。
表56.MDS Sciex API 4000MS/MS质谱仪条件
表56.
校准步骤 在每组中用样品包埋校准标准物，并且通常从低到高浓度进展。通过将每一标准物的分析物峰面积除以对于该标准物的分析物浓度，计算每一校准标准物的响应因子。对于每一组注入的校准标准物，计算平均响应。
结果和讨论 检测器响应 在0.5到100ng/ml的范围内分析校准标准物。MS/MS检测器响应在分析的标准物的范围内与1/x加权成线性关系。检测器响应在每一分析试验的整个过程中是稳定的，如通过标准物准确度值所证明。
对照样品 在与每一确认试验同时分析的一式两份未加标对照样品中，在草甘膦或它的代谢物的保留时间下，没有检测到干扰峰。
试验1，大豆种子 大豆种子的第一个试验(第3组)失败，原因在于对于草甘膦和每种代谢物观察到的低回收率。试验1的结果总结在表57中。
表57.失败的大豆种子的回收率总结试验1
根据该分析法中给出的步骤，分析大豆种子的第一个试验，只是草甘膦和AMPA稳定同位素不用作内标，并且MAX SPE的收集器与该方法中推荐的较大体积和尺寸不一致。
在大豆种子的第一个试验的分析之后，由此确定草甘膦的低回收率可能由于样品没有完全通过吹净干燥以及缺乏内标。未检出N-乙酰AMPA可能与最终溶液中由于样品通过吹净没有干燥造成的残留TFA导致的保留时间变化有关系。进一步，所有的方法展开和确认工作已经在蒸汽浴步骤期间在至少80℃的温度下进行。在大豆种子的第一次试验中蒸汽浴的温度为45℃。这可能并没有促进基质内的蛋白质沉淀出，其可能在LCMS/MS分析期间抑制分析物。在LCMS/MS分析期间，草甘膦和AMPA内标的添加还将对于抑制和漂移进行调整。
试验2，大豆种子 在第一个试验失败后，根据在通信中阐明的分析法中给出的步骤，分析第二个大豆种子试验(第4组)。制备一组新的校准标准物与所掺入的内标，用于第二个试验的分析。草甘膦提取物在20ml玻璃闪烁管中吹净，以确保完全干燥。在分析之前，将内标添加至全部样品。
草甘膦、AMPA和N-乙酰草甘膦的回收率在70到120％的可接受范围之内。N-乙酰AMPA具有一个126％的回收率，其在70到120％的可接受范围之上。然而，这些结果基于它们的一致性而被接受，并且对于每一加标水平的平均回收率值在70到120％的可接受之内，因此对于大豆种子中草甘膦和代谢物的分析建立了成功的方法确认。校准数据和示例性色谱未示出。草甘膦和代谢物的回收率数据在表58中给出。
表58.成功的大豆种子的草甘膦回收率总结试验2
试验1，葡萄 对于葡萄，在第一个试验(第2组)中获得成功的回收率数据。对于校准数据图，参考图31至图34，以及参考图35至图58，例如葡萄试验1的色谱。这些确认试验的回收率数据在表59中给出。
表59.成功的葡萄试验的回收率总结
结论 本研究证明了该分析法适用于大豆种子和葡萄中的草甘膦和代谢物的定量。该方法所述的0.05ppm的LOQ通过来自在两种基质中以该水平加标的对照的可接受的回收率值加以证明。在葡萄(0.2ppm)和大豆种子(20ppm)中所提出的草甘膦的容许限下可接受的方法性能通过在每一基质中以这些水平加标的对照样品所获得的可接受回收率加以证明。数据总结在表50-67中给出。
表50.在葡萄中草甘膦和N-乙酰草甘膦加标(回收率)数据总结
达到过多个有效数字的残余物值被用于计算回收率％。
在计算后，回收率％的值被四舍五入为最接近的整数并报告。
表51.在葡萄中AMPA和N-乙酰AMPA加标(回收率)数据总结
达到过多个有效数字的残余物值被用于计算回收率％。
在计算后，回收率％的值被四舍五入为最接近的整数并报告。
表52在大豆种子中草甘膦和N-乙酰草甘膦加标(回收率)数据总结
达到过多个有效数字的残余物值被用于计算回收率％。
在计算后，回收率％的值被四舍五入为最接近的整数并报告。
表53在大豆种子中AMPA和N-乙酰AMPA加标(回收率)数据总结
达到过多个有效数字的残余物值被用于计算回收率％。
在计算后，回收率％的值被四舍五入为最接近的整数并报告。








实施例5.使用LC/MS/MS测定各种基质中N-乙酰草甘膦及其它分析物的分析法 概述 开发出测定动物基质(包括乳、蛋、肌肉、肾脏、肝脏和脂肪)中N-乙酰草甘膦、草甘膦AMPA和N-乙酰AMPA的分析法。每一分析物以草甘膦当量计的方法目标定量限(LOQ)在蛋、乳和肌肉基质中为0.025mg/kg，而在肾脏、肝脏和脂肪基质中为0.050mg/kg。该方法分别以LOQ和10×LOQ水平验证。乳和蛋基质在0.025mg/kg(LOQ)、0.050mg/kg(2×LOQ)和0.5mg/kg(20×LOQ)验证。对于每一基质，使用LC/MS/MS系统，该系统采用电喷雾接口(ESI)以正或负离子模式检测进行操作。该分析法被开发来支持基因改造农作物注册所需的饲料研究中的残留物数据收集。
对于乳和蛋基质而言，基质样品在含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀释并摇动以在含水介质中稀释样品。样品可冷冻保藏或立即提取而没有冷冻。该稀释样品用己烷(如果冷冻的话在融化之后)和己烷分配并丢弃己烷层。剩余含水部分用二氯甲烷分配，并收集水层。二氯甲烷部分用另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)回提，用于分析物的定量回收。合并含水部分并稀释至最终体积50mL。一部分含水部分通过C18SPE柱体进行过滤。取决于待检测的基质和分析物，使用高分子阴离子交换(MAX)SPE柱体和/或高分子阳离子交换(MCX)SPE柱体，通过固相提取来进一步纯化C18过滤的提取物。在离子交换SPE纯化之前，用作内标的草甘膦和/或AMPA稳定同位素标准物被添加至提取物。在LC/MS/MS分析之前，过滤最终提取物。
对于动物组织基质，在0.1N HCl溶液(96％水/4％甲醇)继之以水中提取之前，基质样品最初与C18吸附剂材料混和(基质固相分散)，得到50mL的最终提取物体积。一部分提取物在乙腈和甲醇中稀释，以沉淀蛋白质，然后取决于待检测的基质和分析物，使用高分子阴离子交换(MAX)SPE柱体和/或高分子阳离子交换(MCX)SPE柱体，通过固相提取来进一步纯化。在离子交换SPE纯化之前，用作内标的草甘膦和/或AMPA稳定同位素标准物被添加至提取物。在LC/MS/MS分析之前，过滤最终提取物。
最终提取物和校准标准物溶液被调节至0.02M磷酸。以正离子LC/MS/MS模式操作，使用采用反相色谱的HPLC和具有电雾化源的三重四极质谱仪，分析样品和标准物。
分别以LOQ和更高水平加标的基质样品的回收率支持了该方法的令人满意的性能。表68-71总结了样品基质中N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的平均回收率结果。肝脏、脂肪和肌肉包括来自母牛和小鸡的样品。母牛是肾脏样品的来源。
表68
表69
表70
表71
材料 表72.设备
表73. HPLC/MS系统
试剂和标准物 表74.试剂
参考分析标准物 参考标准物由DuPont Crop Protection，E.I.du Pont de Nemours andCompany，Wilmington，DE供应。与参考标准物的表征和稳定性连同化学留样有关的信息由E.I.du Pont de Nemours and Company，DuPontCropProtection，Newark，Delaware归档。固体形式的参考标准物在室温下储存在通常存在干燥剂的干燥器中。用于内标的草甘膦和AMPA的稳定同位素标准物获自Dr.Ehrenstorfer GmbH(Atlanta，Georgia)。
分析法原理 对于乳和蛋商品而言，基质样品(2g)在含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀释并摇动以在含水介质中稀释样品。该稀释样品用己烷分配并丢弃己烷层。剩余含水部分用二氯甲烷分配，并收集水层。二氯甲烷部分用另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)回提，用于分析物的定量回收。合并含水部分并稀释至最终体积50mL。一部分含水部分通过C18SPE柱体进行过滤。取决于待检测的基质和分析物，使用高分子阴离子交换(MAX)SPE柱体和/或高分子阳离子交换(MCX)SPE柱体，通过固相提取来进一步纯化C18纯化的提取物。对于MAX SPE，一部分的C18洗脱物和内标用水稀释至20mL并施加于调节的SPE柱体。用甲醇/水(80/20)、在甲醇/水(80/20)中的0.1M乙酸和甲醇/水(95/5)顺序漂洗。在混合和过滤之后，该分析物在1％TFA在90％甲醇/10％水中的溶液中洗脱并且洗脱物被蒸发至干燥，然后在用于LC/MS/MS的最终溶液中恢复，用于草甘膦和N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的分析。对于MCX SPE，一部分的C18洗脱物和内标通过调节的SPE柱体继之以甲醇漂洗进行洗脱。从MCX SPE柱体收集负载和甲醇漂洗液，并蒸发甲醇，然后提取物稀释到含有0.02M磷酸的最终体积、混合并过滤，用于进行N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的LC/MS/MS，取决于样品基质。
