专利名称：：用于杀死孢子和装置消毒或灭菌的方法
技术领域：
：本发明涉及用于杀死或灭活微生物孢子、及用于装置和设备消毒或灭菌的酶促方法。
背景技术：
：已知由需氧的芽孢杆菌(Bacilli)、厌氧的梭菌(Clostridia)、选定的八叠球菌(sarcinae)和少数放线菌(actinomycetes)形成孢子。孢子类似某些植物种子，即它们不进行任何代谢反应。在这点上，它们尤其适合抵挡严峻的环境压力，而且已知在长时间暴露于热、干燥、辐射和毒性化学品后存活。这些特性使得孢子尤其难以在像会受到极端条件的不利影响的活组织或与活组织接触的物体的环境中一样被杀死。真菌、病毒和病原性细菌营养细胞在70°C在几分钟内被灭菌；许多孢子在100°C被灭菌。然而，有些腐生生物的孢子能在沸腾中存活几小时。热是当前最常用于确保孢子灭菌的手段。孢子的外壳由角蛋白样蛋白质(其占到孢子总蛋白质的多达80%)制成。正是这种蛋白质壳负责孢子对化学灭菌剂的抵抗力。微生物生命周期的孢子阶段以代谢休眠及对会在其营养阶段破坏微生物的环境因素的抵抗力为特征。细菌内生孢子和真菌孢子的萌发与代谢升高和对热和化学反应物的抵抗力降低有关。为了使萌发发生，孢子必须感到环境足以支持生长(vegetation)和生殖。简单的α氨基酸可刺激孢子萌发。EP500387中披露了酶促抗微生物组合物，其包含在存在过氧化物和商化物的情况中选择性结合于并抑制靶微生物生长的卤过氧化物酶，例如髓过氧化物酶、嗜曙红细胞氧化物酶、乳过氧化酶和氯过氧化物酶。WO95/27046披露了一种抗微生物组合物，其包含钒氯过氧化物酶、卤素离子、和过氧化氢或过氧化氢生成剂。WO96/38548披露了一种抗微生物组合物，其包含卤过氧化物酶、卤素离子、过氧化物生成剂和氨基酸类型。本发明提供了用于杀死或灭活孢子的改进的酶促方法。发明概述本发明提供了用于杀死或灭活微生物孢子的方法，包括使所述孢子接触卤过氧化物酶、过氧化氢源、氯和/或溴离子源、和铵离子源。另一方面，本发明提供了用于装置(优选医疗装置)消毒或灭菌的方法，包括使所述装置接触卤过氧化物酶、过氧化氢、氯和/或溴离子、和铵离子。在一个实施方案中，所述卤过氧化物酶是氯过氧化物酶或溴过氧化物酶。在另一个实施方案中，所述卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶。发明详述新寸氧北_禾口臓新寸氧北劲勿适合于掺入本发明方法的卤过氧化物酶包括氯过氧化物酶、溴过氧化物酶和展现氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。商过氧化物酶形成一类酶，其能够在存在过氧化氢或过氧化氢生成系统的情况中将卤化物(Cl-、Br-、I_)氧化成相应的次卤酸。卤过氧化物酶依据它们对卤离子的特异性来分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化自氯离子形成次氯酸盐、自溴离子形成次溴酸盐、和自碘离子形成次碘酸盐；而溴过氧化物酶催化自溴离子形成次溴酸盐和自碘离子形成次碘酸盐。然而，次碘酸盐经历自发歧化(spontaneousdisproportionation)成碘，因此观察到的产物是碘。这些次卤酸盐化合物可随后与其它化合物起反应，形成卤代化合物。在一个优选的实施方案中，本发明的卤过氧化物酶是氯过氧化物酶。已经自多种生物体分离了卤过氧化物酶哺乳动物、海洋动物、植物、藻类、地衣、真菌和细菌。普遍接受的是卤过氧化物酶是自然界中负责卤代化合物形成的酶，尽管可涉及其它酶。已经自多种不同真菌分离了卤过氧化物酶，特别是真菌组暗色丝孢菌类(dematiaceoushyphomycetes),如卡尔黑霄属(Caldariomyces)(例如烟色卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属(Alternaria)、弯孢属(Curvularia)(例如疣状弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢/德氏霉属(Drechslera)、细基格孢属(Ulocladium)和葡萄孢属(Botrytis)。已经自细菌分离了卤过氧化物酶，如假单胞菌属(Pseudomonas)例如吡咯菌素假单胞菌(P.pyrrocinia)和链霉菌属(Str印tomyces)例如金黄色链霉菌(S.aureofaciens)0在一个优选的实施方案中，所述卤过氧化物酶是自弯孢属菌种，特别是疣状弯孢或不等弯孢、如WO95/27046中记载的不等弯孢CBS102.42(例如由WO95/27046图2的DNA序列编码的钒卤过氧化物酶，都通过提述来并入)；或如WO97/04102中记载的疣状弯孢CBS147.63或疣状弯孢CBS444.70可得到的钒商过氧化物酶(即含有钒或钒酸盐的卤过氧化物酶)。优选地，所述卤过氧化物酶的氨基酸序列与自疣状弯孢(参见例如WO97/04102中的SEQIDNO2)或不等弯孢(例如由WO95/27046图2中的DNA序列编码的成熟氨基酸序列)可得到的卤过氧化物酶的氨基酸序列具有至少90%同一性、优选95%同一性。在另一个优选实施方案中，所述卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶；特别是钒氯过氧化物酶。所述钒氯过氧化物酶可以是自如WO01/79459中记载的Drechslerahartlebii、如WO01/79458中记载的Dendryphiellasalina、如W001/79461中记载的Phaeotrichoconiscrotalarie、或如WO01/79460中记载的棉丝菌菌种(Geniculosporiumsp.)可得到的。所述钒卤过氧化物酶更优选是自Drechslerahartlebii(DSM13444)、Dendryphiellasalina(DSM13443)>Phaeotrichoconiscrotalarie(DSM13441)^M1^菌菌种(DSM13442)可得到的。卤过氧化物酶的浓度通常在0.Ol-IOOppm酶蛋白质、优选0.05_50ppm酶蛋白质、更优选l_40ppm酶蛋白质、更优选0.l-20ppm酶蛋白质、和最优选0.5-10ppm酶蛋白质的范围内。在一个实施方案中，卤过氧化物酶的浓度通常在5_50ppm酶蛋白质、优选5_40ppm酶蛋白质、更优选8-32ppm酶蛋白质的范围内。卤过氧化物酶活件的测定可通过如下进行测定卤过氧化物酶活性的一种测定法混合100μ1卤过氧化物酶样品(约0.2μg/ml)和100μ10.3Μ磷酸钠ρΗ7缓冲液-0.5Μ溴化钾-0.008%酚红，将该溶液添加至10μ10.3%H2O2，并测量595nm处的吸收，作为时间的函数。通过测量290nm处吸收的降低(作为时间的函数)，可进行使用单氯双甲酮(SigmaM4632，ε=20000M"1cm"1,290nm)作为底物的另一种测定法。该测定法是在0.IM磷酸钠或0.IM乙酸钠、50μM单氯双甲酮、IOmMKBr/KClUmMH2O2和约1μg/ml卤过氧化物酶的水溶液中进行的。一个卤过氧化物酶单位(HU)定义为于pH5和30°C每分钟氯化或溴化1微摩尔单氯双甲酮。