专利名称：在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法
技术领域：
本发明涉及组织培养的植物快繁技术，具体属于一种蔷薇科植物多次继代培养中 降低出现玻璃化的快繁育苗方法。
背景技术：
组织培养是将植物体的一部分接种在合成培养基上，使其按照预定目标生长发育 成新植株。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的 小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。因此，近年 来组织培养及快繁技术越来越多地应用于种苗繁殖生产。此外，随着现代分子生物技术的 研究深入，离体培养又是细胞无融合生殖、遗传转化等技术的必备手段，越来越多的植物离 体培养获得成功，离体培养技术已成为现代植物生物技术必不可少的研究手段，在生物学 和农林科研以及生产中发挥了巨大的作用。离体培养能否成功，还受基因型、培养基类型、激素种类及浓度配比等多种因素影 响。培养过程中试管苗还易出现污染、褐化、玻璃化及顽拗等现象，严重阻碍着植物细胞全 能性的实现和离体培养技术的广泛应用。尤其是试管苗玻璃化，表现为叶片和嫩稍呈透明 或半透明水浸状，不能正常生长和增殖，严重影响了试管苗有效增殖系数，严重影响了试管 苗质量，造成人、财、物的极大浪费。一直以来，试管苗污染、褐化和玻璃化被认为是组织培 养三大主要限制因素，试管苗顽拗现象，也逐渐受到重视。具体表现为植物细胞、组织和器 官在离体条件下对培养操作缺乏或丧失反应性，在非洲菊、梨等多种植物材料培养上均有 报道，连续培养多代后，增殖系数大幅降低或不能增殖，在黄冠梨上则表现为增殖系数降 低，玻璃化程度加重，我们在豆梨离体培养中也发现有相同的趋势。研究认为，玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性 异常所引起的。培养基类型、碳源种类及含量、琼脂浓度、活性炭等因素对试管苗玻璃化的 产生均有一定影响。对大多数植物来说，细胞分裂素浓度过高，高温、高湿，光照不足等因素 均易导致玻璃化苗产生。而在香石竹、梨、非洲菊等作物上还发现随着继代次数的增加，愈 伤组织和试管苗体内积累过量的细胞分裂素，玻璃化程度不断升高。继代培养最初几代玻 璃化苗很少，随着继代次数的增加，玻璃化苗的比例越来越高。针对以上玻璃化苗的产生原因，降低玻璃化常用措施主要有降低培养基中细胞 分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质；控制适宜的培养温度， 避免温度过高；使用透气性好封口材料，改善培养容器的痛风换气条件，降低容器内湿度； 适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势；增加自然光照；控制继代次数。虽然这些措 施在一些植物培养过程中，对试管苗玻璃化起到较好的控制作用，但是由于不同作物出现 玻璃化的原因并不相同，对应的预防措施也不一致。有些控制措施如降低细胞分裂素，增加 活性炭、琼脂的用量，还会显著降低增殖系数，影响增殖效果。因而，有必要针对不同作物展 不相应的研究，形成有针对性的行之有效的防控措施。
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蔷薇科植物在地球上分布极为广泛，其中有些为重要的果树，例如桃、李、杏、梅、 苹果、梨、枇杷等，有些为很好的观赏植物，如绣线菊、绣线梅、蔷薇、月季、海棠、梅花、樱花 和白鹃梅等；有些入药。目前，本科许多植物建立起了组培快繁体系，但在快繁过程中，在苹 果、桃、草莓、梨、月季等植物上均有玻璃化苗报道，并且有着相近的形成机制。
发明内容
本发明的目的在于针对蔷薇科植物在组培快繁体系快繁过程中均有玻璃化苗的 实际问题提供一种新的多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法。本发明的目的是这样实现的一种在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化 的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于在继代 增殖过程中，相间设置试管苗复壮培养，然后再选取健壮的试管苗转到生根培养基中诱导 生根，得到完整试管植株，所述的试管苗复壮采用的是不含任何外源植物激素的启动培养 基进行培养，具体步骤如下(1)外植体的消毒将蔷薇科带腋芽的幼茎作为外植体，切段，消毒，无菌水冲洗；(2)芽的诱导将经上述处理的外植体切成单芽茎段，接种于不含任何外源植物 激素的MS启动培养基，在25士2°C、1500 2000Lux、12 14h/d光照培养20 30d得到 无根苗；(3)继代增殖将上述无根苗分别接种在MS增殖培养基上，在25士2°C、1500 2000LuxU2 14h/d的环境下光照培养20 30d，形成正常增殖的丛生试管苗，切分后重 复继代增殖；(4)试管苗复壮培养经过1 4次继代增殖后的丛生试管苗切割分株，接种于不 含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25士2°C，1500 2000Lux、12 14h/d光照培养 20 35d，获得复壮试管苗；(5)将复壮的试管苗重新接种在MS增殖培养基上按照步骤3的培养条件，继代培 养，再将丛生试管苗分株转入生根诱导；或直接将至少经过一次试管苗复壮培养的复壮试 管苗转入生根诱导；(6)生根诱导从转入生根诱导的试管苗中选取Icm 3cm高的健壮苗转入生根 诱导培养基中，在25士2°C、暗培养7d IOd后，再转入到1500 2000Lux，12 14h/d光 照培养，25 35d，获得完整试管植株；所述Icm 3cm高的健壮试管苗选自转入生根诱导 的由丛生试管苗分株后的试管苗，或选自转入生根诱导的复壮试管苗。