专利名称：一种源于沪油15的rav-1类转录因子及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及作物遗传育种领域，具体涉及一种源于甘蓝型双低油菜“沪油15”的 RAV-I类转录因子及其制备方法和应用。
背景技术：
甘蓝型双低油菜沪油15是上海市农业科学院作物育种栽培研究所油菜研究室采用双交法选育的甘蓝型双低油菜新品种，2000年通过上海市农作物品种审定委员会审定， 2003年通过国家品种审定委员会审定，2002年被科技部列入国家级成果重点推广计划，常年在长江中下游地区有较为广泛的栽培孙超才等，中国油料作物学报，2002，对:65-67。油菜在其整个生活周期中，周围的环境(气候、土壤、水分营养供应、病虫害等因素)是经常变化的，适宜的环境条件能保证或促进油菜正常的生长发育，而不适宜或恶劣的环境条件则会抑制油菜的生长甚至使油菜死亡。干旱、低温和高盐是目前影响农作物主要的非生物限制因子Bray，Trends Plant ki，1997，2:48巧4，它们对作物的危害通常表现为使植物体内水分平衡的发生变化，又称水分胁迫或渗透胁迫。非生物限制因子严重影响了作物的生长、产量和种植区域。随着分子生物学与现代生物技术的发展，使人们从分子水平上深入认识植物与非生物逆境之间的关系成为现实，并且为改良作物抗非生物逆境性能开拓了新的途径。目前，植物与非生物逆境之间的关系在分子细胞水平上己有较深入的研究。理解植物对非生物逆境的响应及相关信号在植物体内的传导途径和克隆抗逆相关基因对植物抗逆性能的提高具有重要的指导意义。据统计，我国城乡人均植物油年消费量为8. 5公斤，植物油总需求量达1400多万吨，并保持以每年50万吨的速度增长，而目前我国总生产量只有900多万吨，缺口近500万吨。预计2020年我国年需植物油将达2040万吨，缺口较大，需要依靠大量进口来弥补国内产需缺口王汉中，中国油料作物学报，2004，沈98-101。大力发展油菜和其他油料植物种植及提高产量以缓解依赖进口解决植物油短缺，不但具有食品安全的长远意义，而且关系到我国种植业结构的调整、优化和近1亿农民的增收。油菜还是一种潜在的生物能源，关系到我国的能源安全和环境安全，进一步改良和加强油菜基础理论和生产实践研究具有重大的意义王汉中，中国油料作物学报，2007，四101-105。相比拟南芥Riechmann等，Science, 2000，290 2105-2110、水稻Yu 等， Science,2002,296:79-92],杨树Tuskan 等，Science,2006，3131596-1604和葡萄 [Jaillon 等，Nature, 2007,449 463-467 ；Velasco 等，PLoS ONE，2007，2 el326等基因组已经测序完成的植物而言，油菜中转录因子的研究相对较少，且主要集中在AP2/ERF转录因子家族。目前，从油菜中分离AP2/ERF家族转录因子的方法主要有RACE、探针杂交和电子克隆结合RT-PCR等。Jaglo等通过RACE方法从春油菜(汉napus cv. W^estar)中分离到两个CBF族转录因子Jaglo等，Plant Physiol，2001，127:910-917；Gao等通过探针杂交的方法从冬油菜(汉napus cv. Jet neuf )中分离了四个CBF族转录因子Gao等， Plant Mol Biol，2002，49459-471 ；Liu 等通过 RACE 方法从油菜中克隆了 4 个 ERF/AP2类转录因子Liu等，FEBS Lett，2006，580:1303-1038;Zhao等通过RACE方法从油菜(召. napus cv. Jinghong H15)中克隆了 7 个 CBF 族转录因子Zhao 等，J Biol Chem, 2006, 281:10752-10759].这些AP2/ERF家族转录因子基因的克隆对进一步开展油菜转录因子的研究奠定了良好的基础。油菜AP2/ERF家族转录因子广泛参与油菜生长发育和对外界刺激的应答反应，并对各种逆境和发育信号作出反应。目前主要主要集中在DREB和ERF亚族， 而对于RAV亚族的研究则相对较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于沪油15的RAV-I类转录因子及其制备方法和应用，以进一步分析该基因在甘蓝型油菜逆境中的作用。本发明的技术方案具体如下
所述的源于沪油15的RAV-I类转录因子，其碱基序列如SEQ ID No 1所示。所述转录因子编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述源于沪油15的RAV-I类转录因子为基因。所述fea似K-7-M75基因编码阅读框由1023 bp组成，编码成一个含有340个氨基酸的蛋白质。所述源于沪油15的RAV-I类转录因子基因可应用于甘蓝型油菜逆境生理中。所述的源于沪油15的RAV-I类转录因子的制备方法，包括以下步骤 1)甘蓝型油菜cDNA文库的构建
选取沪油15幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo (dT)为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。2)设计一对正向、反向引物，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得沪油15的 RAV-I类转录因子基因fea似K-7-M75片段。3)将上述获得的扩增基因片段回收后克隆入T载体，测序后即获得甘蓝型油菜的 RAV-I类的转录因子，即fea似K-7-M75"基因。其中，上述制备方法的具体实验步骤如下 1.沪油15的cDNA文库的构建