过氧化氢卤过氧化物酶所需要的过氧化氢可以作为用于原位生成过氧化氢的过氧化氢或过氧化氢前体的水溶液来提供。在溶解后释放商过氧化物酶可利用的过氧化物的任何固体实体能充当过氧化氢的来源。在水或适宜基于水的介质中溶解后产生过氧化氢的化合物包括但不限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烃基过氧化物、酰基过氧化物、过氧化酯、脲过氧化物、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。过氧化氢的另一种来源是过氧化氢生成酶系统，如氧化酶以及该氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的例子包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US6，248，575)和合适的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见例如WO95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸盐、半乳糖氧化酶(参见例如WO00/50606)和半乳糖、和醛糖氧化酶(参见例如WO99/31990)和合适的醛糖。通过研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._、禾口EC1.5.3._或相似的类(在国际生物化学联合会下)，本领域技术人员可容易地识别这样的氧化酶和底物组合的其它例子。可以在工艺开始或期间添加过氧化氢或过氧化氢源，例如通常以与0.OOlmM至25mM的水平、优选与0.005mM至5mM的水平、和特别是与0.Ol-ImM过氧化氢的水平对应的量添加。也可以以与0.ImM至25mM的水平、优选与0.5mM至15mM的水平、更优选与ImM至IOmM的水平、和最优选与2mM至SmM过氧化氢的水平对应的量使用过氧化氢。氯或溴离子根据本发明，与卤过氧化物酶反应所需要的氯或溴离子(Cl_或Br_)可以以许多不同方式来提供，如通过添加氯化物或溴化物的盐。在一个优选的实施方案中，所述氯化物或溴化物的盐是氯化钠(NaCl)、溴化钠(NaBr)、氯化钾(KCl)、溴化钾(KBr)、氯化铵(NH4Cl)或溴化铵(NH4Br)、或其混合物。在一个实施方案中，所述氯或溴离子只限于氯离子(Cl—)。所述氯离子可以通过将氯化物的盐添加至水溶液来提供。所述氯化物的盐可以是氯化钠、氯化钾或氯化铵、或其混合物。在另一个实施方案中，所述氯或溴离子只限于溴离子(Br_)。所述溴离子可以通过将溴化物的盐添加至水溶液来提供。所述溴化物的盐可以是溴化钠、溴化钾或溴化铵、或其混合物。氯或溴离子的浓度通常在0.OlmM至IOOOmM的范围内、优选在0.05mM至500mM的范围内、更优选在0.ImM至IOOmM的范围内、最优选在0.ImM至50mM的范围内、和特别是在ImM至25mM的范围内。当使用氯和溴两种离子时，氯离子的浓度独立于溴离子的浓度；反之亦然。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法、组合物和用途包括氯和溴离子；例如通过使用氯化物盐和溴化物盐的混合物来提供。在一个实施方案中，氯或溴离子的摩尔浓度是铵离子浓度的至少两倍、优选至少四倍、更优选至少六倍、最优选至少八倍、和特别是至少十倍。铵离子根据本发明方法杀死或灭活微生物孢子所需要的铵离子(NH4+)可以以许多不同方式来提供，如通过添加铵盐。在一个优选的实施方案中，所述铵盐是硫酸铵((NH4)2SO4)、碳酸铵((NH4)2C03)、氯化铵(NH4Cl)、溴化铵(NH4Br)、或碘化铵(NH4I)、或其混合物。铵离子的浓度通常在0.OlmM至IOOOmM的范围内、优选在0.05mM至500mM的范围内、更优选在0.ImM至IOOmM的范围内、最优选在0.ImM至50mM的范围内、和特别是在ImM至25mM的范围内。微牛物孢子根据本发明用卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、和铵离子杀死或灭活的微生物孢子包括所有种类的孢子。在一个实施方案中，所述微生物孢子是内生孢子，如所有梭菌属菌种(Clostridiumsp.)孢子、短芽孢杆菌属菌种(Brevibacillussp.)孢子和芽孢杆菌属菌种(Bacillussp.)孢子，例如来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、恶臭芽孢杆菌(Bacillusputida)、和短小芽孢杆菌(Bacilluspumila)的孢子。在另一个实施方案中，所述微生物孢子是外生孢子，如放线菌目(Actinomycetales)孢子，例如来自放线菌属菌种(Actinomycessp.)、链霉菌属菌种(Strcptomycessp.)、热放线菌属菌种(Thermoactinomycessp·)、糖单胞菌属菌种(Saccharomonosporasp.)和糖多孢菌属菌种(Saccharopylosporasp.)的孢子。在另一个实施方案中，所述微生物孢子是细菌孢子。细菌孢子的例子包括但不限于所有梭菌属菌种孢子和芽孢杆菌属菌种孢子，如上所述。在又一个实施方案中，所述微生物孢子是真菌孢子。真菌孢子的例子包括但不限于分生孢子，如来自曲霉属菌种(Aspergillussp.)、和青霉属菌种(Penicilliumsp.)的孢子。表面活性剂本发明的方法可包括表面活性剂(作为洗涤剂配制剂的一部分或作为湿润剂)的应用。适合于应用的表面活性剂可以是非离子的(包括半极性的)、阴离子的、阳离子和/或两性离子的；优选所述表面活性剂是阴离子的(如线性烃基苯磺酸酯、α-烯烃磺酸酯、烃基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α-硫代/磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂)或非离子的(如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烃基多糖苷、烃基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烃基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烃基衍生物(“葡糖酰胺”))、或其混合物。当包括在本发明方法中时，表面活性剂的浓度通常会是按重量计约0.01%至约10%、优选约0.05%至约5%、和更优选约0.至约1%。方法和用涂在第一个方面，本发明提供了一种用于杀死或灭活孢子的酶促方法，包括使所述孢子接触包括卤过氧化物酶、过氧化氢、氯和/或溴离子、和铵离子的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括卤过氧化物酶、过氧化氢、氯离子和铵离子。在另一个方面，本发明提供了一种用于装置(优选医疗装置)消毒或灭菌的方法，其包括使所述(医疗)装置接触所述组合物。