专利名称：转导iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及小鼠模型，具体涉及一种转导全长型iASPP-FL(full-length iASPP-FL，iASPP-FL-FL)癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途。
背景技术：
目前，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。随着社会经济的发展，肿瘤的发病率呈上升趋势。所以针对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究成为迫切亟待解决的问题。越来越多的研究发现，肿瘤的发生可能起源于最初的肿瘤干细胞，而肿瘤干细胞的可能来源于调控异常的正常干细胞，这两者之间的转化研究，对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究为肿瘤的治疗，预防提供了新的思路， 成为目前临床与基础研究的热点课题。多能造血干细胞的生长发育与分化成各系功能血细胞的过程受许多不同基因表达调控，当这些调控信号或造血干祖细胞所处的微环境的发生改变，都可能对造血干细胞的功能和发育产生影响。造血干祖细胞受到遗传学损伤累积，引起增殖失控，分化与凋亡之间的平衡被打破后就可能会导致恶性血液系统肿瘤的发生。造血细胞的增殖失控、分化能力的丧失将可能导致细胞的恶性转化及白血病的发生。p53作为迄今为止发现的最重要的抑癌基因，被称作“基因组的护卫者”，通过激活下游p21、14-3-3o表达引起受损细胞周期停滞启动修复损伤，防止肿瘤发生。p53突变后的细胞，常常引起染色体不稳定，发生癌变的机率增加。在超过一半罹患实体肿瘤的患者中存在P53缺失或点突变，但在血液系统恶性疾病中仅有15%。之前研究发现，除p53基因本身的异常外，恶性肿瘤的发生发展过程中还与P53的调节异常有关，譬如肉瘤患者中常见的MDM2异常，该基因是一个p53的拮抗基因，作为泛素连接酶，通过负反馈的方式促进p53 泛素化，加速P53降解。但是，这种蛋白降解的方式在白血病患者中仅个别存在，许多白血病特异性的融合蛋白，如AML1-ET0、PML-RAR α等融合蛋白通过增加ρ53募集组蛋白脱乙酰化酶，使Ρ53脱乙酰化，造成ρ53易于降解，降低ρ53的稳定性，从而逃逸ρ53依赖的肿瘤监视机制。上述研究提示急性白血病不仅有别于其他恶性实体肿瘤，而且本身有很大的异质性，部分患者可能存在Ρ53的其他调节途径异常，导致ρ53功能的缺失。ASPP (Apoptosis Stimulating Proteins of P53)是新近发现的一类 p53 凋亡调控蛋白，主要包括 ASPPl、ASPP2 和 iASPP (inhibitor of ASPP)，分别由 PPP1R13B、TP53P2 和PPP1R13L编码。该家族蛋白C端都包含有如下三个结构锚蛋白重复序列，SH3结构域和脯氨酸富集区。ASPP蛋白通过锚蛋白重复序列，SH3结构域结构区与目的蛋白如P53家族蛋白结合，P53与ASPP的结合位点，如第181位精氨酸突变，也是人类乳腺和宫颈癌P53 的高突变位点。根据其对P53的调控作用又可分为两类，一类为P53正性调控分子，包括ASPPl 和ASPP2，两者N端序列高度同源，它们主要表达于哺乳动物细胞胞浆并且在功能上极为相似，与P53蛋白结合后，能促进p53对Bax等凋亡相关基因的转录，促进p53的促凋亡作用。 与P53相互作用时，更倾向于与P53DNA结合区结合。另一类为负性调节分子，即iASPP，它在N端结构上不同于前两者。与P53结合时，与P53脯氨酸富集区的亲和力大于其DNA结构域，它是该家族中唯一同时表达于线虫与哺乳动物细胞的蛋白，线虫iASPP(Ce-iASPP)与人的iASPP具有38%的同源性，Ce-iASPP可在人的细胞系中发挥相同的调节功能，提示该蛋白对调节P53凋亡功能的重要性。iASPP具有ASPP蛋白成员典型的蛋白结构特点，即锚蛋白重复序列，SH3结构域和脯氨酸富集区，分子量为拟8个氨基酸，该蛋白主要定位在细胞质，但在细胞核也有少量表达，iASPP-FL的N末端是该蛋白在胞浆表达和负性调节功能必不可少的序列。作为一种癌基因，它能够借助对P53的负调控作用来增强Ras、Ras+E7、 Ras+EIA等原癌基因的转化潜能，与ASPP1/2竞争性结合P53，抑制后者作用实现其负性调节功能。高表达iASPP的细胞对紫外，cisplatin诱导的凋亡抗性增强。iASPP和HIVl共感染实验，高表达的iASPP-FL可通过NFkB、Spl抑制DNA结合活性从而有效地阻断HIVl的复制。采用RNA干扰的方法抑制iASPP癌基因在p53野生型白血病细胞系Nalm6中的表达， 发现siRNA干扰片段处理白血病细胞株Nalm6细胞，使iASPP mRNA表达水平下调，细胞分化抗原CD20表达升高，细胞凋亡增加，并且提高了对细胞毒药物的敏感性。iASPP可以使骨髓集落形成细胞数目增多，提示iASPP可能通过影响造血干细胞的凋亡、增殖和自我更新等功能，促进了造血干细胞发生恶变。近年研究表明许多肿瘤的发生和致病可能都依赖于一小群肿瘤干细胞，这群肿瘤干细胞持续生长，并向其他部位播散。