本发明将沪油15种子经1% (v/v) NaOCl消毒后种植在黑土珍珠岩蛭石(1:1:1) 混合基质中，22°C、16 h光照培养生长20d。选生长健壮的幼苗提取总RNA。以总RNA为模板，Oligo (dT)为引物，参照cDNA合成试剂盒说明，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。2.引物的设计与合成
设计一对正向、反向引物，引物两端分别引入Bern HI和Sac I的酶切位点。其中，正向引物的序列如SEQ ID No 3所示，具体为5’ -GGA, TCC, ATG, GAA，GTG，AGT，AGC，GTA，GAC，G-3，；反向引物的序列如 SEQ ID No 4 所示，具体为5，_GAA，T TC, TCA, CAA, GGC, GTG, AAA, GAT, GCG, TTG, C_3，；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成 (http://www. sangon. com/)。3. PCR的方法获得沪油15的RAV-1类转录因子
本发明的PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司(http://takara. com. cn/)的PCR试剂。在50 μ 1的体系中进行PCR反应，反应参数为94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸1 min 30 s，共扩增30个循环，再72°C延伸10 min。经过1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约1000 bp的片段，结果参见图1。4.克隆鉴定与序列测定
扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司(WWW. axygen. com. cn/ ) DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司(httpV/takara. com. cn/)的 pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。5.序列分析
通过核苷酸序列测定分析，即获得本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子基因片段，其碱基序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。该基因编码阅读框由1023 bp组成，编码成一个含有340个氨基酸的蛋白质。本发明实现的有益效果
本发明成功克隆出沪油15的RAV-I类转录因子，即基因，为了进一步分析该基因在甘蓝型油菜低温逆境中的作用与功能，比较了其与正常沪油15植株，及在低温、高盐和聚乙二醇(PEG)的处理后该基因的表现。结果表明本发明的fea似K-7-M75基因受到PEG、高盐和低温的诱导表达。fea似K-7-M75基因在沪油15盛花和籽粒发育时期的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达。这也表明本发明的fea似K-7-//775基因与甘蓝型油菜对高盐、干旱和低温等逆境的相关。
图1为琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增产物结果，其中k%BnaRAV-I- M75基因扩增产物。图2为本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子fea/M基因的进化树分析结果。图3本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子基因的不同组织表达模式分析结果，其中A为基因片段扩增产物，B为甘蓝型油菜内标准基因acii/7的扩增产物，1-6分别表示不同组织扩增产物1-荚、2-蕾、3-花、4-叶、5-茎和 6-根。图4为本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子fea似K-7-M75基因的低温处理表达模式分析结果，其中A为基因片段扩增产物，B为甘蓝型油菜内标准基因acii/ 的扩增产物，0、2、4、8、12和M分别表示低温不同处理时间小时数的扩增产物。图5为本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子基因的氯化钠处理表达模式分析结果，其中A为基因片段扩增产物，B为甘蓝型油菜内标准基因acii/7的扩增产物，0、2、4、8、12和M分别表示氯化钠不同处理时间小时数的扩增产物。图6为本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子fea似K-7-M75基因的聚乙二醇(PEG)处理表达模式分析，其中A为fea似K-7-M75基因片段扩增产物，B为甘蓝型油菜内标准基因acii/7的扩增产物，0、2、4、8、12和M分别表示聚乙二醇不同处理时间小时数的扩增产物。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但不限于本发明。下述实施例中，所用的试验材料及其来源分别如下
普通沪油15的种子经过1% (v/v) NaOCl消毒后种植在黑土珍珠岩蛭石(1:1:1)的基质中，22 °C，培养(1 光照，他黑暗，冷光源)生长20天。大肠杆菌(fecAericAia co7i)DH5a和酿酒酵母菌株由本研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10 XPCR buffer禾Π DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行Sambrook J, Frets E F， Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。实施例1