对于动物组织商品，样品(2g)与C18吸附剂(4g)混和，直到组织被浸软和匀化(基质固相分散)。使用涡旋和机械摇动，在25mL 0.1N HCl溶液(96％水/4％甲醇)中提取预备的样品。在离心之后将提取溶液从样品倾析，然后样品用水再提取，用于分析物的定量转移，达到50mL的最终提取物体积。取决于待检测的基质和分析物，使用高分子阴离子交换(MAX)SPE柱体和/或高分子阳离子交换(MCX)SPE柱体，通过固相提取来进一步纯化提取物的等分试样。对于MAX SPE纯化，一部分的提取物在存在三乙胺的情况下在乙腈和甲醇中稀释(调节pH为碱性，以促进蛋白质沉淀和预备分析物，以加载在阴离子交换介质上)。在离心分离颗粒沉淀物之后，提取物溶液用甲醇稀释至大约20mL并加载在调节过的MAX SPE柱体上。用甲醇/水(80/20)、在甲醇/水(80/20)中的0.1M乙酸和甲醇/水(95/5)顺序漂洗。在混合和过滤之后，该分析物在1％TFA在90％甲醇/10％水中的溶液中洗脱并且洗脱物被蒸发至干燥，然后在用于LC/MS/MS的最终溶液中恢复，用于草甘膦和N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的分析。对于MCX SPE，一部分的提取物在乙腈和甲醇中稀释，以促进蛋白质沉淀。在离心分离颗粒沉淀物之后，提取物溶液用甲醇稀释至大约20mL并加载在调节过的MCXSPE柱体上。MCX吸附剂用甲醇漂洗，然后分析物在水中(4mL)继之以甲醇(4mL)中洗脱，用于定量回收。使在收集的洗脱物中的甲醇蒸发，并溶液被调节至包含0.02M磷酸的最终体积、混合并过滤，用于LC/MS/MS，进行AMPA分析。
在离子交换SPE纯化之前，用作内标的草甘膦和/或AMPA稳定同位素标准物被添加至提取物。最终提取物在0.02M磷酸水溶液中制备并在LC/MS/MS分析之前过滤(0.2μm)，以除去微粒，作为HPLC系统的预防性维护措施。磷酸在HPLC高分子固定相上作为弱离子配对剂，并用作最终溶液，以改善草甘膦LC/MS/MS性能(响应和线性)。通过使用苯基-己基分析柱的HPLC反相色谱，联接电喷射离子化作用，连同MS/MS检测一起，以获得2个分子离子跃迁(在正离子模式下，对于AMPA，仅监测1个离子跃迁)，解析分析物。使用单一分子离子跃迁进行定量分析。2个MS/MS碎片离子的相对丰度提供了草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的确认证据(负模式)。
分析步骤 试剂溶液的制备和稳定性 下列步骤可被调整，以制备不同的体积。
含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)提取溶液每升体积，添加40mL的甲醇，继之以0.96mL的甲酸至1-L刻度量筒并用HPLC级净化水稀释至最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
在水/甲醇(96/4，v/v)中的0.1 NHCl提取溶液每升体积，在1L量筒中添加水到至少一半体积，继之以8.3mL的浓HCl。添加40mL甲醇并用HPLC级净化水稀释至1L的最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每周制备一次。
80％或95％甲醇水溶液每升体积，分别添加800mL或950mL的甲醇至1L量筒并用HPLC级净化水稀释至最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
0.1m乙酸在80％甲醇/水中的溶液每升体积，添加5.73mL乙酸至在1L量筒中的200mL HPLC级净化水并用甲醇稀释至最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
0.25％氢氧化铵水溶液每升体积、添加10ml氢氧化铵溶液(最低25％)至小体积的HPLC级净化水，然后用HPLC级净化水稀释至最终体积。这是蛋和乳MAX SPE的调节溶液(12mL/样品，水稀释法)。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。注1ml25％氢氧化铵稀释至100ml≈0.25％NH4OH。
0.1％三乙胺(TEA)在甲醇/乙腈(75/25，v/v)中的溶液每升体积，添加1.0mL TEA至在1L量筒中的750mL甲醇并用乙腈稀释至最终体积。这是组织MAX SPE的调节溶液(12ml/样品，甲醇稀释法)。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
洗脱溶液，在90％甲醇/10％水中的1％TFA制备分析所需的足够体积。对于100mL体积，在100mL量筒中将1mL的三氟乙酸添加至约10mL的HPLC级净化水，然后用甲醇稀释至最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。对于每一样品，需要8ml的洗脱溶液(100mL制备液与要求96mL的12个样品相一致)。按需制备，不储存。
1.0M磷酸溶液每10ml体积，0.67ml浓磷酸(最小85％)被添加到在15-ml聚丙烯离心管中的HPLC级净化水中并用HPLC级净化水、采用管上梯度稀释至最终体积。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
样品和标准物最终溶液，0.02M磷酸水溶液每升体积，1.34ml浓磷酸(最小85％)被添加到在1L量筒中的HPLC级净化水中并用HPLC级净化水稀释至1000ml的最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
0.2M甲酸水溶液，含水流动相每升体积，8.3ml浓甲酸(98％)被添加到在1L量筒中的HPLC级净化水中并用HPLC级净化水稀释至1000ml的最终体积。转移溶液至干净的瓶子并盖上盖。溶液可在室温下储存并应该至少每月制备一次。
储备标准物制备和稳定性 如果可能，使用纯度大于95％的标准物。在分析天平上称最少大约10mg的标准物，该分析天平提供精确到三位有效数字的重量，或者标准物的量应该增加至满足该条件。
因为以草甘膦游离酸当量计确定残留物容许量，所以以草甘膦游离酸当量制备各种分析物的储备标准物溶液，以便以母体游离酸当量确定强化和回收率。需要时，通过添加适当量的标准物至100-ml容量瓶并用水稀释到最终体积，制备N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的各个游离酸当量储备标准物溶液。水是指HPLC级水或等效水。下列计算和实例提供了制备100mL的以草甘膦当量计的100μg/ml每一分析物储备溶液的指导。

N-乙酰草甘膦实例
对于每一分析物所称量的量应该为至少10mg。各分析物储备溶液浓度以草甘膦当量计可以超过100μg/ml。储备标准物溶液可以以较高的浓度(不超过1mg/mL)制备。应该观察到最低大约10mg的标准物重量和至少10ml的最终标准物体积。
内标制备和稳定性 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C15N(AMPA)稳定同位素标准物被提供于包含1.1ml标称浓度为100mg/L(μg/ml)的水溶液的琥珀色安瓿瓶中。将每一标准物溶液转入15mL聚丙烯离心管并用最初容器的HPLC级水稀释水漂洗液稀释至5mL体积，用于标准物的定量转移。储备标准物溶液的最终浓度为大约20μg/ml。通过分析大约500ng/ml的溶液，验证各标准物的同位素纯度。见图74。
通过以在100mL的0.02M磷酸水溶液或HPLC级净化水中0.1mL的比率稀释100μg/ml储备溶液，制备含有草甘膦和AMPA同位素的中间100ng/ml内标溶液。内标以50μL/mL包括在最终提取物和校准标准物溶液中。当250μL的内标被施加于5mL最终提取物中时，每100ml的100ng/ml标准物溶液可被用于高达400个样品。
具体地说，单独将100μg/ml标准物转移到15mL聚丙烯离心管并用最初容器的HPLC级水稀释水漂洗液稀释至5mL体积，用于标准物的定量转移。储备标准物溶液的最终浓度为大约20μg/ml。对于每一储备溶液，0.025mL的20μg/ml标准物溶液被转入自动进样器小瓶并用0.975mL的0.02M H3PO4稀释至1mL体积，以制备大约500ng/ml的单独溶液，用于纯度评价。
接下来，各20μg/ml标准物储备溶液的1.00mL试样被合并入单个250mL量筒并用0.02M H3PO4稀释至最终体积，以制备100ng/ml的混合溶液。100ng/ml IS溶液被转入250mL瓶。溶液被冷藏。(～4℃)。
中间体和加标标准物制备和稳定性 每一分析物的储备溶液被适当稀释入共同的容量瓶、用HPLC级净化水稀释至容量、盖上盖并充分混合。例如，将每种需要的分析物的1.00ml的100μg/ml储备溶液合并在10mL容量瓶中，并用水稀释至最终体积、盖上盖并充分混合。它在4℃或以下储存并每月更换。
储备溶液浓度将变化并且用于制备加标溶液所需的每一分析物储备溶液体积被调整，以获得如使用下列计算确定的正确的最终浓度。

例如，为从分别以草甘膦游离酸当量浓度计115μg/ml、186μg/ml、143和206μg/ml制备的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA储备溶液制备50mL的10μg/ml加标溶液，下列储备溶液体积被添加至50mL容量瓶。
草甘膦＝10μg/mL×50mL/115μg/mL＝4.35mL储备溶液 N-乙酰草甘膦＝10μg/mL×50mL/186μg/mL＝2.69mL储备溶液 N-乙酰AMPA＝10μg/mL×50mL/143μg/mL＝3.50mL储备溶液 AMPA＝10μg/mL×50mL/206μg/mL＝2.42mL储备溶液 10.0μg/mL加标溶液 每一储备溶液被适当用水稀释入容量瓶、盖上盖并充分混合。例如，将1.00ml的100μg/ml储备溶液合并在10mL容量瓶中，并用水稀释至最终体积、盖上盖并充分混合。它在4或以下储存并每月更换。1.0μg/mL加标溶液 10.0μg/ml加标溶液(优选的)或每一分析物的储备溶液用水适当稀释入容量瓶中。例如，将1.0ml的10.0μg/ml加标溶液转入10mL容量瓶，并用水稀释至容量、盖上盖并充分混合。它在4℃或以下储存并每月更换。