目前认为肿瘤干细胞主要起源于正常的干祖细胞，正常的干祖细胞获得并积累突变使癌基因激活和(或)抑癌基因失活，最终，正常的干祖细胞演变为肿瘤干细胞。但是，iASPP-FL在造血干祖细胞的自我更新、定向分化，以及正常造血干祖细胞向肿瘤干细胞的转化过程中发挥了何种作用，是否会导致小鼠发生肿瘤，如果发生肿瘤，这些肿瘤细胞是否起源于干祖细胞，目前均不清楚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种转导全长型 iASPP-FL (fu 11 -1 engthiASPP-FL, iASPP-FL-FL)癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建转基因的载体是插入人iASPP-FL的表达质粒，线性化转基因载体，纯化后通过显微注射技术将带有目的基因的核酸注射入C57小鼠受精卵中，使外源基因整合入小鼠基因组中，检测其对造血干祖细胞自我更新、定向分化及是否有肿瘤发生等功能的影响。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤1)载体构建自 pcDNA3. 10-WT-iASPP-FL_V5 中，PCR 扩增 iASPP-FL，引入所需的 Not I和Sfi I酶切位点上游引物为5，-GCAGGCCCGTACGGCCATGGACAGCGAGGCATTC-3‘下划线为引入 Sfi I 酶切位点下游引物为5，-CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG-3‘划线为引入 Not I 酶切位
占反应条件为98 °C Imin预变性；重复如下循环27次98 V IOs, 60 V IOs,720C 5min;然后4°C保存，扩增片段长度为2509bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量并进行胶回收纯化，连接入PMD18-T载体中，转化E.coli DH5a菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后，测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPP-FL片段，胶回收纯化，hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18-T-iASPP-FL载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPP-FL片段连接， 转化DH5 α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段，构建 hMHS21/45vav-iASPP-FL 质粒；2)转基因载体的线性化与纯化将构建hM HS21/45vav-iASPP-FL质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度，得到纯化的转基因载体hM HS21/45vav-iASPP"FL ；3)小鼠模型制备把转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL注射入C57小鼠受精卵内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19 21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾， 自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPP-FL的整合，得到转导iASPP-FL癌基因的阳性首建鼠；4)建立iASPP-FL转基因鼠系将整合外源目的基因首建鼠与6_8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带遗传自父代的外源基因整合情况，获取研究所需阳性子代iASPP-FL转基因小鼠。用于将转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL注射入C57小鼠受精卵内是采用显
微注射方法。上述的方法构建的转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型。上述的转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型在肿瘤的靶向治疗中的应用。Western-blot检测iASPP-FL的表达情况，发现这目的癌基因(蛋白)在骨髓，胸腺，脾脏中特异性高表达，在肝脏，肾脏等非造血系统中表达量没有明显变化。定期尾静脉取血，查血象及白细胞分类。流式细胞术分析该转基因小鼠骨髓中造血干祖细胞比例和数量变化，竞争移植实验、极限稀释实验和连续移植实验比较该小鼠骨髓细胞的造血重建能力，检测该小鼠骨髓造血干祖细胞抗凋亡能力指标。血象有异常改变后，处死小鼠，解剖查看肝、脾、淋巴结等器官肿大情况。各器官组织进行病理检测，流式分析显示细胞表型。本发明的有益效果是iASPP_FL转基因小鼠模型中长期造血干细胞(LT-HSCs)和短期造血干细胞(ST-HSCs)数量增加，同时增加小鼠骨髓中共同髓系祖细胞(CMP)和粒单核细胞系祖细胞(GMP)数量。在竞争移植实验中表现出强于野生型小鼠的增殖能力。小鼠模型骨髓细胞在极限稀释实验中，对致死剂量照射受体小鼠骨髓重建能力明显强于野生型对照组。小鼠模型的骨髓造血干祖细胞，受到放射源照射时具有较强的抗凋亡能力，上述骨髓细胞多见断裂DNA双链，累积较多遗传学损伤。该转基因小鼠模型可见肿瘤高发，主要是急性乳腺癌和白血病两种恶性肿瘤，淋巴瘤细胞具有二次移植能力。可以为白血病的靶向治疗提供新的靶向分子iASPP-FL。为白血病的靶向治疗提供新的动物模型，从而进一步研究和阐述淋巴细胞白血病的发病机制。