所述组合物可配制成液体(例如含水的)或干产物配制剂。所述干产物配制剂可随后再水合以形成在本发明方法中有用的有活性的液体或半液体配制剂。当所述组合物配制成干配制剂时，组分可以是混合的、安排在离散的层中的或分开包装的。在第二个方面，本发明还涵盖一种组合物，其源自应用本发明的方法。在这种情况中，所述组合物包含商过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、铵离子和微生物孢子；或者包含卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、铵离子和医疗装置。本发明的方法对于已经暴露于孢子(如生物战争剂，例如能够引起炭疽的炭疽芽孢杆菌的孢子)的场所的去污是有用的。在本发明的语境中，术语“杀死或灭活孢子”意图指至少99%的孢子不能转化(萌发)成营养细胞。优选99.9%、更优选99.99%、最优选99.999%、和特别是99.9999%的孢子不能转化成营养细胞。在一个实施方案中，术语“消毒”指根据美国食品药品管理局2000年1月“ContentandFormatofPremarketNotification[510(k)]SubmissionsforLiquidChemicalSterilants/HighLevelDisinfectgrnts，，白勺根据本发明的方法可以在0-90°C、优选5-80°C、更优选10-70°C、甚至更优选15-60°C、最优选18-50°C、和特别是20_40°C的温度进行。在另一个实施方案中，本发明的方法可以在30_70°C、优选40_60°C的温度进行。本发明的方法可以采用10分钟至(至少)4小时、优选15分钟至(至少)3小时、更优选20分钟至(至少)2小时、最优选20分钟至(至少)1小时、和特别是30分钟至(至少)1小时的处理时间。本发明的方法适合于杀死或灭活多种环境中的孢子。本发明的方法可理想地用于任何环境中以降低孢子污染，如医疗保健产业(例如动物医院、人类医院、动物诊所、人类诊所、疗养所、儿童或老年居民的日间护理设施等)、食品工业(例如餐馆、食品加工厂、食品贮存场、杂货店等)、招待产业(例如旅馆、汽车旅馆、游乐胜地、游船等)、教育产业(例如学校和大学)，等等。由于本发明方法利用相对较低的温度，它们对于医疗保健产业中所使用的设备如医疗装置(例如干的手术设备、麻醉设备、器皿等)的消毒或灭菌是非常有用的。消毒或灭菌后的设备会展现降低的变形和磨损，而且该设备便于在消毒或灭菌后基本上立即使用。当对复杂的或热敏感的医疗装置如包含不同材料的超声换能器和内窥镜进行消毒或灭菌时，这是尤其有利的，因为这些装置的磨损显著降低，这导致这些常常是非常昂贵的装置有更长的使用寿命，这有效降低了它们的操作成本。实际上，通过使用本发明，可以有效地对甚至其它非医疗类型的设备如重复使用的卫生用品消毒或灭菌。在一个优选的实施方案中，医疗装置和/或非医疗类型的设备的消毒或灭菌在根据ENISO15883-1的(或如美国食品药品管理局2002年2月“ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:MedicalWasherandMedicalffasher-Disinfectors；GuidancefortheMedicalDeviceIndustryandFDAReviewStaff”中所记载的)(医疗)清洗机-消毒机中使用本发明的方法而进行。本发明的方法可理想地用于任何环境中以降低孢子污染，如一般房屋表面(例如地面、墙、天花板、家具外部等)、特殊设备表面(例如硬表面、制造设备、加工设备等)、纺织品(例如棉、毛、丝、合成纤维织物如聚酯、聚烯烃和丙烯酸酯类、纤维混合物如棉聚酯等)、木材和基于纤维素的系统(例如纸)、土壤、动物躯体(例如皮、肉、毛发、羽等)、食品(例如果实、植物、坚果、肉等)、和水。在一个实施方案中，本发明的方法针对纺织品的杀孢子处理。蜡状芽孢杆菌组的孢子已经被鉴定为纺织品的主要洗涤后污染物。如此，用本发明的组合物处理纺织品对于针对纺织品污染物的杀孢子活性是特别有用的。能用本发明组合物处理的纺织品的例子包括但不限于个人项目(例如衬衣、裤子、袜子、内衣等)、公共项目(例如毛巾、实验服、制服、围裙等)、招待项目(例如毛巾、餐巾、桌布等)。用本发明组合物对纺织品的杀孢子处理可包括使纺织品接触本发明的组合物。此接触可以在洗涤纺织品之前发生。或者，此接触可以在洗涤纺织品期间发生以提供杀孢子活性和任选地提供清洁活性以自纺织品消除或减少尘土、污渍等。本发明组合物所接触的孢子可以位于任何表面上，包括但不限于例如乳制品、化学品或药品加工厂中所使用的工艺设备、医疗装置如内窥镜或其它医疗器具、实验室设备、洗涤机、水卫生系统、油加工厂、纸浆加工厂、水处理厂、或冷却塔的表面。本发明的组合物应当以有效杀死或灭活所讨论表面上的孢子的量使用。通过将孢子浸没在组合物的含水配制剂中(例如洗涤过程)中，通过将组合物喷洒到孢子上，通过借助布将组合物应用至孢子，或通过技术人员认可的任何其它方法，可以使孢子接触本发明方法中所使用的组合物。任何将本发明的组合物应用于孢子，导致杀死或灭活所述孢子的方法是可接受的应用方法。本发明的方法对于已经暴露于孢子(例如病原性孢子)(如生物战争剂，例如能够引起炭疽的炭疽芽孢杆菌的孢子)的场所的去污也是有用的。此类场所包括但不限于衣物(如军服)、车辆(vehicle)内部和外部、建筑物内部和外部、任何种类的军事设施、和任何种类的上文所述环境。通过下列实施例进一步描述本发明，它们不应解释为限制本发明的范围。实施例作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂级的商业产品。在下列实施例中，符号“_”表示“未测定”。实施例1孢子牛成自球形芽孢杆菌(Bacillusglobigii)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)(苏云金芽孢杆菌模式株ATCC10792)的新鲜培养物在TryptoseBlodAgarBase(TBAB)板上划线。将培养物于30°C温育过夜。悬浮一满环来自TBAB板的纯芽孢杆菌，并将细胞悬浮在2mL无菌水中。用100μL细胞悬浮液每块板接种2xSG板。2xSG的组成如下16g/LDifco细菌用营养培养液、0.5g/LMgS04x7H20、2.Og/LKC1、1.0mL/100mL10%葡萄糖、0.lmL/lOOmLIMCa(NO3)2,0.lmL/lOOmL0.IMMnSO4UOμL/lOOmLO.OlMFeSO4JP1%Difco细菌用琼脂。将板于30°C温育48-72小时。用相差显微术检查孢子形成。孢子是明亮相的(phase-bright)0当孢子形成效率接近100%时，用水收获细胞苔，并通过强烈旋涡震动来悬浮细胞。通过于4°C以6000G离心5-10分钟来收集细胞。用冰冷的水清洗细胞3次。沉淀物含有营养细胞和孢子。应用分级密度梯度将孢子与营养细胞分开。为每份清洗后的沉淀物准备一个装有30mL43%Urographin的离心管。在Urographin中制备3mL细胞孢子混合物，使得最终的Urographin浓度为20%。