色谱标准物制备和稳定性 通过加标标准物或各储备标准物的稀释，制备校准标准物。在从大约50％的LOQ当量最终浓度至≥120％的最高预期最终样品浓度的范围内，最少5个校准标准物被推荐用于定量。N-乙酰草甘膦的LOQ当量最终浓度为1.0ng/ml。
例如，通过在0.02M磷酸水溶液中稀释100μL分别等分试样至10.0mL的最终体积，分别从1.0和10.0μg/ml加标溶液制备10.0ng/ml和100ng/ml的校准标准物(这模拟样品加标)。使用该方法，与样品加标同时制备校准标准物。
样品的来源(与表征) 全脂牛乳获自University of Delaware Agricultural Farm。乳品(全脂奶、脱脂乳和高脂奶油(heavy cream))和蛋获自当地超市。牛肝、肾、脂肪和肌肉获自牛饲养研究。家禽肝脏、脂肪和肌肉获自产蛋母鸡饲养研究。
样品的储存与制备 在二次取样之前，搅打整蛋。在二次取样之前，蛋白和蛋黄被分开并搅打。蛋品子样品(2g)被称入去皮重的50mL聚丙烯离心管。如果不立即分析子样品，则25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加、盖上盖、混合并冷冻样品。
全脂牛奶、全脂奶、脱脂乳或高脂奶油(heavy cream)子样品(2g)被称入去皮重的50mL聚丙烯离心管。如果不立即分析子样品，则25mlmL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加、盖上盖、混合并冷冻样品。
在冷冻器储藏之前，使用Waring商业食品处理机(Lab MicronizerModel 31FP93)，将动物组织样品与干冰一起磨碎。在研磨处理期间，样品被充分混合，以确保优良的浸软和均一性。在二次取样和冷冻器储藏之前，使干冰在通风橱升华或在冷冻机中过夜升华。
在样品提取和分析之前，全部冷冻的样品被储存在-20±5℃。样品加标方法 在提取容器(50mL离心管)中的未处理的基质对照样品根据需要被加标。10.0和1.0μg/ml加标标准物(参见上文)用来加标测试样品。表75被提供作为该研究中进行的加标实例。
表75
对于基质样品，将2.0±0.1g的样品称入干净的50ml离心管。对于乳和蛋品，在加标之后样品被温和地打漩或涡旋，以在样品中分散分析物。对于动物组织商品，使样品在通风橱中放置大约15分钟，以使加标溶液扩散。在加标之后，在提取和分析之前，乳和蛋样品在25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀释、冷冻并储存。
分析物提取方法 对于乳/蛋和动物组织商品，提供了单独的分析物提取方法。
乳和蛋商品 1.0 对于新制备的样品，样品被酌情加标并且在加标之后被温和地打漩或涡旋，以在样品中分散分析物。
2.0 对于新制备的样品，25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加至每一样品、盖上盖、涡旋混合大约5秒。样品可以被储存，用于过后冷冻。
3.0 如果样品冷冻储存，则样品在超声波浴中融化(大约15min)。注可以在样品架中，通过在管的上部适当保持覆盖，一起摇动样品。
4.0 20ml的己烷被添加至样品，盖上盖并温和地摇动至少30秒。
5.0 在足以分辨分配(上层的己烷、含水部分和形成的沉淀)的速度下离心样品10分钟。
6.0 在不干扰下层的水层的情况下，尽可能多的上层的己烷部分被移液管吸去，并且丢弃(剩余的己烷将并入下一步的二氯甲烷部分)。
7.0 20ml的二氯甲烷被添加至样品，盖上盖并温和地摇动至少30秒。
8.0 在足以分辨分配(上层的己烷、形成的沉淀和下层的二氯甲烷)的速度下离心样品10分钟。
9.0 在不干扰下层的沉淀和二氯甲烷部分的情况下，尽可能多的上层的含水部分被转入干净的50mL量筒(TC)。
10.0 20ml的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加至每一样品，盖上盖并温和地摇动至少30秒。
11.0 重复步骤8.0和9.0且提取物与50mL量筒中的第一提取物合并。
12.0 该合并的提取物在量筒中用含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)稀释至50mL或者如果提取物体积超过50mL，则该体积被调节至mL读数并记录最终体积。
13.0 通过来回倒提取物，将含水转入干净的50mL管或瓶，并最终转入干净的容器以混合。
肉组织商品 1.0 将2.0±0.1g的匀化组织在去皮重的50ml聚丙烯离心管中称重。
2.0 大约4g的C18吸附剂被添加至样品管(4g吸附剂相当于在15mL离心管中装满7mL)。
3.0 样品和C18吸附剂用抹刀充分混合，用于基质的固相分散。
4.0 25mL在96％水/4％甲醇中的0.1N HCl被添加、涡旋并在手动振荡器上摇动15min。
5.0 进行10min(最低3500rpm)的离心并通过配备有聚乙烯孔(frit)的容器将上清液倾析入50mL聚丙烯离心管。在全部提取物已经被添加之后短暂施加真空以开始过滤，然后破坏真空。
6.0 20mL的水被添加至样品颗粒，涡旋样品以重悬样品，离心，然后样品溶液通过具有纸孔(paper frit)的容器倾析入各自的50mL聚丙烯离心管。如果需要，在全部提取物已经被添加之后短暂施加真空以开始过滤，然后破坏真空。
7.0 共同的水体积被添加至每一样品颗粒以对于所有提取物实现最终提取物接近但小于50mL(通常8-10ml)。涡旋样品并倒入容器，施加真空以收集最终漂洗液。样品收集管被除去，而最终体积用水调节至50mL。样品提取物可以进行离心，并在涡旋之后倾析入容器以防止孔堵塞。该选择被推荐用于肌肉提取物。
分析物纯化方法 C18SPE过滤、MAX SPE和MCX SPE过滤方法被应用于乳(除了脱脂乳)和蛋商品样品提取物。
C18SPE过滤(全脂牛奶、奶油和蛋商品) 1.0 废料接收管被安装在真空歧管处，以收集调节溶液和初始的样品负载体积(废料接收管用来容纳含分析物的洗脱物和防止交叉污染)。
2.0 C18SPE(6cc/500mg，Varian#_12102052)柱体用～1mL甲醇、继之以2CV(CV≈6mL)的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)来调节。对于慢滴注速率(1-2mL/min)，在需要时施加真空或正压。
3.0 当最后的调节溶液进入吸附剂时，来自分析物提取方法步骤13.0的4.0mL含水样品提取物被添加在SPE柱上。
4.0 在滴注停止之后，移去废料接收管并安装干净的15mL离心管。添加来自分析物提取方法步骤13.0的10mL含水样品提取物、洗脱并收集洗脱物。将提取物盖上盖并涡旋混合。样品可以进行离心，以部分净化该溶液(细微粒需要较高的离心速度，例如7000rpm)。
MAX SPE 纯化(乳和蛋商品) 在蛋基质和脱脂乳中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的分析。在全脂牛奶或奶油中仅分析草甘膦。
1.0 0.25mL内标+2.5ml的C18纯化提取物被转入50mL刻度离心管并用HPLC级水稀释至大约20ml。
2.0 MAX SPE(6cc/500mg)柱体用1CV(柱体积，～6ml)的甲醇、继之以2CV 0.25％氢氧化铵在HPLC级水中的溶液来调节。
3.0 当最后的调节溶液进入吸附剂，装载样品提取物溶液。可能需要施加微小真空，但滴注速率保持缓慢。
4.0 在最后的样品溶液进入吸附剂之后，10mL的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被顺序添加，以漂洗SPE柱体。注10ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸被顺序添加到各自的倒空样品提取物管并从那里分配，进行样品提取物到SPE柱体的定量转移。最终10ml的95％甲醇/水漂洗以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱体。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以从SPE吸附剂除去过量的溶液，然后收集小瓶或管被安装在真空歧管中。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脱溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)通过重力给料而洗脱。在添加第二部分之前，在第一部分通过SPE柱体之后等待至少5分钟。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
7.0 样品从SPE槽除去，并使其在N-Evap上在45-50蒸发至完全干燥。注允许另外干燥15分钟，以确保TFA完全蒸发。
8.0 5.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至样品。盖上盖、涡旋混合、超声处理至少5min并涡旋混合。