图1是PCR扩增iASPP-FL片断的凝胶电泳分析(M :DL15, OOOMaker)。图2是pMD18-T-iASPP-FL质粒克隆及Sfi I酶切鉴定酶切鉴定(M :DL 15，OOOMaker)。图3a是iASPP-FL连入pMD18_T载体，正向测序结果1。图北是iASPP-FL连入pMD18_T载体，正向测序结果2。图如是iASPP-FL连入pMD18_T载体，反向测序结果1。图4b是iASPP-FL连入pMD18_T载体，反向测序结果2图 5 是 hM HS21/45vav-iASPP-FL 质粒克隆及 HindIII 酶切鉴定(M :DL 15，OOOMaker)。图6是PCR扩增检测转基因小鼠iASPP-FL整合情况(M :DL2，OOOMaker)。图7是狗计吐11-131讨检测iASPP-FL在阳性转基因小鼠的蛋白水平表达。图8 是分选 WT 小鼠骨髓中 LISK、LSK 细胞过程(LISK c-kithi, Sca-Γ ；LSK Iin , c_kithl, Sca-Ihl)。图9是iASPP-FL与WT小鼠骨髓LSK细胞、长期造血干细胞(LT-HSC)与短期造血干细胞(ST-HSC)比例。图10是iASPP-FL与WT小鼠骨髓LISK细胞比例变化。图11是iASPP-FL与WT小鼠骨髓中各系祖细胞比例变化。图12是iASPP-FL转基因、对照组WT小鼠竞争移植重建造血实验。图13是iASPP-FL转基因、WT对照组小鼠1 X IO6个骨髓细胞的第5次连续移植实验受体小鼠生存曲线。图14 是 4. 5Gy 辐射后 iASPP-FL 与 WT 小鼠骨髓 LSK(IirT，c_kithi，Sca-Ihi)造血干祖细胞的早期凋亡情况。图15 是 4. 5Gy 辐射后 iASPP-FL 与 WT 小鼠骨髓 LSK(IirT，c_kithi，Sca-Ihi)造血干祖细胞的晚期凋亡情况。图16是iASPP_FL、WT小鼠骨髓细胞4. 5Gy照射后磷酸化H2AX染色野生型对照组 (a.野生型对照组小鼠，b. iASPP-FL小鼠组)。图17 是 iASPP-FL 与 WT 小鼠骨髓中 LSK(IirT，c_kithi，Sca-Ihi)造血干祖细胞 Transwell迁移实验。图18是iASPP-FL与WT小鼠骨髓细胞归巢体内实验。图19是胸腺瘤小鼠组织病理切片结果(a.胸腺瘤；b.胸腺瘤细胞浸润肌肉组织； c.胸腺瘤细胞浸润脂肪组织)。图20是白血病小鼠外周血及组织病理切片结果(a.外周血瑞氏染色；b.股骨骨髓；c.d.肝脏、脾脏大量肿瘤细胞浸润)图21是淋巴瘤小鼠解剖外观、脾脏细胞形态及组织病理切片结果(a. c.可见小鼠肝脾肿大b.甲状腺等腺体异常肿大d.脾脏细胞瑞氏-吉姆萨染色；e.脾大量瘤细胞浸润， 分裂相多见，组织结构完全破坏；f.g.肾小球旁间质内大量瘤细胞浸润h.消化道胃部瘤细胞侵犯肌肉组织)。图22是6周龄iASPP-FL、WT小鼠与iASPP-FL淋巴瘤小鼠骨髓细胞免疫表型比较。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明实施例1携带iASPP-FL的转基因载体hM HS21/45vav-iASPP_FL的构建与纯化利用高保真PrimeSTAR HotStar DNA 多聚酶，自 pcDNA3. 10-WT-iASPP-FL_V5 中， PCR扩增iASPP-FL，引入所需的Not I和Sfi I酶切位点，上游引物和下游引物分别为5，GCA GGCCCGTACGGCCATGGACAGCGAGGCATTC-3，(下划线为弓丨入 Sf i I 酶切位点)和 5，-CAGCGCGGCC GCCTAGACTTTACTCCTTTG-3‘(下划线为引入Not I酶切位点)，反应条件为98°C预变性lmin， 98°C 10s, 60°C 10s，72°C 5min，27个循环后4°C保存，扩增片段长度为2509bp, PCR扩增后加入A尾，电泳定量(图1)并进行胶回收纯化，连接入PMD18-T载体中，转化E. coli DH5 α 菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后 (图2)，送测序(图3、4)。测序正确的克隆，经SfiI和Not I双酶切得到iASPP-FL片段， 胶回收纯化。hM HS21/45vav经Sfi I和NotI双酶切，纯化定量，与自pMD18_T-iASPP_FL 载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPP-FL片段连接，转化DH5 α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段。