甘蓝型油菜“沪油15”幼苗RNA的抽提 (一)试验方法 URNA的抽提
1)加入100ml提取缓冲液(油菜RNA提取缓冲液配方CTAB 3% (W/V) ；PVP 3% (W/V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2. 0 M ；Tris-HCl IOOmM, pH 8. 0 ；Spermidine 0. 5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 处理的 SDS 0. 5%(ff/V) ；0. 1% DEPC 处理的 LiCl 10M 至Ij 50 mL 聚丙烯管，65°C预热。2)称取5 g植物材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨。3)研磨后细粉转移至预先加入65 °C预热的提取缓冲液的50 mL离心管。4)将离心管放入65°C水浴45 min,并偶尔摇动以混合各成分。5)加入等体积氯仿-异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约lOmin。6)在 18°C，于 12000g 离心 10 min。7)吸取上清液，重复5)、6)步骤操作。8)吸取上清液，加入1/4体积的10M LiCl溶液，彻底混勻，4°C放置12 h。9)在 4°C，12000 g 离心 30 min。10) RNA沉淀用500 μ L 0.5% SDS轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，4°C， 12000g 离心 30 min。11)上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积_20°C冰冷的无水乙醇，充分混合， 放置在_20°C条件下2 h，沉淀总RNA。12) 12000g，4°C离心30 min，用75%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干。13)用200 μ L DEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储存于_70°C，备用。(二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物，结果可见明显的RNA条带。实施例2
PCR的方法获得沪油15的RAV-I类转录因子基因片段 (一)试验方法
设计一对正向和反向引物，为了克隆鉴定等构建的需要，引物两端分别引入ife HI和 Sac I的酶切位点。其中，正向引物的序列如SEQ ID No 3所示，具体为5’_GGA，TCC，ATG， GAA, GTG, AGT, AGC, GTA, GAC, G_3，；反向引物的序列如SEQ ID No 4所示，具体为 5，-GAA, TTC, TCA, CAA, GGC, GTG, AAA, GAT, GCG, TTG, C_3，。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://www. sangon. com/)。PCR 反应体系10 X PCR buffer 5. 0 μ L ；dNTPs (各 2. 5mM)4 μ 1 ；普通小麦幼苗的cDNA模板Ιμ (20ng);正向引物0. 5 μ 1 ；反向引物0. 5μ1 ；Ex-Taq 0. 4 μ 1 (预变性后加入)；加无菌水定容至50 μ L·PCR反应程序94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1 min 30 s，共扩增30个循环，再72°C延伸10 min。(二)试验结果
经过1. 0 wt%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约IOOObp的片段(参见图1)。实施例3
克隆鉴定、序列测定 (一)试验方法
扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。通过核苷酸序列测定分析，最终获得了本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子
基因，其具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的碱基和氨基酸序列信
肩、ο进化树绘制使用NJ(Neighbor-joining)方法Saitou 等，Mol Biol Evol, 1987， 4: 406-425，禾(Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4. 0) (http://www.megasoftware.net/ mega, html)完成Tamura 等， Mol Bio Evo, 2007， 24: 1596-1599。(二)试验结果
测序分析结果显示本发明的源于沪油15的RAV-I类转录因子fea/tMK- 7-//Z/5基因编码阅读框由1023 bp组成，编码成一个含有340个氨基酸的蛋白质(参见序列表SEQ ID No 1和 SEQ ID No 2)。构建的同源进化树表明本发明的源于沪油15来源的RAV-I类转录因子 BnaRAV-I-HY15在进化关系上属于AP2/ERF家族中的RAV亚族中的1组(参见图2)。实施例4
沪油15来源的fea似K-7-M75基因的表达分析 (一)试验方法
对生长2周的健壮沪油15幼苗进行各种逆境胁迫。冷处理为将幼苗从22°C移入4°C分别处理2、4、8、12和M h。 7