9.0 一部分最终提取物溶液被添加入自动进样器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MAX SPE纯化(肉组织商品) 在肝和肾样品提取物中分析草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的。在肌肉样品提取物中分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。
1.0 1.25mL(脂肪、肾或肝)或2.5mL(肌肉)提取物被转移到15mL聚丙烯离心管并且0.1mL三乙胺(TEA)被添加至样品。注对于脂肪和肾样品，步骤1.0-3.0可以被合并，且所有稀释在50mL管中进行(步骤3.0)，因为对于这些基质几乎没有或没有沉淀形成。
2.0 5mL乙腈被添加至提取物等分试样、盖上盖并涡旋溶液。5mL的甲醇被添加至样品溶液，盖上盖、涡旋并使样品静置10min。
3.0 在足以形成样品颗粒得到速度下离心样品10min，并倾析入干净的50mL聚丙烯离心管，该离心管包含0.125mL内标。用7-8mL甲醇漂洗原来的管并与在50mL管中的提取物合并，达到大约20ml的最终体积。
4.0 MAX SPE(6cc/500mg)柱体用1CV(柱体积，～6ml)的甲醇、继之以2CV 0.1％TEA在甲醇/乙腈(75/25)中的溶液来调节。注需要大约12mL/样品的TEA溶液。
5.0 当最后的调节溶液进入吸附剂时，开始装载样品提取物溶液。优选重力洗脱，但对于缓慢滴注，可能需要微小真空。
6.0 在最后的样品溶液进入吸附剂之后，10mL的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被顺序添加，以漂洗SPE柱体。注10ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸应该被顺序添加到各自的倒空样品提取物管并从那里分配，进行样品提取物到SPE柱体的定量转移。最终10ml的95％甲醇/水漂洗以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱体。
7.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以从SPE吸附剂除去过量的溶液，然后收集小瓶或管被安装在真空歧管中。为了最快蒸发，可以使用平面、圆的或稍微倾斜的底部。
8.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脱溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)通过重力送料而洗脱。在添加第二部分之前，在第一部分通过SPE柱体之后等待至少5分钟。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
9.0 来自SPE槽的样品被除去，并使其在N-Evap上在45-50℃蒸发至完全干燥。注允许额外的15分钟干燥，以确保TFA完全蒸发。
10.0 2.5ml的0.02M磷酸水溶液被添加至样品。样品被盖上盖、涡旋混合、超声处理至少5min并涡旋混合。
11.0 一部分最终提取物溶液被过滤(0.2μm尼龙)入自动进样器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MCX SPE过滤纯化 分析蛋和脱脂乳中的AMPA。分析全脂牛奶或奶油中的AMPA、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA。
1.0 Oasis MCX SPE柱体(6cc/500mg，Waters#_186000776)用1CV(CV≈6mL)的甲醇和1CV含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)来顺序调节。轻微真空可以被施加来控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脱。真空被施加或持续，直到滴注停止。
2.0 15m l刻度离心管被安装在SPE柱体之下在真空歧管之中。
3.0 0.25mL的内标(仅对于AMPA分析)+4.0mL C18过滤的提取物被施加于MCX SPE柱体。在滴注停止之后，4.0mL的甲醇被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可以施加轻微真空。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
4.0 从真空歧管回收样品，并使样品在N-Evap上在45-50℃蒸发至4mL以下。
5.0 0.1mL的1.0M磷酸水溶液被添加并用5mL水稀释至最终体积。将最终提取物盖上盖并涡旋。最终体积可以被调节，以符合仪器的灵敏度要求，例如4mL的最终体积，包括0.08mL 1.0M磷酸水溶液，其中在先添加0.20mL的100ng/ml内标，将在LOQ下的最终浓度调节至2.0ng/mL。
6.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最终提取物被过滤(0.2μm尼龙)。最终溶液可在4或以下储存。
MCX SPE纯化(肉组织商品) 分析肌肉、肝脏、肾脏或脂肪商品中的AMPA。
1.0 2.5提取物被转入50mL聚丙烯离心管。5mL乙腈被添加至提取物等分试样，将样品盖上盖并涡旋。样品被离心10min。注在该溶液中可能没有观察到显著的沉淀，因为该溶液未被调节至碱性pH。
2.0 对于肌肉0.125ml内标(仅对于AMPA分析)被添加并且用甲醇稀释至大约20mL。
对于肝脏、肾脏、或脂肪0.25ml内标(仅对于AMPA分析)被添加并且用甲醇稀释至大约20mL。
3.0 Oasis MCX SPE柱体(6cc/500mg，Waters#_186000776)用1CV(CV≈6mL)的甲醇和1CV含水0.1N HCl在96％水/4％甲醇来顺序调节。轻微真空可被施加来控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脱。轻微真空可以被施加或持续，直到滴注停止。
4.0 稀释样品被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可施加真空。
5.0 2ml甲醇被添加至样品管、混合并添加到SPE柱体，用于定量转移和吸附剂漂洗。施加真空或正压，直到滴注停止。
6.0 15ml离心管被安装在SPE柱体之下在真空歧管之中。
7.0 4.0ml的HPLC级水被施加于MCX SPE柱体。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱体。如果需要，可施加轻微真空。正压或真空可被施加，以回收在SPE柱体上残余的甲醇。
8.0 对于肌肉从真空歧管回收样品，并使样品在N-Evap上在45-50℃蒸发至2.5mL以下。
对于肝脏、肾脏、或脂肪从真空歧管回收样品，并使样品在N-Evap上在45-50℃蒸发至4mL以下。
9.0 对于肌肉0.05mL的1M磷酸水溶液被添加并且用水稀释样品至2.5mL的最终体积。将最终提取物盖上盖并涡旋。对于肝脏、肾脏、或脂肪0.1mL的1M磷酸水溶液被添加并且用水稀释样品至5.0ml的最终体积。将最终提取物盖上盖并涡旋。
10.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最终提取物被过滤(0.2μm尼龙)。最终溶液可在4或以下储存。
仪器 Agilent HP 1100HPLC和Waters Quattro Premier或AB Sciex API5000三重四极质谱仪被用于LC/MS/MS分析。
典型的设备部件和操作条件如下 AgilentHP1100G1322A真空脱气器，G1311A四联泵，G1367A冷冻 HPLC 自动进样器，G1330A冷冻器，G1316A柱室 注射体积 25μL(可以改变以校正MS灵敏度)HPLC柱 Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl (15.0cm×4.6mm i.d.，3μm直径颗粒) 柱温40℃ 流动相A＝0.2M甲酸水溶液(正离子)或 0.05％甲酸(负离子) B＝甲醇 WatersQuattro ESI接口，MassLynx版本4SP4软件 Premier AB Sciex API 5000 ESI接口，Analyst版本1.42软件 接口电雾化(ESI) 极性正或负离子 模式MRM 表76.HPLC条件 大约的分析物保留时间(通过保留时间排序)如下 0.2M甲酸 0.05％甲酸 AMPA＝4.4min 4.4min 草甘膦＝ 4.9min 7.0min N-乙酰AMPA6.5min 10.0min N-乙酰草甘膦＝6.7min 11.0min 表77.Waters Quattro Premier质谱仪条件
在其它仪器上的质量赋值可能变化±0.5个原子质量单位。可调节停留时间来优化响应。
表78.Applied Biosystems/MDS Sciex API 5000质谱仪条件
校准步骤 使用标准质谱仪调谐并校准技术。如果需要建立对质量校准的信心(在数字控制之下的现代质谱仪通常不需要频繁的质量校准，尤其对于定量模式)，使用供应商推荐的校准溶液。可通过注入测试分析物来进行MS系统的优化调谐。该方法采用如上所述制备的外部标准物。
使用