在本发明中，所述的在继代增殖过程中相间设置试管苗复壮培养是指在多次继 代增殖过程中，至少包括一次试管苗复壮培养，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相 邻的试管苗复壮培养之间应该设置1 4次继代增殖培养。在本发明中，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之 间应该设置1 2次继代增殖培养。在本发明中，所述的外植体的消毒是指对蔷薇科带腋芽的幼茎用流水冲洗Ih 2h，剪取3cm 4cm带芽茎段，在超净工作台上先以75 %酒精消毒30s，再用0. 1 %升汞消毒 5min，无菌水漂洗4 5次。所述的幼茎优选春季萌发的新梢幼茎。在本发明中，所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为MS培养基+25 35g/L蔗糖+5. Og/L琼脂粉；所述的MS增殖培养基为:MS+0. 3 0. 6mg/L6-BA+0. 1 0. 6mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+5. Og/L琼脂粉，pH 5. 8 ；所述的生根培养基为1/2MS培养基 +0. 5 2. Omg/L IBA+20g/L 蔗糖 +5. Og/L 琼脂粉，pH 5. 8。本发明的优点在于(1)缩短了豆梨选优育苗的周期。以梨树为例，目前南方主产区梨主要采用豆梨品 种为砧木，都是采用实生播种后，2年后再进行嫁接。由于种子后代基因具有高度杂合性，很 难对筛选出优质抗生单株进行大规模生产。本发明可以大大缩短豆梨育苗周期，并且可以 选择优良单株或类型进行大规模工厂化生产。(2)降低了玻璃化苗比例，提高了繁殖系数。以豆梨为例，普通豆梨繁殖到能嫁接 时周期长。本发明的繁殖速度快，苗生长整齐，单芽繁殖30d继代一次，且培养过程中玻璃 化比例低，增殖倍数可达5 11倍。(3)以茎段作为外植体，通过芽的增殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，并且 取材容易，更新方便。(4)具有普遍的适用性。本发明的技术方案在蔷薇科植物的快繁育苗中均能适用。
具体实施例方式实施例1 不同配方的MS培养基在多次继代培养中对玻璃化率的影响不含任何外源植物激素的MS启动培养基MS+25 35g/L 蔗糖 +5. Og/L 琼脂粉。增殖培养基1、MS+0. 3mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og2、MS+0. 3mg/L 6—BA+O. 2mg/L NAA+25 35g3>MS+0. 3mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g4、MS+0. 6mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og5>MS+0. 6mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25 35g6>MS+0. 6mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g7, MS+0. 9mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og8>MS+0. 9mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25 35g9>MS+0. 9mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g蔷薇科植物豆梨，采集豆梨春季萌发的新梢幼茎。试验方法将取豆梨新梢，去叶片，用流水冲洗lh_2h，剪取3cm-4cm带芽茎段，在超净工作台 上进行外植体消毒，先以75%酒精消毒30s，再用0. 升汞消毒5min，无菌水漂洗4-5次。 通过启动培养基在25士2°C、1500 2000Lux、12 14h/d光照培养20 30d得到无根苗备用。采用所述的9种培养基对所述的无根苗进行分组平行试验，6-BA选用0. 3、0. 6和 0. 9mg/L三个浓度梯度，NAA设0、0. 2和0. 5mg/L三个浓度梯度，完全区组设计。具体过程
