专利名称：螨过敏原之变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明系关于家尘螨Der ρ 2过敏原之新颖变体及其用途。
背景技术：
长久以来，已知家尘螨系诸多疾病之肇因，诸如，气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、及/或血管性水肿(Sporik R，Chapman MD, Platts-Mills ΤΑ. House dust mite exposure as a cause of asthma. Clin Exp Allergy 1992 ；22 (10) 897-906.) ο 特定言之，欧洲尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是一种主要的家尘螨，且已进行了许多研究辨识其所产生之过敏原。于此，Der ρ 2已被认定为欧洲尘螨所产生的代表性过敏原。超过80%之过敏病患皆会与Der ρ 2产生反应(Lind P， Lowenstein H. Identification of allergens in Dermatophagoides pteronyssinus mite body extract by crossed radioImmunoelectrophoresis with two different rabbit antibody pools. Scand J Immunol 1983 ； 17 (3) :263-73 ；Heymann PW, Chapman MD, Aalberse RC, Fox JW, Platts-Mills TA. Antigenic and structural analysis of group II allergens(Der f II and Der ρ II)from house dust mites (Dermatophagoides spp). J Allergy Clin Immunol 1989 ；83 (6) :1055-67.)。Der ρ 2在天然环境下具有长期安定性(de Boer R，van der Hoeven WA, Stapel SO. The decay of house dust mite allergens, Der ρ I and Der ρ II， under natural conditions. Clin Exp Allergy 1995 ；25 (8) :765-70.)，且其对热、 pH、及各种化学变性处理皆具有抗性(Lombardero M，Heymann PW，Platts-Mills TA， Fox JW, Chapman MD. Conformational stability of B cell epitopes on group I and group II Dermatophagoides spp.allergens. Effect of thermal and chemical denaturation on the binding of murine IgG and human IgE antibodies. J Immunol 1990 ； 144(4) :1353-60. )。Der ρ 2 之三维结构已由 NMR(Mueller GA，Benjamin DC， Rule GS. Tertiary structure of the major house dust mite allergen Der ρ 2 sequential and structural homologies. Biochemistry 1998 ；37 (37) :12707-14.)及 X 光结晶学(Derewenda U，Li J，Derewenda Z，Dauter Z，Mueller GA, Rule GS et al· The crystal structure of a major dust mite allergen Der ρ 2，and its biological implications. J Mol Biol 2002 ；318(1) :189-97.)判定。特定言之，Der ρ 2 具有免疫球蛋白(Ig)折叠结构，含两个反平行β片层。此外，Der ρ 2缺乏可连接Ig样结构域中的 B链及F链之间的片层间二硫键；而是在残基8与119、残基21与27、以及残基73与78之间存在有三个二硫键。此在，残基8与119之间的二硫键使A'链及G'链彼此连结，而另外两个二硫键则是位在环区域。Der ρ 2之cDNA序列已完成鉴定，而其推导出来的氨基酸序列显示Der ρ 2具有 146个氨基酸残基，并具有一段含17个残基的信号肽。此外，已经发现Der ρ 2之DNA序列中存在大量的多型性(Chua KY，Huang CH，Shen HD，Thomas WR. Analysis of sequencepolymorphism of a major mite allergen, Der ρ 2. Clin Exp Allergy 1996 ；26 (7) 829-37 ；Smith WA, Hales BJ, Jarnicki AG, Thomas WR. Allergens of wild house dust mites !environmental Der ρ land Der ρ 2sequence polymorphisms. J Allergy Clin Immunol 2001 ; 107 (6) :985-92.)。目前为止，已鉴别出八种Der ρ 2变体，其在所述多型性残基处各自具有独特的氨基酸取代(Hales BJ, Hazell LA, Smith W, Thomas WR. Genetic variation of Der ρ 2allergens :effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy 2002 ；32 (10) :1461-7.)。此等变体可用于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏之试剂。