函数AVERAGE、STDEV和RSD，基于外部校准标准物的平均响应因子(分析物峰面积响应/分析物浓度)进行仪器校准。对于平均响应因子校准，应该观察到小于或等于20％的％RSD。使用Excel函数SLOPE、INTERCEPT和RSQ得到的外部校准标准物的线性回归响应被监测，以建立校准曲线线性。有效定量的接受准则是(1)对于校准曲线，RSQ值＞0.99；和(2)对于各校准标准物响应因子，％RSD≤20％。可以使用包括有或者没有进行加权(例如1/X)的线性回归在内的可选方法，如果它们对校准标准物响应提供一当量以上一致性拟合的样品响应的话。
对于N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA，LC/MS/MS校准范围是0.25ng/ml至50.0ng/ml。对于AMPA，LC/MS/MS校准范围是0.5ng/ml至50.0ng/ml。通常，对于定量LC/MS/MS分析，分析最少5个校准溶液。
净回收率可以仅对于加标样品进行计算(对于现场样品则不可接受)。如果在对照样品中的残留物可以与至少3比1的信噪比响应整合，则可以通过从在加标样品中测量的mg/kg减去在对照样品中发现的mg/kg，计算净回收率。当对照残余＞LOQ的50％时，使用该对照以LOQ制备的回收样品无效。如果计算了净回收率，则那些结果必须被唯一地识别或存在于校正mg/kg的单独电子数据表列标题。
样品分析 常规进行至少2个校准标准物的初步运转，以证明适当的仪器响应并确保LC/MS/MS系统得到平衡。如果分析多组，则在所述组的最后一次和第一次注射之间进行溶剂空白注射，以最小化组间携带的风险。校准标准物分析在第一个样品分析之前并且在最后一次样品分析之后进行，如此样品分析被夹在外标校准之间。通常，注射顺序从最低到最高预期分析物浓度加以架构。校准标准物试验与测试样品掺杂进行，并且在各分析组中在每1-3个样品前后进行分析。如果储存的话，提取物和校准标准物被冷藏。通常，在分析组中，对于可接受的定量结果，需要加标样品回收率(70-120％)。
计算 方法 在动物基质中，N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA残余被测量为以草甘膦游离酸当量计的ppm(mg/kg)。定量基于平均响应因子，平均响应因子根据与样品提取物同时分析的多个校准标准物进行确定。使用以两位有效数字报告的不舍入的值，进行全部计算。加标样品回收率以近似整数百分比(％)报告。
确定通过平均响应因子分析在残余样品中发现的mg/kg的计算如下 无内标校准
有内标校准
其中， PA 是分析物峰面积， FV 是最终提取物体积(mL)， XV 是总提取物体积(mL)， RF 响应因子
RFIS 采用内标的响应因子
ARF 是来自该分析组中的标准物的平均响应因子， IS 是样品提取物中内标的峰面积， ARFIS 是来自该分析组中的标准物的采用内标的平均响应因子， AF 是等分试样因子(XV稀释至FV的mL)， SW 是提取的样品部分的样品重量(2.0g)，和 UC 单位换算 μg/1000ng×mg/1000μg×1000g/kg＝mg·g/1000ng·kg 来自加标样品的回收率百分比(以四舍五入的整数报告)如下计算
无内标的实例 以全脂牛奶LOQ加标的N-乙酰草甘膦，MCX清除 (RMLI MCX 012307)

以整蛋LOQ加标的N-乙酰AMPA，MAX清除(EG-0.025-3)

采用内标的实例 以全脂牛奶LOQ加标的草甘膦，MAX清除

结果和讨论 方法确认结果 检测器响应 采用正或负离子ESI和串联质谱法检测的三重四极质谱仪用于样品提取物分析。通过标准物溶液的分析，N-乙酰草甘膦、草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA的全扫描总离子色谱和光谱分别提供于图59至图62。
对于草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA在0.25-20ng/ml的范围内或者对于AMPA在0.5-50ng/ml的范围内，校准标准物一般产生校准标准物响应因子(峰面积/浓度)的％RSD＜20％的线性响应(r平方＞0.99)。使用来自确认组的校准标准物，绘制每一分析物的典型校准曲线，并在图63中给出。校准标准物的典型离子色谱提供于图64。来自对照的提取物、乳、蛋和组织基质的LOQ加标和10×LOQ加标样品提取物的典型离子色谱分别提供于图65至图73。
对照 在来自基质样品的对照提取物的色谱中，在N-乙酰草甘膦、草甘膦或N-乙酰AMPA洗脱的区域中，没有观察到显著的基质干扰。在对照小鸡肝脏(0.011mg/kg)和肌肉(0.003mg/kg)样品中，发现AMPA。
回收率(准确度与精度) 对于乳基质，典型的回收率结果提供于表80至表82；对于蛋基质，提供于表83至表85；而对于动物组织基质，提供于表86至表89。在每一加标水平下的平均回收率结果以及每一基质的总回收率结果提供于概要。来自每种商品的各个样品组分析的典型结果，包括校准标准物统计数字，提供于表90-101。
表80全脂牛奶确认结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 表81脱脂乳验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 na未分析 表82奶油验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 表83整蛋验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 表84蛋白验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 *AMPA数据点离群数据，未包括在回收率数据中 表85蛋黄验证结果
用作内标的草甘膦和AMPA稳定同位素 表86肝脏验证结果


草甘膦当量计的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 表87肾脏验证结果


草甘膦当量计的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 **结果离群数据，未包括在回收率统计数据中 表88脂肪验证结果


草甘膦当量计的mg/kg 表89肌肉验证结果


草甘膦当量计的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 **结果离群数据，未包括在回收率统计数据中 表90.典型的方法验证数据表 全脂牛奶(草甘膦)
表91典型的方法验证数据表
全脂牛奶(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表92典型的方法验证数据表
脱脂乳 表93典型的方法验证数据表
脱脂乳(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表94典型的方法验证数据表
奶油(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表95典型的方法验证数据表
奶油(草甘膦，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表96典型的方法验证数据表 整蛋-AMPA分析
表97典型的方法验证数据表
整蛋-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析 表98典型的方法验证数据表 母牛肌肉和肝脏-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析
表99典型的方法验证数据表 母牛肌肉-AMPA分析
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积。类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物)。SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb)。发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表100典型的方法验证数据表 母牛肾脏和脂肪-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积。类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物)。SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb)。发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表101典型的方法验证数据表 母牛肾脏-AMPA分析
注释

在70-110％之外的％Rec，下划线从样品中检测的面积减去对照中检测的面积。类型(B空白，S标准物，IS内标，C对照样品，F加标对照样品，T处理过的样品，FS加标标准物)。SW样品重量，XV提取物体积，AF等分试样因子，FV最终体积，RFIS对IS进行归一化的响应因子(分析物面积/IS面积/分析物ppb)，RF响应因子(分析物面积/分析物ppb)。发现的mg/kg＝(面积/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；发现的mg/kg(IS)＝(面积/IS面积/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