将20%Urographin细胞/孢子混合物温和地加载到43%Urographin的顶层上。于室温以10000G离心30分钟。温和地除去上清液。在ImL冰冷的水中悬浮纯孢子沉淀物，并转移至微量离心管。于4°C以最大速度离心1-2分钟，将沉淀物在冰冷的水中再清洗2次。通过相差显微术和血球计检查纯度和孢子数/ml。将在水中悬浮的孢子保存于-20"C。实施例2杀死液体制备物中的芽孢杆菌属孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至6.0；-IXIO8个萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS-l-8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com),在MilliQ/K中悬浮；-IXIO8个苏云金芽孢杆菌孢子每mL(根据实施例1制备)，在MilliQ水中悬浮；-50mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-800mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。在管形瓶中混合下列各项IOyL孢子悬浮液，250μLDMG缓冲液，40μLNaCl溶液，40μL(NH4)2SO4溶液，禾口20μL卤过氧化物酶溶液。通过添加40μL过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于室温(大约23°C)温育110分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的100μL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每对一式两份板的菌落形成单位(CFU)的平均数(显示于表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1所示结果指示本发明的卤过氧化物酶溶液具有清楚且显著的杀孢子效果。处理后能够萌发的孢子的数目降低了至少5个对数单位。实施例3杀死不锈钢表面上的芽孢杆菌属孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM，ρΗ用NaOH调至7.0；-200mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在50mMDMG缓冲液中；_400mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-5%硫代硫酸钠(Na2S2O3)；-装有5mL溶于水中的Tween80和大约ImL玻璃珠(3mm)的管；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。实验使用每个装有IO6个萎缩芽孢杆菌孢子(RavenLabs产品目录编号1-6100ST)的不锈钢盘(一种处理用一个盘)。在管形瓶中混合下列组分373.75μLDMG缓冲液，31.25μLNaCl溶液，25μL(NH4)2SO4溶液，禾口20μL卤过氧化物酶溶液一个萎缩芽孢杆菌孢子盘(IO6个孢子)。通过添加50μL过氧化氢来起始反应。装有孢子盘和500μLDMG缓冲液的管形瓶充当对照。将管形瓶于40°C温育45分钟。为了终止反应，添加500μL硫代硫酸钠，并于室温(大约23°C)温育15分钟。然后将每个盘转移至装有Tween80和玻璃珠的管，并将管以300rpm摇动15分钟。此后，在Mi11iQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10—1至10_3的500μL涂布到LB琼脂板(14cm板)上。将来自100溶液的剩余液体(大约4.9mL)涂布到大LB板(正方形，2OX2Ocm板)上。将板于37°C温育48小时，并记录每个板上的菌落形成单位(CFU)的平均数(显示于表2)。表2稀释度萎缩芽抱杆菌孢子(板上”CFU)___对照处理_IO0(4.9tnL)__1000__0__IO'1(500μ)__200__0__IO'2(500μ)__200__0__IO'3(500μ)__100__0_处理后盘上剩下的孢子的λ^,^Zll1，000，000个孢子/盘0个孢子/盘_计算数_____表2所示结果指示本发明的卤过氧化物酶溶液具有清洗且显著的杀孢子效果。处理后能够萌发的孢子的数目降低了6个对数单位。实施例4杀死表面制备下列试剂-商业清洁剂(pH7.0)，用水稀释成指定的工作溶液；-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH调至7.0；-200mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在50mMDMG缓冲液中；_400mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-5%硫代硫酸钠(Na2S2O3)-装有5mL溶于水中的1%Tween80和大约ImL玻璃珠(3mm)的管；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。实验使用每个装有IO6个萎缩芽孢杆菌孢子(RavenLabs产品目录编号1-6100ST)的不锈钢盘(一种处理用一个盘)。如表3所示制备三个管形瓶。通过添加50μL过氧化氢来起始管形瓶1和管形瓶2中的反应。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将来自表3的管形瓶于40°C温育30分钟。为了终止反应，添加500μL硫代硫酸钠，并于室温(大约23°C)温育15分钟。然后将每个盘转移至装有Tween80和玻璃珠的管，并将管以300rpm摇动15分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_3的500μL涂布到LB琼脂板(14cm板)上。将板于37°C温育48小时，并记录每个板上的菌落形成单位(CFU)的平均数(显示于表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>孢子的计算数表4所示结果指示本发明的卤过氧化物酶溶液具有清洗且显著的杀孢子效果，这在当溶液与商业清洁剂一起使用时得到增强。单独用卤过氧化物酶溶液处理后能够萌发的孢子的数目降低了4个对数单位。若溶液与商业清洁剂一起使用，能够萌发的孢子的数目降低了4-5个对数单位。