发明内容
我们藉由筛选欧洲尘螨λ gtIlcDNA库，分离出新颖过敏原「Der ρ 2变体Τ」之 cDNA。在此，本发明鉴定出Der ρ 2变体T cDNA之核苷酸序列，且在大肠杆菌(E. coli)及毕氏酵母(Pichia pastoris)中制造重组Der ρ 2变体T多肽。Der ρ 2变体T可用于疾病之诊断及治疗。在第一态样中，本发明提供一种聚核苷酸，其系由编码氨基酸序列SEQ ID Ν0:1之核苷酸序列构成。在第二态样中，本发明提供一种重组核酸，其包含编码氨基酸序列SEQ ID Ν0:1之核苷酸序列。在第三态样中，本发明提供一种转基因生物，其包含上述之聚核苷酸或重组核酸。在第四态样中，本发明提供一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。在第五态样中，本发明提供一种诊断个体对家尘螨之过敏的方法，其包含检测该个体是否会与上述多肽产生反应。在第六态样中，本发明提供一种诊断个体对家尘螨之过敏的组合物，其包含上述多肽以及稀释剂。在本发明之第七态样中，其提供一种治疗或预防个体之过敏性疾病的方法，其包含对该个体投与上述多肽。在第八态样中，本发明提供一种医药组合物，其包含上述多肽以及医药可接受之赋形剂或载体。在第九态样中，本发明提供一种DNA疫苗，其包含上述聚核苷酸或重组核酸。
前述的发明内容以及前述的实施方式，可在结合附呈的图式阅读时更为明了。就说明本发明之目的而言，图式显示的是目前较佳的具体实例。然而，应明了的是，本发明并不限于所示的较佳具体实例。在附图中图1表示本发明Der ρ 2变体T之cDNA核苷酸序列以及其推导氨基酸序列。图2表示Der ρ 2. 0101之cDNA分子的核苷酸序列(登录号AF276239)以及其推导氨基酸序列(登录号P49278)。图3显示Der ρ 2变体T与Der ρ 2. 0101之核苷酸序列间的排列比较，其中在核苷酸序列之上方及下方所指出的氨基酸残基分别为Der ρ 2变体T及Der ρ 2. 0101之独特氨基酸取代；起始及终止密码子画有底线；符号“ · ”表示相同的核苷酸；符号“_”表示间隔；而阴影部分则表示3’未翻译核苷酸序列。图4显示SDS-PAGE分析之结果，其中第1道代表取自大肠杆菌表达系统之 GST-Der ρ 2. 0101融合蛋白；第2道代表取自大肠杆菌表达系统之GST-Der ρ 2变体T融合蛋白；第3道代表取自毕氏酵母表达系统之GST-Der ρ 2. 0101蛋白；第4道代表取自毕氏酵母表达系统之GST-Der ρ 2变体T蛋白；而M代表分子量标记物。图5系关于IgE点渍免疫分析，其中(A)显示加在硝基纤维素膜上的蛋白样本之位置，包括GST-Der ρ 2. 0101融合蛋白、GST-Der ρ 2变体T融合蛋白、GST肽、及欧洲尘螨萃取物；(B)显示免疫分析之结果，编号1至50各自表示取自所述50名病患之血清样本； 以及(C)显示由光密度计所定量的蛋白样本IgE反应性程度。
具体实施例方式除非另外定义，本文中所用之所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了之相同意义。在本文中，除非另有明示，下列之术语具有其所述意义。在本文中，冠词「一」系指一个或一个以上(亦即，至少一个)该冠词在文法上之受词。举例而言，「一组件」意谓一个组件或一个以上之组件。术语「聚核苷酸」或「核酸」系指由核苷酸单元所构成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，诸如，脱氧核糖核酸(「DNA」)或核糖核酸(「RNA」)，以及核酸类似物，包括具有非天然存在之核苷酸者。聚核苷酸可由合成产生，例如，使用自动化DNA合成仪。术语 「核酸」一般而言系指大型聚核苷酸。应明了的是，当一核苷酸序列系由DNA序列表示(亦即，A、T、G、C)，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中以「U」取代「Τ」。术语「cDNA」 系指与mRNA互补或相同之DNA，其可为单股或双股形式。术语「互补」系指两聚核苷酸交互作用表面有拓扑兼容性或相互配对。因此，该两分子可被视为互补，两者的接触表面特征彼此互补。如第一聚核苷酸的核苷酸序列与第二聚核苷酸之聚核苷酸结合配对物的核苷酸序列相同，则可称为第一聚核苷酸与第二聚核苷酸互补。因此，序列为5' -TATAC-3'之聚核苷酸系与序列为5' -GTATA-3'之聚核苷酸互补。术语「编码」系指聚核苷酸(如，基因、cDNA、或mRNA)中之特定核苷酸序列的固有特性，其可在在生物作用中作为模板，以合成其他具有指定核苷酸序列(亦即，rRNA、tRNA、 及mRNA)或指定氨基酸序列以及其由其所产生之生物特性的聚合物或巨分子。因此，如由一基因所产生之mRNA的转录及翻译可在细胞或其他生物系统中产生一蛋白，则称该基因编码该蛋白。所属技术领域的技术人员可明了的是，由于遗传密码之简并性，不同的聚核苷酸及核酸可编码相同的多肽。亦可明了的是，使用常规技术，所属技术领域的技术人员可制造出核苷酸取代，其不影响本文所述聚核苷酸所编码之多肽序列，而反映出用以表达该等多肽之任何特定宿主生物的密码子使用偏好。因此，除非另有明示，「编码一氨基酸序列之核苷酸序列」包括所有互为彼此简并版本且编码相同氨基酸序列之核苷酸序列。编码蛋白及RNA之核苷酸序列可包括内含子。