提取效率 使用本文描述的方法，提取在家禽代谢研究中用14CN-乙酰草甘膦处理的小鸡肝脏、脂肪和肌肉样品，用于提取效率的放射化学确认。一式两份的来自每一基质的2g子样品被提取，并且来自每一提取物的等分试样通过液体闪烁计数(LSC)进行分析，用于获得放射性回收率。使用原来的14CN-乙酰草甘膦测试物质的比活性(13.83μCi/mg＝30703dpm/μg)，将放射性回收率结果(dpm/g)转换为μg/g浓度，用于与家禽代谢研究中报告的回收率比较。肝脏、脂肪和肌肉各自的的回收率结果为在代谢研究提取中发现的μg/g浓度的98％、88％和104％。LSC数据和结果提供于表102。
表102.提取效率测定值
每一基质的两份样品被提取，并通过LSC(-1A，-1B)分析每一提取物的2个等分试样。
乳和蛋样品通常是液体基质，其在分配和固相提取SPE的纯化步骤之前稀释在水溶液中。对于这些基质，没有进行提取效率测试。
定量限(LOQ) 对于草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA的分析，在该方法中确定的LOQ在蛋在乳、蛋和肌肉基质中为0.025mg/kg(ppm)，而在肾脏、肝脏和脂肪基质中为0.050mg/kg。LOQ被定义为最低加标水平，在该水平下，达到70-110％的平均回收率和RSD＜20％。另外，在该加标水平，对于N-乙酰草甘膦，分析物峰一致地表现出约5-20比1的信噪比。
背景评价 串联质谱分析存在的背景水平最小。通常，样品提取物溶液和校准标准物溶液的色谱图显得相同。典型基质色谱提供于图65至图73。
检测限(LOD) LOD定义为在基质中响应相当于大约3比1的信噪比(s/n)的分析物浓度。对于各分析物，使用下列方程式，通过在LOQ加标样品中确定的sn响应，估计LOD。

每一分析物的显示s/n测定值和计算的估计值的各个色谱提供于图75-80。所检测的每一分析物和基质的LOD估计值在表79中总结。
表79 估计的LOD (草甘膦当量计的mg/kg) N-乙酰草甘 基质草甘膦 膦 AMPA N-乙酰AMPA 乳 0.0080.0050.0080.008 蛋 0.0030.0080.0060.007 肝脏0.0090018 0.0190.008 肾脏0.0040.0140.0090.008 脂肪0.0080.0150.0150.009 肌肉0.0040.0060.0080.006 观察到LOD偏差并且使用该方法的每一实验室应该估计LOD值。在再纯化或分析之前，冷冻储存的样品提取物应该解冻并超声处理大约15分钟。通常，设定LC/MS/MS结束试验，以便高百分比有机溶剂(99％甲醇)将在最终分析之后在低流率(0.025ml/min)下持续过夜，以保持HPLC泵和柱完好。
在蒸馏水中制备并储存在大约4℃的分析物储备标准物的稳定性显示出稳定一年以上。数据未示出。也在蒸馏水中制备的加标标准物应该在与储备溶液相同的时间周期内是稳定的。校准标准物在0.02M磷酸水溶液或80％对照基质/20％0.02M磷酸水溶液中制备，并且在大约4储存时显示出在至少2.7℃个月内是稳定的。
与测试分析物共洗脱，没有观察到可归因于玻璃器皿、试剂或基质的干扰。就在N-乙酰草甘膦以后，在m/z212→88MRM跃迁通道洗脱中，观察到峰，其可归因于MAX SPE吸附剂。
确证步骤 在ESI正或负离子模式下，监测到N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA的分子离子的两个独立的MS/MS跃迁。对于AMPA，仅仅在ESI负模式下监测到分子离子的两个独立的MS/MS跃迁。从校准标准物响应，确定两个碎片离子的相对响应值比(基础峰/二级峰)，用于证实基质样品中的分析物。可接受的证实标准是相比于在校准标准物中观察到的平均响应共洗脱峰(±5％)和当量离子比(±30％)在与样品同时分析的LOQ当量浓度以上。显示每一分析物的计算的响应比和保留时间的典型确证分析提供于表103-106。
表103.典型确证分析 全脂牛奶 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA

表104 整蛋 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA
表105 小鸡肝脏和肌肉 AMPA
表106 牛肝脏和肌肉 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA
结论 该分析法适于乳、蛋和动物组织基质中草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA残余的定量。结果证实，在乳、蛋和肌肉基质中以草甘膦当量计的LOQ为0.025mg/kg，而在肾脏、肝脏和脂肪基质中LOQ为0.050mg/kg。全部分析物的估计LOD值在乳、蛋和肌肉基质中以草甘膦当量计的LOQ小于或等于0.008mg/kg，而在肾脏、肝脏和脂肪基质中LOQ小于或等于0.019mg/kg。在所检测的全部基质中草甘膦的估计LOD小于或等于0.009mg/kg草甘膦当量。
在确认试验中，对于每一分析物和基质的各加标水平，平均回收率的范围为从76％(脱脂乳中，AMPA在0.50mg/kg)到110％(在蛋黄中，AMPA为0.025mg/kg)。各加标水平的最大标准偏差是16％(在肝脏中，N-乙酰AMPA为0.050mg/kg)。
基于保留时间、在样品分析期间检测的两个MS/MS母体-与-碎片离子跃迁的相对比，在LOQ和10×LOQ加标水平下，证明草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰草甘膦的残余确证。
冠词“一个(种)(a)”和“一个(种)(an)”在本文被用来指一个(种)或一个(种)以上(即，至少一个(种))该冠词在语法上的对象。例如，“一个(种)要素”是指一个(种)或多个(种)要素。如本文所使用，术语“约”，当涉及值时在一些实施方式中，旨在包括从所述量±20％的偏差，在一些实施方式中±10％的偏差，在一些实施方式中±1％的偏差，在一些实施方式中，±0.5％的偏差，以及在一些实施方式中±0.1％的偏差，因为这些偏差适于进行所披露的方法或使用所披露的组合物。
在说明书中提到的全部出版物和专利申请指示本发明有关的领域的普通技术人员的水平。全部出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同各出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
尽管为了清楚理解，上述发明通过例证和实例相当详细地进行了描述，但是明显的是，在所附权利要求的范围内，可以实践某些变化和修改。
权利要求
1.确定测试样品中N-乙酰草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述N-乙酰草甘膦的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含N-乙酰草甘膦的组合物；
c)色谱法分离所述N-乙酰草甘膦与所述组合物中的其它组分；和，
d)分析所述色谱法分离的N-乙酰草甘膦，以确定在所述测试样品中N-乙酰草甘膦的存在或含量。
2.权利要求1所述的方法，其中通过质谱仪进行分析所述色谱法分离的N-乙酰草甘膦。
3.权利要求1或2所述的方法，其中从所述测试样品色谱法分离所述N-乙酰草甘膦包括高效液相色谱(HPLC)柱。
4.权利要求2所述的方法，其中在色谱法分离所述N-乙酰草甘膦与所述组合物中的其它组分之前，足够浓度的磷酸被添加至所述包含所述N-乙酰草甘膦的组合物，其中所述足够浓度使得在检测期间N-乙酰草甘膦的响应和线性得以改善。
5.权利要求2所述的方法，其中从所述测试样品提取包含所述N-乙酰草甘膦的组合物包括选自下列的步骤
a)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含所述N-乙酰草甘膦的组合物；和，
ii)将所述提取的包含所述N-乙酰草甘膦的组合物布置在至少一种提取柱上，并从那里洗脱包含所述N-乙酰草甘膦的组合物；
或，
b)i)在允许所述N-乙酰草甘膦被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；和，
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的N-乙酰草甘膦；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述N-乙酰草甘膦。
6.权利要求6所述的方法，其进一步包括将来自权利要求5步骤(a)(ii)或(b)(iii)的所述洗脱的包含所述N-乙酰草甘膦的组合物布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱N-乙酰草甘膦。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中不进行所述N-乙酰草甘膦的衍生化。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其进一步包括确定在所述测试样品中氨甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰AMPA或草甘膦的存在或含量。
9.确定测试样品中N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述N-乙酰AMPA的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述N-乙酰AMPA的组合物；
c)分离所述N-乙酰AMPA与所述组合物中的其它组分；和，
d)分析所述分离的N-乙酰AMPA，以确定在所述测试样品中N-乙酰AMPA的存在或含量。