实施例5用氯化物、溴化物和铵离子的组合杀死孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-IXIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS-1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；-40mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-500mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；-IOOOmM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；_500mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-5%(w/v)硫代硫酸钠(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。在管形瓶中根据表5混合试剂。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通过添加过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于40°C温育30分钟。通过添加500μL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许反应15分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的100μL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每套板上的菌落形成单位每板(CFU/板)的平均数(显示于表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表6所示结果指示向卤过氧化物酶/氯化物/铵溶液添加溴化物将杀孢子效果增强至少1个对数单位。处理后能够萌发的孢子的数目比只用氯化物/铵/卤过氧化物酶溶液处理时多降低了至少1个对数单位。实施例6麻酬列白·/氯釘魏荆包_腳子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-IXIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS-1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-5%(w/v)硫代硫酸钠(Na2S2O3),在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。在管形瓶中根据表7混合试剂。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通过添加过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于22°C温育30分钟。然后通过添加500μL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许反应15分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的100μL(—式两份)涂到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每套板上的菌落形成单位每板(CFU/板)的平均数(显示于表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>所示结果指示杀生物效果或多或少地独立于溴化物浓度，但是倾向于低溴化物/氯化物比例具有略微更好的杀死效果。实施例7杀死处于多种DH倌的液体制备物中的芽孢杆菌属孢子制备下列试剂-磷酸盐缓冲液IOOmM,具有下列pH值pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.4和pH8.0；-BrittonRobinson缓冲液lOOmM，pH8.5；-1XIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。在管形瓶中根据表9混合试剂。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通过添加过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于室温(大约22°C)、于40°C或于50°C温育30分钟。然后通过添加500μL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许反应10分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的100μL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每对一式两份板的菌落形成单位(CFU)的平均数(显示于下文表10-12)。表10温育温度=22°C。用卤过氧化物酶/氯化物/铵溶液处理的孢子在每个稀释度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表11温育温度=40°C。用卤过氧化物酶/氯化物/铵溶液处理的孢子在每个稀释度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表12温育温度=50°C。用卤过氧化物酶/氯化物/铵溶液处理的孢子在每个稀释度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结果汇总于下文表13。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表13所示结果指示卤过氧化物酶/氯化物/溴化物/铵溶液具有清洗且显著的杀孢子效果。在所有3个测试温度，该效果在pH范围6.5-7.4中处于其最大值。实施例8在不同H2C^浓度杀死孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-1XIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中-25mM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸钠(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。在管形瓶中根据表14混合试剂。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>通过添加过氧化氢来起始反应。装有10iiL孢子悬浮液和490uLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于室温(大约23°C)温育30分钟。通过添加500PL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许于室温反应10分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的lOOiiL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每对一式两份板上的菌落形成单位每板(CFU/板)的平均数(显示于表15)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表15的结果显示了用2_5mMH2O2实现了最高杀死效果，指示这是这些实验条件下的最佳过氧化氢浓度。