构建hM HS21/45vav-iASPP-FL质粒，将此质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度至50ng/ μ 1，即获得显微注射所需的转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL(图 5)。实施例2iASPP_FL转基因动物模型的建立及表型的鉴定hM HS21/45vav-iASPP-FL纯化后，即可用显微注射法等方法使其整合入真核动物基因组，如C57BL/6J小鼠基因组中，其步骤简述如下1)准备假孕母鼠(养母)选取数只2月龄以上适龄雌性小鼠可育雌鼠作为受体鼠，与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母，第二天上午9 00前观察受体鼠，有精栓者拿出隔离备用。2)受精卵的准备选取7-8周龄雌性小鼠可育雌鼠，每只小鼠腹腔注射马血清 PMSG (10IU)，47-48小时后，每只小鼠腹腔注射绒毛膜促性腺激素(HCG) (0. 8IU)，促使超排卵，处理后与可育雄鼠交配。次日，断颈处死供体鼠，手术取出整个输卵管，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出，收集受精卵备用，放入透明质酸酶 (0. 3mg/M2)液中；3)基因导入仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% C02，37°C培养箱培养。在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液， 覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使上述纯化获得的转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL溶液缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置， 将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大后退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2, 37°C培养箱培养。4)胚胎移植将已转入基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管内，将受体麻醉，注射计量为戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。自背部手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致Icm左右，气泡0. 2cm 左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，使胚胎在养母体内发育成熟；手术后19-21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用 PCR检测目的基因iASPP-FL的整合。5)对幼鼠的鉴定幼鼠断乳后自尾部提取DNA，使用PCR的方法，鉴定外源基因是否整合，整合目的序列的幼鼠称为首建鼠(founder)。Western-blot检测iASPP-FL的表达情况，发现这目的基因(蛋白)在骨髓，胸腺，脾脏组织中特异性高表达，在肝脏，肾脏等非造血系统中表达量没有明显变化。共获得iASPP-FL转基因首建鼠7只小鼠分别选iASPP-FL 的两只不同首建鼠进行后续的造血干祖细胞生物学相关研究。实施例3iASPP_FL子代阳性小鼠的PCR筛选鉴定及小鼠模型的建立显微注射目的核酸受精卵发育繁殖小鼠，剪取出生后3周龄小鼠的Icm左右鼠尾， 提取基因组DNA(酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA)，PCR检测外源目的基因整合情况。共鉴定得到7只iASPP-FL组阳性转基因首建鼠，分别以A-O，B-O，C-O，D-O，E-O，F-0, G-O
6)。将整合外源目的基因首建鼠与6-8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定子代携带的外源基因整合情况，检测上游引物和下游引物分别为 5，-CAGTGAGTGGAAGCCGTGAGG-3，和 5，-GGAAGTCGAAAGGCGTGGG-3，，反应条件为 94°C 预变性5min，94°C 30s，94°C变性30s，72°C延伸70s，28个循环后72°C延伸7min，4°C保存，扩增片段长度为988bp。将繁育得到的第一代小鼠定义为研究的Fl代，Fl代繁育的子代小鼠定义为F2代。检测PCR电泳结果显示iASPP-FL转基因小鼠Fl子代阳性率约为沈.9%。实施例4Western blot对转基因小鼠造血系统中iASPP-FL表达的鉴定收集IXlO7小鼠骨髓、脾脏、胸腺等组织细胞，PBS洗涤后悬浮于细胞裂解液中裂解细胞，冰上放置 30min，4°C 12，000g 离心 lOmin，收集上清。