10.权利要求9所述的方法，其中分离所述N-乙酰AMPA包括色谱法分离所述N-乙酰AMPA与所述组合物中的其它组分，并通过质谱仪分析所述色谱法分离的N-乙酰AMPA。
11.权利要求10所述的方法，其中从所述测试样品色谱法分离所述N-乙酰AMPA包括高效液相色谱(HPLC)柱。
12.权利要求10所述的方法，其中在色谱法分离所述N-乙酰AMPA与所述组合物中的其它组分之前，足够浓度的磷酸被添加至所述包含所述N-乙酰AMPA的组合物，其中所述足够浓度使得在检测期间N-乙酰AMPA的响应和线性得以改善。
13.权利要求9-12任一项所述的方法，其中从所述测试样品提取包含所述N-乙酰AMPA的组合物包括选自下列的步骤
a)i)使用含水稀酸/甲醇溶液从所述测试样品提取包含所述N-乙酰AMPA的组合物；和，
ii)将所述提取的包含所述N-乙酰AMPA的组合物布置在至少一种提取柱上，并从那里洗脱包含所述N-乙酰AMPA的组合物；
或，
b)i)在允许所述N-乙酰AMPA被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；和，
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的N-乙酰AMPA；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述N-乙酰AMPA。
14.权利要求13所述的方法，其进一步包括将来自步骤13(a)(ii)或13(b)(iii)的所述洗脱的包含所述N-乙酰AMPA的组合物布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱N-乙酰AMPA。
15.权利要求9-14任一项所述的方法，其中不进行所述N-乙酰AMPA的衍生化。
16.权利要求9-15任一项所述的方法，布置进一步包括确定在所述测试样品中氨甲基膦酸(AMPA)、草甘膦或N-乙酰草甘膦的存在或含量。
17.确定测试样品中N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的组合物，所述提取包括选自下列的步骤
1)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取所述N-乙酰草甘膦或所述N-乙酰AMPA；
ii)将步骤(b)的所述提取的包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA；
或，
2)i)在允许所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的N-乙酰AMPA或结合的N-乙酰草甘膦；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦；
c)将来自步骤(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脱的N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱N-乙酰草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足够浓度的磷酸至步骤(c)所述的洗脱的N-乙酰草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间改善N-乙酰草甘膦的响应和线性；
e)使用苯基-己基高效液相色谱(HPLC)分析柱，色谱法分离N-乙酰草甘膦或所述所述N-乙酰AMPA与步骤(d)的其它组分；和，
f)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(e)的色谱法分离的样品，以确定N-乙酰草甘膦或所述N-乙酰AMPA在所述测试样品中的存在或含量。
18.确定测试样品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述草甘膦的组合物；
c)添加足够浓度的磷酸至步骤(b)的包含所述草甘膦的组合物，其中所述足够浓度允许在检测期间改善草甘膦的响应和线性；
d)色谱法分离所述草甘膦与所述组合物中的其它组分；和，
e)分析步骤(d)的色谱法分离的草甘膦，以确定在所述测试样品中草甘膦的存在或含量；
其中进行所述草甘膦的检测而不衍生化所述草甘膦。
19.确定测试样品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦的所述测试样品；
b)使用含水稀酸/甲醇溶液从所述测试样品提取包含所述草甘膦的组合物；
c)色谱法分离所述草甘膦与所述组合物中的其它组分；和，
d)分析步骤(c)的色谱法分离的草甘膦，以确定在所述测试样品中草甘膦的存在或含量；
其中进行所述草甘膦的检测而不衍生化所述草甘膦。
20.权利要求19所述的方法，其中在步骤(b)之后在步骤(c)之前，添加足够浓度的磷酸至步骤(b)的包含所述草甘膦的组合物，其中所述足够浓度允许在检测期间草甘膦的响应和线性得到改善。
21.权利要求19或20所述的方法，其中通过质谱仪进行分析所述色谱法分离的草甘膦。
22.权利要求19-21任一项所述的方法，其中从所述组合物色谱法分离所述草甘膦包括高效液相色谱(HPLC)柱。
23.权利要求19-22任一项所述的方法，其中从所述测试样品提取包含所述草甘膦的组合物包括选自下列的步骤
a)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含所述草甘膦的组合物；和，
ii)将所述提取的包含所述草甘膦的组合物布置在至少一种提取柱上，并从那里洗脱包含所述草甘膦的组合物；
或，
b)i)在允许所述草甘膦被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；和，
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的草甘膦；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述草甘膦。
24.权利要求23所述的方法，其进一步包括将所述提取柱的洗脱物或所述固相提取吸附剂布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱所述草甘膦。
25.确定测试样品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述草甘膦的组合物，所述提取包括选自下列的步骤
1)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取所述草甘膦；
ii)将步骤(1)(i)的所述提取的包含所述草甘膦的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱所述草甘膦；
或，
2)i)在允许所述草甘膦被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的草甘膦；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述草甘膦。
c)将来自步骤(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脱的草甘膦布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱草甘膦，其中所述阴离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含季铵的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足够浓度的磷酸至步骤(c)所述的洗脱的草甘膦，其中所述足够浓度允许在检测期间草甘膦的响应和线性得到改善；
e)使用苯基-己基高效液相色谱(HPLC)分析柱，色谱法分离草甘膦与步骤(d)洗脱物中的其它组分；和，
f)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(e)的色谱法分离的样品，以确定草甘膦或在所述测试样品中的存在或含量。
其中进行所述草甘膦的检测而不衍生化所述草甘膦。
26.确定测试样品中氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述AMPA的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述AMPA的至少一种的组合物；
c)色谱法分离所述AMPA与所述组合物中的其它组分；和，
d)分析步骤(c)的色谱法分离的AMPA的至少一种，以确定在所述测试样品中AMPA的存在或含量；
其中进行所述AMPA的检测而不衍生化所述AMPA。
27.权利要求26所述的方法，其中通过质谱仪进行分析所述色谱法分离的AMPA。
28.权利要求26-28任一项所述的方法，其中从所述组合物色谱法分离所述AMPA包括高效液相色谱(HPLC)柱。
29.权利要求26-28任一项所述的方法，其中在色谱法分离所述AMPA与所述组合物中的组分之前，足够浓度的磷酸被添加至所述包含所述AMPA的组合物，其中所述足够浓度使得在检测期间AMPA的响应和线性得以改善。
30.权利要求26-29任一项所述的方法，其中从所述测试样品提取包含所述AMPA的组合物包括选自下列的步骤
a)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取包含所述AMPA的组合物；和，