术语「重组核酸」系指具有非天然彼此连结之序列的聚核苷酸或核酸。重组核酸可以载体之形式存在。「载体」可含有想要的指定核苷酸序列以及调控序列。载体可用于表达该指定核苷酸序列或是维持该指定核苷酸序列以进行复制、操纵、或在不同位置间传输 (如，在不同之生物间)。可将载体导入适当的宿主细胞，以进行上述目的。载体之实例包括，但不限于，质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、YACs或PACs。一般而言，在载体中，指定的核苷酸序列是以可操作之方式与调控序列连结，因而使得载体在被导入宿主细胞中时，指定核苷酸序列可受调控序列之控制而在宿主细胞中表达。调控序列可包含，例如但并不限于，启动子序列(如，巨细胞病毒(CMV)启动子、猴病毒40(SV40)早期启动子、T7启动子、及醇氧化酶基因(AOXl)启动子)、起始密码子、复制起点、增强子、操作子序列、分泌信号序列(如，α-交配因子信号)、以及其他控制序列(如，Shine-Dalgarno 序列及终止序列)。较佳者，载体可进一步包含标记序列(如，抗生素抗性标记序列)，以进行后续之筛选流程。更佳者，在载体中，指定的核苷酸序列可与另一非上述调控序列之核苷酸序列连结，以产生一融合多肽，其有利于后续之纯化流程。融合多肽包括，但不限于，融合 His-标签之多肽，以及融合GST之多肽。术语「多肽」系指由经肽键连结之氨基酸残基所构成的聚合物。多肽可由合成产生，例如，使用自动化多肽合成仪。术语「蛋白」一般而言系指大型之多肽。术语「肽」一般而言系指短型之多肽。氨基酸可由三个字母或一个字母表示。表1列述标准之氨基酸缩写。表1:标准氨基酸缩写
权利要求
1.一种聚核苷酸，其由编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列构成。
2.如权利要求1所述的聚核苷酸，其中该核苷酸序列为SEQID NO :2。
3.—种重组核酸，其包含编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的重组核酸，其中该核苷酸序列为SEQID NO :2。
5.如权利要求3所述的重组核酸，其为载体。
6.如权利要求5所述的重组核酸，其为表达载体。
7.如权利要求4所述的重组核酸，其为载体。
8.如权利要求7所述的重组核酸，其为表达载体。
9.一种转基因生物，其包含如权利要求1或2所述的聚核苷酸，或是如权利要求3至8 中任一项所述的重组核酸。
10.如权利要求9所述的转基因生物，其为细菌、昆虫、真菌、哺乳动物、或植物细胞。
11.如权利要求10所述的转基因生物，其为大肠杆菌(Escherichiacoli)、乳酸杆菌 (Iactobacilli)、或双歧杆菌(bifidobacteria)。
12.如权利要求10所述的转基因生物，其为酵母菌细胞。
13.如权利要求12所述的转基因生物，其为毕氏酵母(Pichiapastoris)。
14.如权利要求9所述转基因生物，其为多细胞真菌。
15.如权利要求14所述的转基因生物，其为蘑菇。
16.如权利要求15所述转基因生物，其为金针菇。
17.如权利要求19所述的转基因生物，其为植物。
18.如权利要求17所述转基因生物，其为稻米、西红柿、或香蕉。
19.一种多肽，其包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
20.一种诊断个体对家尘螨的过敏的方法，其包含检测该个体是否会与如权利要求19 所述的多肽产生反应。
21.如权利要求20所述的方法，其中该个体罹患气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、及/或血管性水肿。
22.如权利要求20所述的方法，其中该检测使用活体外之免疫分析进行。
23.如权利要求22所述的方法，其中该免疫分析在取自该个体之样本上进行，并用以测定该样本是否带有对该多肽具有反应性之抗体。
24.如权利要求23所述的方法，其中该样本取自该个体之血清。
25.如权利要求23所述的方法，其中该抗体是IgE。
26.如权利要求20所述的方法，其中该检测使用皮肤点刺试验进行。
27.如权利要求沈所述的方法，其中该皮肤点刺试验包含将该多肽施用于该个体之皮肤上，点刺该个体之皮肤，并观察该皮肤上是否产生发炎反应。
28.—种诊断个体对家尘螨的过敏的组合物，其包含如权利要求19所述的多肽以及稀释剂。
29.一种治疗或预防个体的过敏性疾病的方法，其包含对该个体投与SEQ ID N0:1之多肽。
30.如权利要求四所述的方法，其中该过敏性疾病与家尘螨有关。
31.如权利要求四所述的方法，其中该过敏性疾病是气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、或血管性水肿。
32.—种医药组合物，其包含如权利要求1所述之多肽，以及医药可接受之赋形剂或载体。
33.如权利要求32所述的医药组合物，其用于如权利要求四、30、或31所述的方法。
34.如权利要求32所述的医药组合物，其为疫苗的形式。
35.一种DNA疫苗，其包含如权利要求1或2的聚核苷酸，或是如权利要求3至8中任一项所述的重组核酸。
全文摘要
本发明系关于一种名为欧洲尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)之家尘螨的第二群过敏原之新颖变体(称为Der p 2变体)，及其用途。该新颖变体具有不同于其他已知Der p 2变体之cDNA及蛋白序列变异。
文档编号A01H5/00GK102307894SQ200880132578
公开日2012年1月4日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者林克亮, 蔡考圆, 郭奕君, 黄琼慧 申请人:蔡考圆