范围ImM-IOmM中的所有浓度都给出可接受的去污性能。实施例9以不同比例的氯化物/溴化物/铵恒定的卤过氧化物酶浓度杀死孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-1XIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-500mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中；-20mM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-25mM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸钠(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。遵循前述实施例的方法和原理，使用上述溶液制备500μL反应混合物。在装有下列各项的管形瓶中进行孢子处理-OmM/O.5mM/lmM/5mM溴化物(Br)；-0mM/25mM/50mM/66.7mM/100mM/150mM氯化物(CD；禾口-OmM/O.lmM/lmM/5mM/10mM/16.7mM/25mM/50mM/100mM铵(NH4+)的各种组合；禾口_8ppm卤过氧化物酶；-2mMH2O2；-2XIO7个孢子；-IOmMDMG缓冲液；禾口-MilliQ水，加至500μL通过添加过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于室温(大约23°C)温育30分钟。通过添加500μL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许于室温反应10分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_5的lOOiiL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每套板上的菌落形成单位每板(CFU/板)的平均数。使用CFU/mL值，以对数单位计算孢子杀死，并将结果显示于表16。表16以对数单位计的孢子杀死<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>氯化物/溴化物/铵的比例影响性能；一般而言，溴化物/铵摩尔比1/10给出最高杀死效果。氯化物浓度越低，达到满意的孢子杀死效果所需要的溴化物和铵浓度越低。用下列各项获得了最佳孢子杀死性能[氯化物]彡25mM；0.ImM^[溴化物]彡ImM；禾口5mM彡[铵]彡25mM。实施例10以不同比例的氯化物/溴化物/铵和以不同的卤过氧化物酶/过氧化氢浓度杀死孢子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.O；-1XIO9个萎缩芽孢杆菌孢子每mL(萎缩芽孢杆菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见W097/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；_500mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化铵(NH4C1)，在MilliQ水中；-25mM过氧化氢(H202)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸钠(Na2S203)，在MilliQ水中；禾口-自在1000mL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板。遵循前述实施例的方法和原理，使用上述溶液制备500uL反应混合物。在管形瓶中进行反应。各组分的终浓度显示于表17。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>卤过氧化物酶/过氧化氢的比例与实施例6中发现为最佳的相同。通过添加过氧化氢来起始反应。装有10μL孢子悬浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充当对照。将管形瓶于60°C温育30分钟。通过添加500μL硫代硫酸钠来淬灭反应，这容许于室温反应10分钟。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至IO5的100μL(—式两份)涂布到LB琼脂板上。将板于33°C温育48小时，并记录每套板上的菌落形成单位每板(CFU/板)的平均数。使用CFU/mL值，以对数单位计算孢子杀死，并将结果显示于表18。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>用下列各项获得了最佳孢子杀死性能[卤过氧化物酶]=32ppm；5mM彡[氯化物]彡20mM；OmM彡[溴化物]彡2mM；禾口2.5mM彡[铵]彡5mM。实施例11盲菌孢子牛成在MEA板上培养须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)ATCC9233，而在MEA斜面上培养黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC9642。如下用去离子水制备MEA培养基30g/L麦芽提取物、3g/L大豆蛋白胨(Sojapeptone)(胃蛋白酶消化物或大豆粉)、琼脂15g/L，pH未调节。在MEA皮氏皿的中心接种须毛癣菌，并于30°C温育10_12天。然后将板用含0.02%Tween80的M9缓冲液覆满，并通过用Drigalski刮刀温和地操作菌丝体团/丛(mycelialmatt)将孢子制成悬浮液。然后将细胞悬浮液经Miracloth过滤以除去菌丝，并随后通过在血球计中计数来确定孢子数。在实验中使用此孢子悬浮液。用M9+0.02%Tween收获旺盛地形成孢子的黑曲霉斜面，并将含有孢子的液体经无菌Miracloth过滤以除去菌丝。M9的组成如下在MilliQ水中溶解8.77g/L磷酸氢二钠(Na2HP0，2H20)、3g/L磷酸二氢钾(KH2P04)、4g/L氯化钠(NaCl)、0.2g/L硫酸镁(MgS04，7H20)。随后通过在血球计中计数来测定孢子数，并将孢子悬浮液调至大约1X107个孢子/mL。在实施例中使用此孢子悬浮液。孢子悬浮液于4°C最多保存4天。