以 Bicinchoninic Acidassay 法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳的分离胶与浓缩胶的浓度分别为10%和4%。待测细胞裂解液和蛋白分子量标准首先加入4X变性凝胶上样缓冲液，10(TC煮沸:3min。然后依次加入上样孔中。电泳开始时电流为lOmA/cm凝胶，染料进入分离胶后，电流加大至20mA/cm 凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，用转移缓冲液浸泡数5min， 然后进行转膜。用半干蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素滤(NC)膜上，按转移蛋白的常规方法进行，电转4h。转移结束后去除滤纸。把凝胶转移至考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。将转移上蛋白的NC膜浸在5%脱脂奶4°C封闭池，将膜与抗 iASPP-FL抗体(1 1000稀释)孵育过夜后，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15min。 将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(l 2000稀释)共同孵育lh，PBS-T缓冲液洗膜 3次，每次15min。最后以化学发光显色，胶片曝光压片。结果显示iASPP-FL在iASPP-FL转基因阳性小鼠骨髓、胸腺和脾脏等造血组织中特异性高表达，在小鼠的肝脏、肾脏等其他组织中表达量很低(图7)，说明我们分别成功构建并获得造血组织特异性高表达目的蛋白 iASPP-FL的转基因小鼠。实施例5iASPP_FL转基因小鼠造血干祖细胞功能的研究5. 1流式细胞仪分析iASPP-FL转基因小鼠骨髓造血干祖细胞数量和比例1)取6-8周龄阳性C57iASPP_FL转基因小鼠骨髓，分别待检测分析的各管小鼠骨髓细胞，计数，取5 X IO6细胞，调整细胞体积至100 μ 1依次加入下列抗体，冰上避光30min Mouse Lineage Cell Detection Cocktail-Biotin, FITC 抗小鼠 Sca_l (Ly_6A/E)抗体， APC 抗小鼠 CD117(c-Kit，cKit)抗体，PE 抗小鼠 CD135 (Flk_2/Flt_3，Ly-72)抗体；PBS/ D-Hanks 洗细胞离心后，5 μ 1 Str印tavidin_APC/Cy7，冰上避光 30min ；PBS/D-Hanks 洗细胞离心后，重悬细胞至500 μ 1 PBS/D-Hanks，流式细胞仪分析，长期造血干细胞(LT-HSCs) 表面标志lirT，c-kithi，Sca-Ihi, Flk2_ ；短期造血干细胞(LT-HSCs)表面标志lirT，c kithi，Sca-Ihi, Flk2+(图8)。结果显示癌基因iASPP-FL可以增加小鼠骨髓细胞中短期造血干细胞的数量和比例，野生型和iASPP-FL转基因小鼠骨髓中短期造血干细胞比例(％ ) 分别是0. 09士0. 012、0.洸士0. 100，iASPP-FL转基因小鼠骨髓中ST-HSCs比例增加了约三倍；同时，上述两种小鼠骨髓细胞中长期造血干祖细胞比例(％)分别是0.07士0.058、 0. 24士0. 257，iASPP-FL转基因小鼠骨髓中ST-HSCs比例增加了约四倍(图9)。2)造血共同髓系祖细胞(CMP)、粒单核细胞系祖细胞(GMP)，红系巨核系祖细胞(MEP)各系比例分析取待分析小鼠骨髓细胞，分别标记、冰上避光30min =Mouse LineageCell Detection Cocktai 1-Biotin，FITC 抗小鼠 (Ly_6A/E)抗体，APC 抗小鼠 CD117(c-Kit，cKit)抗体，PE 抗小鼠 CD135 (Flk_2/Flt_3，Ly-72)抗体，PE-Cy7 抗小鼠 CD127(IL-7Rec印tor，IL-7R)抗体，PerCP_Cy5. 5 抗小鼠 CD16/32_blocksFc binding 抗体；PBS/D-Hanks 洗细胞离心后，5μ 1 Streptavidin-APC/Cy7,冰上避光 30min ；PBS/ D-Hanks洗细胞离心后，重悬细胞至500ul PBS/D-Hanks,流式细胞仪分析，CMP表面标志lirT，c-kithi, Sca-Il0, CD34+，IL-7IT，FcrRl0 ；GMP 表面标志lirT，c_ktihi，Sca-Il0, CD34+，IL-7IT，FcrRhi ；MEP 表面标志lirT，c_kithi，Sca-Il0, CD34", IL-7IT，FcrRl0o 结果显示癌基因iASPP-FL小鼠骨髓细胞造血共同髓系祖细胞(CMP)比例(％ )，从正常小鼠的 0. 10士0.005增加至0. 153士0.032，粒单核细胞系祖细胞(GMP)的数量也由0. 094士0. 019 减至0. 180士0. 036 ；但是对红系巨核系祖细胞(MEP)的比例和数量变化不大，在iASPP-FL 和野生型小鼠比例(% )分别为是0. 264士0.017、0. 353士0.070(图10、图11)。5. 2iASPP-FL对小鼠骨髓细胞增殖能力的影响受体小鼠遗传背景为⑶45. 1，接受9. 