高盐和干旱处理为分别采用200 mmol/L的氯化钠(NaCl)和15 %的聚乙二醇(PEG 6000)处理幼苗 2、4、8、12 和 24h。为了检测fea^MK-i-Z/Z^基因在不同组织中的表达差异，从正常生长健壮的沪油 15盛花籽粒发育时期的植株上分别取根、茎、叶、花、蕾和荚等组织。所有样品立即放入液氮，冷冻后置于-70°C冰箱保存。采用植物总RNA抽提试剂盒进行总RNA抽提，使用DNase ？ 去除基因组的污染， 然后反转录成cDNA第1链。以沪油15不同处理苗及不同组织器官材料的cDNA为模板，采用RT-PCR对 BnaRA V-I-HY 15基因的表达进行分析。根据BnaRAV-l-HY15基因设计并合成了 1对表达检测引物正向为 BnaRAV-I-BDF，其序列如 SEQ ID No 5 所示，具体为5，-GTT, TCG, ACG, ACG, GAG, TTT, AG-3， ；反向为 BnaRAV-1-BDR，其序列如 SEQ ID No 6 所示，具体为5，_TAC, CAC, GTC, GTT, TCT, TG A，AC-3’，扩增产物长度为440 bp。PCR 反应程序95°C预变性 5min ；95°C变性 40s ；58°C退火 30s ；72°C延伸 30 s ；共 30个循环；72°C延伸5min。由于Iii/ 基因在油菜不同的组织中表达稳定，选用Iii/ 基因作为内标准基因， 用以确定反转录后cDNA模板的相对含量。为了增加RT-PCR的可靠性，以油菜A^i/ 基因作为内标。根据油菜Jciiz7基因设计并合成了 1对引物正向为foia-actinFl，其序列如SEQ ID No 7 所示，具体为5，-GGG, AA T, GGA, AGC, TGC, TGG, AAT, C-3，；反向为 Bna-actinRl，其序列如 SEQ ID No 8 所示，具体为5，-GAT, CCA, CAT, CTG, CTG, GAA, TGT, GC-3，，扩增产物长度为270bp。PCR 反应程序95°C预变性 5min ；95°C变性 30s ；58°C退火 30s ；72°C延伸 25s ；共 30个循环；72°C延伸5min。PCR产物采用1. 5 %的琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad的Gel Doc 1000分析仪进行凝胶成像和分析。(二)试验结果
基因在盛花和籽粒发育时期油菜的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达(参见图3)。沪油15幼苗在低温(4°C)处理了 2、4、8、12和24h检测结果显示，fea似K-7-M75 基因被低温诱导，在低温胁迫下，fea似K-7-M75表达量随着时间的延长而增加二4小时达到最大(参见图4)。沪油15幼苗在高盐溶液(200mmol/L NaCl)处理了 2、4、8、12和24h检测结果显元、’BrmRA V-I-HY 15基因被高盐溶液诱导。在高盐溶液胁迫下，fea/M V-1~HY 15表达量在12 h和M h能够明显检测到表达(参见图5)。沪油15幼苗在PEG 6000溶液处理了 2、4、8、12和24h检测结果显示， fea似基因被PEG 6000溶液诱导，从处理2 11到对h均能检测到表达，而在M h 表达量达到最大(参见图6)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1.一种源于沪油15的RAV-I类转录因子，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No 1所示。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于，所述转录因子为fea^MK-i-Z/Z^基因。
4.根据权利要求3所述的转录因子，其特征在于，所述基因编码阅读框由1023 bp组成，编码成一个含有340个氨基酸的蛋白质。
5.权利要求1所述的转录因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)构建沪油15的cDNA文库选取沪油15幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo(dT) 为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA ；2)设计一对正向、反向引物，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得沪油15的RAV-I 类转录因子^基因片段；3)将上述获得的扩增基因片段回收后克隆入T载体，测序后即获得沪油15的RAV-I类转录因子fea/M V-I-HY 15基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQID No 3 所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No 4所示。
7.权利要求1至4任一项所述的源于沪油15的RAV-I类转录因子在油菜逆境生理中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种源于沪油15的RAV-1类转录因子及其制备方法和应用。所述转录因子为BnaRAV-1-HY15基因，其碱基序列如SEQIDNo1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo2所示。所述BnaRAV-1-HY15基因编码阅读框由1023bp组成，编码成一个含有340个氨基酸的蛋白质。本发明利用聚合酶扩增技术从甘蓝型双低油菜沪油15幼苗中成功克隆出沪油15的RAV-1类转录因子，该转录因子与油菜逆境生理相关。
文档编号A01H5/00GK102373222SQ20101025928
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者周熙荣, 孙超才, 庄静 申请人:上海市农业科学院