实施例12m^Mmm^mMmm^mmMmm^m制备下列试剂-黑曲霉ATCC9642孢子悬浮液，1X107个孢子/mL；-须毛癣菌ATCC9233孢子悬浮液，1X107个孢子/mL；-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，100mM,pH用NaOH调至7.0；-100mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见W097/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化铵(NH4C1)，在MilliQ水中；-10mM过碳酸钠(2Na2C033(H202))，在MilliQ水中；禾口-如下制备YPD板在1000mL水中溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g右旋糖、20g琼脂，pH未调节。在管形瓶中根据表19混合试剂。所使用的孢子都是新鲜制备的(即没有于4°C贮藏任何时间段)。表19SSj须毛_菌黑曲霉—__JiL__mM,终__μι__mM,终_NaCl__47^__19__4X5__19_NaBr__5__05__5__0.5_NH4Cl__15__6__15__6_DMG缓冲液__125__25__125__25_卤过氧化物醉__40__8ppm__40__8ppm_过碳酸納__3^5__O1^J__315__0.67_孢子悬浮液__50__IxlO^__50__IxlO6_HsO__184__-__184__-终体积I500I-I500丨-在1.8mLNUNC冷冻管中混合除过碳酸盐以外的所有试剂，添加孢子，并通过添加过碳酸盐溶液来起始实验。将管于40°C(在热块中)温育30分钟。30分钟温育后，向每个管添加500μL无菌水，并制备10倍稀释系列。将来自未稀释样品的200μL和来自每种稀释度的100μL涂布到YPD板上。将板于30°C温育2-4天，并计算CFU/mL。将50μL孢子悬浮液添加至450μL无菌水，随后制备稀释系列，涂布100μL/板并确定CFU/mL，充当生长对照。曲霉属孢子是疏水性的，而且难以获得孢子的均质悬浮液。表20显示了所记录的CFU/板和计算的CFU/ml，以及孢子杀死(对数单位)。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>毛癣菌属孢子被完全灭活，而对曲霉属孢子的处理导致可存活孢子数降低3个对数单位。实施例13对贮藏的真菌孢子的真菌孢子杀死制备下列试剂-黑曲霉ATCC9642孢子悬浮液，1XIO7个孢子/mL，于4°C贮藏2天；-须毛癣菌ATCC9233孢子悬浮液，1XIO7个孢子/mL，于4°C贮藏2天；-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-100mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM过碳酸钠(2Na2C03·3(H2O2))，在MilliQ水中；禾口-如下制备YPD板在IOOOmL水中溶解IOg酵母提取物、20g蛋白胨、20g右旋糖、20g琼脂，pH未调节。在管形瓶中根据表21混合试剂。表21须毛痺菌黑，審___μι__mM,终__yJL__mM,终_NaCl__14Z5__19__1415__19_NaBr__15__05__15__0.5NH4Cl145I6145I6DMG缓冲液__375__25__375__25_^__120__8ppm__120__8ppm过碳酸納__m05__067__1005__0.67_^rf__150__IxlO6__150__IxlO6_H2O__552__-__552__-终体积丨1500丨-丨1500I-在1.8mLNUNC冷冻管中混合除过碳酸盐以外的所有成分，添加孢子，并通过添加过碳酸盐溶液来起始实验。将管于40°C(在热块中)温育30分钟。30分钟温育后，制备10倍稀释系列。将来自每个稀释度的333μL涂布到YPD板上。将板于30°C温育2_4天，并计算CFU/mL0将50μL孢子悬浮液添加至450μL无菌水，随后制备稀释系列，涂布100μL/板并确定CFU/mL，充当生长对照。表22显示了所记录的CFU/板和计算的CFU/ml，以及孢子杀死(对数单位)。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>对毛癣菌和曲霉孢子二者的处理都导致可存活孢子数至少5个对数单位的降低。实施例14^mmmm^卜.的枯草芽孢杆菌包子制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH调至7.0；-磷酸盐缓冲液，IOOmM,pH用NaOH调至7.0；-200mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见WO97/04102)，在50mMDMG缓冲液中；-400mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化铵(NH4Cl)，在MilliQ水中；-40mM过氧化氢(H2O2)，在MilliQ水中；-10%硫代硫酸钠(Na2S2O3)；-合成硬水，40°dH；和-商业非离子表面活性剂的200x稀释液。其它材料-装有5mL溶于水中的1%Tween80和大约ImL玻璃珠(3mm直径)的管；-自在IOOOmL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板；-Nunc冷冻管；-可调式加热块；和-实验使用以IO6个枯草芽孢杆菌ATCC19659孢子(PresqueIsleCultures，产品目录编号SP-BS)涂覆的聚酯缝合线(一条缝合线用于一种处理)。在Nunc冷冻管中混合下列组分50μL磷酸盐缓冲液，12.5μLNaCl溶液，25μLNH4Cl溶液，160μL卤过氧化物酶溶液，500μL合成硬水40°dH,15.4μL200χ稀释的非离子表面活性剂，37.liiLMilliQ水，和一条枯草芽孢杆菌孢子涂覆的聚酯缝合线(106个孢子)。如上所述制备阴性对照，只是卤过氧化物酶溶液用MilliQ水代替。随后通过添加200uL过氧化氢来起始反应。将管形瓶于40°C温育20分钟。为了终止反应，添加500uL硫代硫酸钠，并于室温(大约23°C)温育10分钟。然后将每条缝合线转移至装有溶于水的Tween80和玻璃珠的管，并将管以300rpm摇动15分钟以回收剩余的孢子。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_3的lOOiiL涂布到LB琼脂板(14cm板)上。将板于37°C温育48小时，并记录每个板上的菌落形成单位(CFU)的平均数。使用菌落数来计算可回收细菌数的对数降低(杀死)，显示于表23。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例15■■运器卜趟荆包_不好__制备下列试剂-DMG缓冲液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH调至7.0；_200mg/L来自疣状弯孢的卤过氧化物酶(参见W097/04102)，在50mMDMG缓冲液中；_400mM氯化钠(NaCl)，在MilliQ水中；-lOOmM硫酸铵((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-10mM过氧化氢(H202)，在MilliQ水中；-50mM溴化钠(NaBr)，在MilliQ水中；禾口-5%硫代硫酸钠(Na2S203)。