5Gy致死剂量照射后，分别将6_8周龄的 iASPP-FL或iASPP-FL转基因阳性小鼠骨髓细胞与年龄相似遗传背景⑶45. 1的正常野生型 C57BL6J小鼠骨髓细胞等比例混合，经尾静脉注射移植入致死剂量照射的受体小鼠中，分别在骨髓移植后4、8、12、16周取将上述移植受体小鼠尾血细胞进行分析。通过等比例竞争移植实验结果显示，高表达iASPP-FL的小鼠骨髓细胞具有明显的增殖优势。移植后4周，流式细胞仪分析上述三组小鼠外周血⑶45. 1阳性、⑶45. 2阳性细胞比例分析发现，转入癌基因iASPP-FL的小鼠骨髓细胞增殖优势显著，是相同条件下正常野生型骨髓细胞增殖能力的3. 60倍，增殖优势具有时间依赖性移植后第16周，iASPP-FL转基因小鼠骨髓细胞增殖能力为正常组小鼠骨髓细胞的4. 47倍(图12)。5. 3iASPP-FL小鼠骨髓造血重建实验在小鼠骨髓细胞非竞争性极限稀释的造血重建实验中，分别取0.5X IO5个 /50 μ 1、1. OX IO5 个/100 μ 1、1.5Χ105Α/150μ 1、2. OX IO5 个/200 μ 1 的遗传背景均为 CD45. 2的iASPP-FL转基因小鼠或者野生型对照组小鼠骨髓细胞，经尾静脉回输到遗传背景为CD45. 1的接受致死剂量照射受体小鼠，各个不同数量骨髓细胞每组注射10只小鼠。观察移植后的4周、3个月，来源于两组小鼠的不同数量骨髓细胞对受体小鼠的骨髓重建能力的影响。结果显示在移植后第4周时，接受1. 0X IO5个/100 μ 1野生型小鼠骨髓移植的受体小鼠中，有80 %以上受体小鼠因骨髓造血不能重建而死亡，但是，在相同条件下接受相同数量iASPP-FL骨髓移植的受体鼠存活率超过80%，证明iASPP-FL转基因组小鼠骨髓细胞的造血重建能力较野生型小鼠优势明显。骨髓细胞连续移植实验是通过将1 X IO6细胞/100 μ 1骨髓细胞回输到致死剂量照射受体小鼠，重建其骨髓造血，并且在移植后14-16周后，再进行下一轮新的移植实验， 即将造血获得重建的受体小鼠的IX IO6细胞/100 μ 1骨髓细胞回输到新的致死剂量照射小鼠，完成新一轮的造血重建实验。该实验可以很好的评估供体小鼠骨髓中造血干细胞 (HSCs)增殖、定向分化与骨髓造血重建的能力，正常野生型小鼠的骨髓细胞通常可以完成 4、5代受体小鼠的造血重建。结果显示间隔14-16周以上、连续4代的连续移植实验，证实 iASPP-FL的1 X IO6小鼠骨髓细胞可以完成4代以上80 %小鼠的造血重建，但是当移植到第 5代受体小鼠时，相同条件下野生型对照组小鼠在第五次移植时也相继死亡，但是90%以上iASPP-FL组受体小鼠移植后存活时间超过90天，说明1 X 106iASPP_FL小鼠骨髓细胞对接受致死剂量照射受体小鼠的造血重建优势明显强于相同条件下的正常对照组(图13)。实施例6iASPP_FL增强小鼠骨髓干祖细胞修复功能，抑制辐射诱导的凋亡分析受到4. 5Gy铯源照射12小时后，小鼠造血干祖细胞的凋亡情况的实验中， 首先分选出骨髓中LSK造血干祖细胞后，标记耦合荧光PE染料的Armexin V、7_ADD，在 Ih内进行流式细胞仪检测，分析造血干细胞和造血祖细胞凋亡情况。当细胞发生凋亡时细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PQ由细胞膜的胞浆一侧转移至外侧，在存在的情况下，可与 Annexin-V结合，7-AAD被用于鉴别存活细胞和非存活细胞，有完整细胞膜的存活细胞可排出7-AAD，而死亡或受损细胞的细胞膜可使7-AAD渗入，因此Annexin-V阳性而7-AAD阴性的细胞为正在发生凋亡，处于早期凋亡阶段细胞；Armexin-V和7-AAD双阳性细胞可以是凋亡的晚期阶段正在发生坏死，也可能是已经死亡，在本实验中划分为晚期凋亡。结果显示 iASPP-FL具有抑制辐射诱导的造血干祖细胞凋亡的作用，尤其对早期凋亡的作用更加明显 (图14)。其中，正常野生型对照、iASPP-FL小鼠骨髓LSK细胞在受到4. 5Gy照射后12小时，细胞发生早期凋亡的比例分别是四.9%、2.84%，iASPP-FL抗早期凋亡能力明显增强； 但抗晚期凋亡的能力类似，分别为17. 14%、17. 81%，差异不明显(图15)。磷酸化的H2AX参与DNA损伤修复，H2AX具有响应DNA损伤的作用，当H2AX被暴露在电离辐射下时，H2AX保守的羧基端的尾部krl39残基被迅速磷酸化，形成磷酸化H2AX， 即Y-H2AX。磷酸化H2AX在细胞周期检测点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用，是DNA双螺旋断裂标志之一，为细胞内募集的修复分子提供锚定位点。在对上述辐射后小鼠骨髓细胞磷酸化H2AX染色荧光共聚焦显微镜结果显示，与野生型对照组相比，iASPP-FL转基因实验组小鼠骨髓H2AX磷酸化作用明显增强，修复能力更明显，通过磷酸化 H2AX染色可以看到这些小鼠的骨髓细胞中出现大量修复位点，这些小鼠骨髓细胞累积了更多的遗传学损伤(图16)。Western-blot检测结果也显示iASPP-FL转基因小鼠骨髓细胞 H2AX磷酸化水平较野生型对照组小鼠增加。实施例7iASPP_FL增强小鼠骨髓干祖细胞归巢迁移能力通过Transwell体外实验和小鼠竞争移植实验比较iASPP-FL转基因小鼠骨髓造血干祖细胞的归巢能力，首先，先分选获得Transwell实验所需的骨髓造血干祖LSK细胞，接种至孔径大小5. 