/L琼脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉； /L琼脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉； /L琼脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L琼脂粉；
5是将无根苗接于增殖培养基，在25士2°C、1500 2000LUX、12 14h/d光照培养，20 30d 一代，连续增殖培养三代，每代的试验数据记载于表1。表 权利要求
一种在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于在继代增殖过程中，相间设置试管苗复壮培养，然后再选取健壮的试管苗转到生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株，所述的试管苗复壮采用的是不含任何外源植物激素的启动培养基进行培养，具体步骤如下a)外植体的消毒将蔷薇科带腋芽的幼茎作为外植体，切段，消毒，无菌水冲洗；b)芽的诱导将经上述处理的外植体切成单芽茎段，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～30d得到无根苗；c)继代增殖将上述无根苗分别接种在MS增殖培养基上，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d的环境下光照培养20～30d，形成正常增殖的丛生试管苗，切分后重复继代增殖；d)试管苗复壮培养经过1～4次继代增殖后的丛生试管苗切割分株，接种于不含任何外源植物激素的MS启动培养基，在25±2℃，1500～2000Lux、12～14h/d光照培养20～35d，获得复壮试管苗；e)将复壮的试管苗重新接种在MS增殖培养基上按照步骤3的培养条件，继代培养后再将丛生试管苗分株转入生根诱导；或直接将至少经过一次试管苗复壮培养的复壮试管苗转入生根诱导；f)生根诱导从转入生根诱导的试管苗中选取1cm～3cm高的健壮苗转入生根诱导培养基中，在25±2℃、暗培养7d～10d后，再转入到1500～2000Lux，12～14h/d光照培养，25～35d，获得完整试管植株。
2.根据权利要求1所述的在蔷薇科植物多次继代培养中，降低出现玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的在继代增殖过程中相间设置试管苗复壮培养是指在多次继代 增殖过程中，至少包括一次试管苗复壮培养，采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻 的试管苗复壮培养之间应该设置1 4次继代增殖培养。
3.根据权利要求2所述的在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于采用两次或两次以上试管苗复壮培养时，相邻的试管苗复壮培养之间应 该设置1 2次继代增殖培养。
4.根据权利要求1所述的在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的外植体的消毒是指对蔷薇科带腋芽的幼茎用流水冲洗Ih 2h， 剪取3cm 4cm带芽茎段，在超净工作台上先以75%酒精消毒30s，再用0. 升汞消毒 5min，无菌水漂洗4 5次。
5.根据权利要求4所述的在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的幼茎是指春季萌发的新梢幼茎。
6. 根据权利要求1 5之一所述的在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的 快繁育苗方法，其特征在于所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为MS培养基 +25 35g/L蔗糖+5. Og/L琼脂粉；所述的MS增殖培养基为MS+0. 3 0. 6mg/L6_BA+0. 1 0. 6mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+5. Og/L琼脂粉，pH 5. 8 ；所述的生根培养基为:1/2MS培养 基 +0. 5 2. Omg/L IBA+20g/L 蔗糖 +5. Og/L 琼脂粉，pH 5. 8。全文摘要
本发明提供了一种在蔷薇科植物多次继代培养中降低出现玻璃化的快繁育苗方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、继代增殖、生根诱导，其特征在于在继代增殖过程中，相间进行试管苗复壮培养，然后再选取健壮的1cm～3cm高的试管苗转到生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株，所述的复壮培养采用的是不含任何外源植物激素的启动培养基壮苗。本发明的方法快速、高效，成本低，便于推广，遗传稳定性好，培养过程中玻璃化比例低，增殖系数维持在较高水平，适用于蔷薇科植物组培快繁。
文档编号A01H4/00GK101965797SQ20101051803
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者常有宏, 李晓刚, 杨青松, 王宏伟, 蔺经 申请人:江苏省农业科学院