ii)将所述提取的包含所述AMPA的组合物布置在至少一种提取柱上，并从那里洗脱包含所述AMPA的组合物；
或，
b)i)在允许所述AMPA被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；和，
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的AMPA；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述AMPA。
31.权利要求30所述的方法，其进一步包括将所述提取柱的洗脱物或所述固相提取吸附剂布置在阳离子交换提取柱上，并从那里洗脱所述AMPA。
32.确定测试样品中氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含AMPA的所述测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述AMPA的组合物，所述提取包括选自下列的步骤
1)i)通过液-液提取法从所述测试样品提取所述AMPA；
ii)将步骤(1)(i)的所述提取的包含所述AMPA的组合物布置在C18提取柱上，并从那里洗脱所述AMPA；
或，
2)i)在允许所述AMPA被固相提取吸附剂结合的条件下，混合所述测试样品与所述固相提取吸附剂；
ii)通过液体/液体提取，提取所述固相提取吸附剂和来自所述样品的结合的AMPA；和，
iii)从所述固相提取吸附剂洗脱所述AMPA；
c)将来自步骤(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脱的AMPA布置在阳离子交换提取柱上，并从那里洗脱AMPA，所述阳离子交换柱具有这样的官能表面，其具有含磺酸取代基的间二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足够浓度的磷酸至步骤(c)所述的洗脱的AMPA，其中所述足够浓度允许在检测期间AMPA的响应和线性得到改善；
e)使用苯基-己基高效液相色谱(HPLC)分析柱，色谱法分离AMPA与步骤(d)的洗脱物中的其它组分；和，
g)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(e)的色谱法分离的样品，以确定AMPA或在所述测试样品中的存在或含量；
其中进行所述AMPA的检测而不衍生化所述AMPA。
33.确定在油测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)或氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一种的油测试样品；
b)添加足够浓度的磷酸至步骤(a)所述的测试样品，其中所述足够浓度允许在检测期间所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的响应和线性得到改善；
c)通过水-有机提取，从所述测试样品提取包含所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一种的组合物；和，
d)检测所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一种。
34.权利要求33所述的方法，其中所述检测包括
从所述组合物色谱法分离所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一种；和，
(b)分析所述色谱法分离的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一种，以确定在所述测试样品中所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一种的存在或含量。
35.权利要求33或34所述的方法，其中所述水-有机有机物提取包括二氯甲烷和磷酸分配。
36.权利要求34所述的方法，其中通过质谱仪进行分析所述色谱法分离的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA。
37.权利要求34或36所述的方法，其中从所述组合物色谱法分离所述N-乙酰草甘膦、所述AMPA、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦包括高效液相色谱(HPLC)柱。
38.确定在油测试样品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)或氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一种的测试样品；
b)添加足够浓度的磷酸至步骤(a)所述的测试样品，其中所述足够浓度允许在检测期间所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的响应和线性得到改善；
c)通过水-有机物分配，从所述测试样品提取包含所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一种的组合物；
d)使用苯基-己基高效液相色谱(HPLC)分析柱，从步骤(c)的所述组合物色谱法分离所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一种；和
e)通过以正离子模式操作的串联四极质谱仪分析步骤(d)的色谱法分离的样品，以确定在所述测试样品中所述AMPA、所述草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦的至少一种的存在或含量。
39.从AMPA纯化至少草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的方法，其包括
a)提供怀疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰AMPA、所述N-乙酰草甘膦或所述AMPA的至少一种的测试样品；
b)从所述测试样品提取包含所述N-乙酰草甘膦、所述草甘膦或所述AMPA的至少一种的组合物；和，
c)将步骤(b)的所述组合物布置在阴离子交换提取柱上，并从那里洗脱所述N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和草甘膦的至少一种，从而从所述AMPA纯化所述草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦；或，
将步骤(b)的所述组合物布置在阳离子交换提取柱上，并从那里洗脱所述AMPA，从而从所述AMPA纯化所述草甘膦、N-乙酰AMPA和所述N-乙酰草甘膦。
40.权利要求2、10、21、27或36任一项所述的方法，其中以正离子模式操作所述质谱仪。
41.权利要求5、17或30任一项所述的方法，其中所述液-液提取法包括用包含甲醇和稀酸的含水混合物提取。
42.权利要求1-41任一项所述的方法，其中所述测试样品来自于动物或环境样品。
43.权利要求42所述的方法，其中所述测试样品来自于植物。
44.权利要求43所述的方法，其中所述测试样品包括饲料、谷粒、稿秆、植物组织、固体处理部分基质、面粉、粗粉处理部分、干草、外壳、种子、粗粉、硬渣或淀粉。
45.权利要求1-44任一项所述的方法，其中所述测试样品包括固体基质样品。
全文摘要
本发明提供了各种方法和组合物，其允许确定在各种测试基质中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或氨甲基磷酸(AMPA)和它的各种代谢物的存在或含量。在一个方法中，确定测试样品中N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的存在或含量包括提供怀疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的测试样品；从所述测试样品提取所述N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA；和检测在提取物中的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。在其它方法中，确定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或氨甲基膦酸(AMPA)或其代谢物在测试样品中的存在或含量。所述方法包括提供怀疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或其代谢物的至少一种的测试样品；从所述测试样品提取所述草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一种；和从所述测试样品检测所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA和所述AMPA的至少一种；其中进行所述草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的检测而不衍生化所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或所述AMPA。
文档编号A01N57/00GK101646348SQ200880010069
公开日2010年2月10日 申请日期2008年3月25日 优先权日2007年3月27日
发明者F·Q·小布拉姆布尔, A·M·彭茨 申请人:纳幕尔杜邦公司