0 μ m的聚碳酸酯膜上室，在NIH 3T3上清的趋化作用5小时后比较iASPP-FL转基因小鼠与野生型小鼠LSK细胞迁移能力。结果显示iASPP-FL转基因小鼠造血干祖细胞在NIH 3T3细胞上清的趋化作用下迁移率6. 96%，野生型小鼠迁移率约为4. 40%，有一定的差异，即iASPP-FL小鼠骨髓LSK细胞迁移率是野生型小鼠的1. 58倍。 为了进一步证实iASPP-FL对造血干祖细胞迁移能力变化具有细胞选择性，在相同的条件下，比较了 iASPP-FL小鼠全骨髓细胞的迁移能力，iASPP-FL组小鼠全骨髓小鼠迁移率分别是9. 71%，与野生型对照组小鼠全骨髓细胞的迁移率9. M%，无明显差异(P > 0. 05)(图 17)。通过小鼠骨髓细胞等比例竞争移植的体内实验比较iASPP-FL与野生型小鼠骨髓细胞归巢能力。先将遗传背景⑶45. 1受体小鼠致死剂量照射清髓，再将⑶45. 2iASPP-FL 转基因小鼠骨髓细胞与野生型CD45. 1C57小鼠骨髓细胞等比例混合，尾静脉注射移植入照射清髓的CD45. 1受体小鼠，移植后16个小时、40个小时，分析受体小鼠骨髓中CD45. 2细胞的归巢情况。结果显示移植后16小时，iASPP-FL转基因小鼠和野生型小鼠骨髓细胞归巢率分别是37. 26%,31. 18%。移植后40小时，iASPP-FL和野生型小鼠骨髓中⑶45. 2细胞分别是49. 08 %和50. 16 %，说明在移植后40小时，iASPP-FL转基因小鼠及野生型小鼠骨髓细胞已基本完成骨髓归巢(图18)。iASPP-FL转基因小鼠骨髓细胞体内归巢能力是野生型小鼠的1. 17倍，体外transwell实验LSK干祖细胞迁移能力较野生型对照组提高1. 58 倍。实施例8iASPP-FL小鼠肿瘤发病情况将阳性iASPP-FL转基因首建鼠与野生型小鼠交配后鉴定的阳性Fl、F2子代阳性 iASPP-FL转基因小鼠饲养在SPF级动物合格环境下饲养，定期经尾静脉取血，查血象、白细胞分类。血象有异常改变后，处死小鼠，研究有无肝、脾、淋巴结肿大，及细胞表型改变。 iASPP-FL转基因小鼠首建鼠F0、及其子代Fl肿瘤发生率最高的是乳腺癌，其次可见急性白血病、淋巴瘤、胸腺瘤(图19、20)。上述发生各种恶性肿瘤的转基因小鼠解剖可见肝脾肿大，常伴有胸腺增生，中位生存年龄是16个月。发生淋巴瘤的iASPP-FL小鼠解剖可见 2. 26g巨型脾脏，甲状腺腺体异常增大，肝脏、肌肉组织、消化道、肾脏可见大量肿瘤细胞浸润，分析iASPP-FL组发生淋巴瘤的小鼠表型，与6-8周龄阳性iASPP-FL、iASPP-FLsv骨髓细胞表型比较，发现淋系抗原⑶4、⑶3、Thyl. 2表达水平显著升高(图21、22)。说明癌基因 iASPP-FL通过刺激造血干祖细胞增殖与定向分化、使其凋亡功能缺失累积了更多的遗传学突变从而增加了小鼠肿瘤的发生。小鼠外周血涂片、IX IO5BMMNC甩片，瑞氏染色普通光学显微镜下观察。取发病小鼠肝、脾、骨髓、胸腺、肾等组织器官石蜡包埋切片，进行HE染色①取小鼠肿瘤组织块，10%中性福尔马林固定M小时，常规石蜡包埋，4μπι切片；②切片常规用二甲苯脱蜡， 经梯度乙醇至水洗二甲苯I 5min—二甲苯II 5min — 100 %乙醇2min — 95 %乙醇 2min — 80 %乙醇^iiin — 75 %乙醇^iiin —蒸馏水水洗^iin ；③苏木素染色5min，自来水洗5min ；④盐酸乙醇分化30sec，自来水洗^iin ；⑤弱碱性水溶液返蓝60sec，自来水洗 IOmin ；⑥伊红染色2min，蒸馏水洗2次；⑦常规脱水、透明、封片75%乙醇aiiin — 80%乙醇 2min — 95% 乙醇 2min — 100% 乙醇 2min — 二甲苯 I 5min — 二甲苯 II5min —中性树胶封片。普通光学显微镜观察、摄片。结果显示相关组织均有肿瘤细胞浸润(图16、17)。实施例9发病小鼠iASPP-FL基因表达的鉴定提取C57移植小鼠脾单个核细胞RNA及蛋白质，用RT-PCR及WiesternBlot方法检测小鼠造血系统内iASPP-FL的表达情况。用分光光度计测定A26tZA28tl，计算RNA含量，并经 12g/L琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。20 μ 1逆转录反应体系含2 μ g总RNA, 4 μ 1 RT缓冲液，50pmol/L oligo(dT) 16,1 ymol/L dNTPs，0· 1 μ mol/L DTT, 15U RNA酶抑制剂(Takara)， 200U MLV(Invitrogen)，于 65°C水浴 5min,冰浴 5min，37°C水浴 60min, 70°C 15min 终止反应，所得cDNA-20°C保存备用。上游引物和下游引物分别为5，-CTGTCCTCTGATGGGCTCTTG-3， 和 5，-CTCGGGTCGTTCATCTCCTTC-3，，反应条件为 94°C 预变性 5min，94°C 30s，94°C 变性 30s，72°C延伸70sJ8个循环后72°C延伸7min，4°C保存，扩增片段长度为98^ρ，结果显示 iASPP-FL在白血病小鼠中无论是转录阶段还是翻译阶段均高表达，在野生型对照组无表达。