其它材料-装有5mL溶于水中的1%Tween80和大约lmL玻璃珠(3mm直径)的管；-自在1000mL水中溶解的37gLB琼脂(Merck0283)制备LB板；-Nunc冷冻管；-可调式加热块；和-实验使用每个装有106个萎缩芽孢杆菌孢子(RavenLabs产品目录编号1-6100ST)的不锈钢盘(一个盘用于一种处理)。在Nunc冷冻管中混合下列组分478μLDMG缓冲液，7.5μLNaBr(在没有NaBr的实验中用DMG缓冲液代替)，47μLNaCl溶液，38μL(NH4)2SO4溶液，30μL卤过氧化物酶溶液，和一个萎缩芽孢杆菌孢子盘(IO6个孢子)。为了测试溴化钠对杀死功效的影响，在有和无NaBr的这两种情况中进行实验。在后一项实验中，NaBr用DMG缓冲液代替。如上所述制备阴性对照，只是卤过氧化物酶溶液用DMG缓冲液代替。随后通过添加150μL过氧化氢来起始反应。将管形瓶于40°C温育20分钟。为了终止反应，添加750μL硫代硫酸钠，并于室温(大约23°C)温育10钟。然后将每个盘转移至装有溶于水中的Tween80和玻璃珠的管，并将管以300rpm摇动15分钟以回收剩余的孢子。此后，在MilliQ水中制备稀释系列，并将来自稀释度10°至10_3的100μL涂布到LB琼脂板(14cm板)上。将板于37°C温育48小时，并记录每个板上的菌落形成单位(CFU)的平均数。使用菌落数来计算可回收细菌数的对数降低(杀死)，显示于表24。表24对数降低(对数单位)阴性对照0处理(无NaBr)I处理(有NaBr)>3自对照筒回收的孢子的数目IO5个孢子/缝合线权利要求一种用于杀死或灭活微生物孢子的酶促方法，其包括使所述孢子接触卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、和铵离子。2.权利要求1的方法，其中所述卤过氧化物酶是来自酶类EC1.11.1.10的氯过氧化物酶。3.权利要求1的方法，其中所述商过氧化物酶是含有钒的商过氧化物酶。4.权利要求3的方法，其中所述卤过氧化物酶的氨基酸序列与自疣状弯孢(Curvulariaverruculosa)(Curvulariainequalis)nT^tHW的氨基酸序列具有至少90%同一性、优选95%同一性。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述氯或溴离子是自氯化物或溴化物的盐得到的；优选所述氯化物或溴化物的盐是氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化铵或溴化铵、或其混合物。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述铵离子是自铵盐得到的；优选所述铵盐是硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、氯化铵、溴化铵或碘化铵、或其混合物。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中氯离子浓度是铵离子浓度的至少两倍；优选至少四倍、更优选至少六倍、最优选至少八倍、和特别是铵离子浓度的至少十倍。8.权利要求1-7中任一项的方法，其进一步包括使所述孢子接触表面活性剂。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述微生物孢子是真菌或细菌孢子。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述过氧化氢是自过碳酸盐得到的。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述孢子位于表面上，如纺织品表面或实验室或工艺设备或医疗装置的表面。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中使所述孢子接触氯和溴离子。13.—种组合物，其包含卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、铵离子和医疗装置。14.一种用于装置消毒或灭菌的方法，包括使所述装置接触卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、和铵离子。15.权利要求14的方法，其中所述卤过氧化物酶是来自酶类EC1.11.1.10的氯过氧化物酶。16.权利要求14的方法，其中所述卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶。17.权利要求16的方法，其中所述卤过氧化物酶的氨基酸序列与自疣状弯孢或不等弯孢可获得的卤过氧化物酶的氨基酸序列具有至少90%同一性、优选95%同一性。18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述氯或溴离子是自氯化物或溴化物的盐得到的；优选所述氯化物或溴化物的盐是氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化铵或溴化铵、或其混合物。19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述铵离子是自铵盐得到的；优选所述铵盐是硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、氯化铵、溴化铵或碘化铵、或其混合物。20.权利要求14-19中任一项的方法，其中氯离子浓度是铵离子浓度的至少两倍；优选至少四倍、更优选至少六倍、最优选至少八倍、和特别是铵离子浓度的至少十倍。21.权利要求14-20中任一项的方法，其进一步包括使所述装置接触表面活性剂。22.权利要求14-21中任一项的方法，其中所述过氧化氢是自过碳酸盐得到的。23.权利要求14-22中任一项的方法，其中所述装置是医疗装置。24.权利要求14-23中任一项的方法，其中使所述装置或医疗装置接触氯和溴离子。25.卤过氧化物酶、过氧化氢、氯化物盐和/或溴化物盐、和铵盐用于杀死或灭活孢子的用途。26.根据权利要求25的用途，用于医疗装置消毒。27.根据权利要求26的用途，其中将所述医疗装置灭菌。28.根据权利要求27的用途，其中所述卤过氧化物酶是含有钒的氯过氧化物酶。29.根据权利要求25-28任一项的用途，在清洗机_消毒机中使用。全文摘要本发明提供了通过使孢子接触卤过氧化物酶、过氧化氢、氯或溴离子、和铵离子来杀死或灭活所述孢子的方法。文档编号A01N63/00GK101827527SQ200880112289公开日2010年9月8日申请日期2008年10月23日优先权日2007年10月23日发明者斯蒂芬·达尼尔森,比约恩·E·克里斯滕森,玛丽·奥尔森-霍尔姆,莫滕·格杰曼森申请人:诺维信公司