实施例10发病小鼠肿瘤细胞二次移植能力的鉴定为确定发病小鼠肿瘤细胞的二次移植能力，取上述已鉴定细胞表型的淋巴瘤 iASPP-FL小鼠的脾细胞QXlO6)分别经尾静脉注射到照射处理后的⑶45. 1受体小鼠，每只原代发病小鼠的脾细胞各移植4只。第二代小鼠移植后6-9w内周左右发病，平均移植后生存期为97d。组织病理及细胞表型与第一代发病鼠一致，流式细胞仪分析细胞表面标记 ⑶45. 2细胞阳性率是94. 7%，说明iASPP-FL组淋巴瘤小鼠脾脏细胞有可传代性。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤1)载体构建自pcDNA3. 10-WT-iASPP-FL-V5 中，PCR 扩增 iASPP-FL，引入所需的 Not I 和Sfi I酶切位点上游引物为 5，-GCAGGCCCGTACGGCCATGGACAGCGAGGCATTC-3‘下划线为引入 Sfi I 酶切位点下游引物为5’ -CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG-3‘划线为引入Not I酶切位点反应条件为98°C Imin预变性；重复如下循环27次98°C 10s，60°C 10s，72°C 5min ；然后4°C保存，扩增片段长度为2509bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量并进行胶回收纯化，连接入PMD18-T载体中，转化E.coli DH5 α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经 Sfi I和Not I双酶切鉴定后，测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPP-FL片段， 胶回收纯化，hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18_T-iASPP_FL 载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPP-FL片段连接，转化DH5 α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段，构建hMHS21/45vav-iASPP-FL质粒；2)转基因载体的线性化与纯化将构建hMHS21/45vav-iASPP-FL质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度，得到纯化的转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL ；3)小鼠模型制备把转基因载体hMHS21/45vav-iASPP-FL注射入C57小鼠受精卵内， 植入假孕小鼠子宫内，手术后19 21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPP FL的整合，得到转导iASPP-FL癌基因的阳性首建鼠；4)建立iASPP-FL转基因鼠系将整合外源目的基因首建鼠与6-8周龄正常野生型 C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带遗传自父代的外源基因整合情况，获取研究所需阳性子代iASPP-FL转基因小鼠。
2.根据权利要求1所述的转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，其特征在于，用于将转基因载体hM HS21/45vav-iASPP-FL注射入C57 小鼠受精卵内是采用显微注射方法。
3.用权利要求1或2所述的方法构建的转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型。
4.权利要求3所述的转导全长型iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型在肿瘤的靶向治疗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种转导iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建hM HS21/45vav-iASPP-FL质粒，将此质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度。通过显微注射的方法把转基因载体hM HS21/45 vav-iASPP-FL注射入C57小鼠受精卵内。采用分子生物学、实验动物学等方法获得了造血系统特异性高表达iASPP-FL转基因小鼠模型，为进一步阐述正常造血干祖细胞向肿瘤细胞转化的机制研究以及靶向治疗奠定了基础。
文档编号A01K67/027GK102296072SQ201010208149
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者刘家卓, 彭磊文, 王建祥, 王敏, 田征, 邢海燕, 饶青 申请人:中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)