专利名称：Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定的制作方法
AAD-1事件DAS-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件
特异性鉴定
背景技术：
aad-Ι基因(最初来自Sphingobium herbicidovorans)编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase，AAD-1)蛋白。该性状赋予针对2，4_ 二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如喹禾灵(quizalofop))除草剂的耐受性，并可在植物转化过程中和育种苗圃中用作选择性标记。aad-Ι基因自身，首先在WO 2005/107437(亦参见US 2009-0093366)中公开其涉及除草剂耐受性。植物中异源或外源基因的表达受外源基因插入染色体的位置影响。这可能由于例如染色质结构(例如异染色质)或转录调节元件(例如增强子)与整合位点的靠近程度 (Weising等，Ann. Rev. Genet 22 =421-477,1988)。相同类型的转基因植物(或其他生物) 中的相同基因可在不同事件的表达水平中呈现广泛的差异。在表达的空间或时间样式上也可能存在差异。举例而言，在多种植物组织中转基因的相对表达的差异可能不对应于因导入的基因构建体中存在的转录调节元件而期待的样式。因此，常常构建并筛选大量的事件以对于给定目的鉴定表达导入的感兴趣的基因至令人满意的程度的事件。对于商业目的，通常产生成百上千的不同事件，并就具有所需转基因表达水平和样式的单个事件对这些事件进行筛选。具有所需的转基因表达的样式和/ 或水平的事件可用于将所述转基因通过使用常规育种方法的有性异型杂交(outcross)而渐渗入其他遗传背景。此类杂交的后代保持起始转化体的转基因表达特征。该策略在多种良好适应于当地生长条件的品种中用于确保可靠的基因表达。美国专利申请20020120964 Al 和 20040009504 涉及棉花事件 PV-GHGT07 (1445)， 及其组合物和检测方法。WO 02/100163涉及棉花事件M0NI5985，及其组合物和检测方法。 WO 2004/011601涉及棉花事件M0N863，及其组合物和检测方法。WO 2004/072235涉及棉花事件MON 88913，及其组合物和检测方法。WO 2006/098952 涉及玉米事件 3272。WO 2007/142840 涉及玉米事件 MIR162。美国专利号7，179，965涉及具有cry IF事件和cry IAc事件的棉花。具有本文中公开的特定事件的AAD-I玉米之前并未公开。
发明内容
本发明涉及命名为DAS-40278_9(具有保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的登录号PTA-10244的种子)的AAD-I玉米事件，及由其衍生的后代。本发明的其他方面包括玉米事件DAS-40278-9的后代和种子和植物的可再生(regenerable)部分或谷粒和种子、 后代植物，以及从任何上述所制备食物或饲料产品。本发明还包括玉米事件DAS-40278-9 的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、茎(shoots)、根和叶，以及营养细胞、花粉细胞和卵细胞的细胞核。本发明进一步涉及具有对苯氧基植物生长素性(phenoxy auxinic)和 /或芳氧基链烷酸酯除草剂具有耐受性的玉米植物，玉米事件DAS-40278-9的新颖遗传组合物，和包含玉米事件DAS-40278-9的玉米植物的农艺学表现(agronomic performance)方面。 本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括玉米植物中的新颖 aad-Ι转化事件，其包含如本文中所述的多核苷酸序列插入玉米细胞的基因组内的特异性位点。 在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可与其他性状“层叠”，包括，例如其他除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制性蛋白。然而，本主题发明包括具有如本文中所述的单一事件的植物。其他性状可通过含有玉米事件DAS-40278-9的转基因植物的植物育种、重新转化，或通过藉由同源重组的靶向整合添加新性状来层叠入植物基因组。其他实施方案包括切出包含玉米事件DAS-40278-9的多核苷酸序列，包括例如， pat基因表达盒。当切出多核苷酸序列之后，可将修饰的事件重新靶向特定染色体位点，其中其他多核苷酸序列与玉米事件DAS-40278-9层叠。在一个实施方案中，本发明涵盖了位于在染色体2上在2008 DAS玉米连锁图上大约 20cM 处在 SSR 标志物 UMCU65(参见 SEQ ID N0:30 和 SEQ ID NO 31)和 MMC0111(参见 SEQ ID N0:32和SEQ ID NO 33)之间的大约20cM处的玉米染色体靶位点，其中所述靶位点包含异源核酸。在另一个实施方案中，如本领域技术人员会理解，本发明涵盖包含在如本文中所述的SEQ ID NO : 及其残基中定义或由如本文中所述的SEQ ID NO : 及其残基定义的位置的玉米染色体靶位点。在一个实施方案中，本发明涵盖了制备转基因玉米植物的方法，包括将异源核酸插入2008DAS玉米连锁图上大约20cM处的SSR标志物UMC1265 (参见SEQ ID NO 30和SEQ ID NO 31)和 MMC0111 (参见 SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :33)之间的大约 20cM 处的位置。 还在另一个实施方案中，插入的异源核酸的5’侧为对于SEQ ID NO : 如本文中所定义的 5’侧翼序列的全部或部分，且3’侧为对于SEQ ID NO 29如本文中所定义的3’侧翼序列的全部或部分。此外，本发明提供了用于检测样品(例如玉米粒)中本主题事件的存在的测定法。 所述测定法可基于重组构建体的DNA序列插入玉米基因组，和基于在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行所述测定法的试剂盒和条件。因此，本主题发明部分涉及全部AAD-I插入及其边界区(在转基因玉米品系中) 的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于这些插入和边界序列，生成了事件特异性引物。PCR分析阐明了可通过对用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的分析来鉴定这些事件。因此，这些和其他相关方法可用于独特地鉴定包含本主题发明的事件的玉米品系。
图1显示pDAS1740的质粒图。图2显示对于DAS-40278-9 (pDAS1740)的插入的组分。图3显示对于DAS-40278-9 (pDAS1740)的插入的限制图和组分。图4显示对于DAS-40278-9的DNA插入和边界的扩增子、引物和克隆策略。图5图示相对于DAS-40278-9的插入和边界的引物位置。
图6图示DAS-40278-9的连接区和插入。图7是实施例7中提及的育种概略。序列简述SEQ ID NO 1-28为本文中所述的引物。SEQ ID NO 29提供了对于本主题事件DAS-40278-9的插入和侧翼序列。SEQ ID NO :30-33为用于实施例4中所述的侧翼标志物的引物。
具体实施例方式本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括玉米植物(玉米)的新颖转化事件，其包含如本文中所述的本主题aad-Ι多核苷酸序列插入玉米细胞的基因组内的特异性位点。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列可与其他性状“层叠”，(例如如其他除草剂耐受性基因和/或编码昆虫抑制性蛋白的基因)。在一些实施方案中，可以将所述多核苷酸序列切出，其后用别的多核苷酸序列重新靶向。然而，本主题发明包括具有如本文中所述的单一事件的植物。此外，本主题发明提供了用于检测样品中本主题事件的存在的测定法。本主题发明的诸方面包括设计和/或产生任何本文中例示或提出的诊断性核酸分子，特别是那些全部或部分基于本主题侧翼序列的方法。更具体而言，本主题发明部分涉及转基因玉米事件DAS-40278_9(亦称作 PDAS1740-278)，包含这些事件的植物品系，和该插入和/或其边界区的DNA序列的克隆和分析。可使用本文中公开和提出的序列检测本主题发明的植物品系。在一些实施方案中，本发明涉及除草剂耐受性玉米品系及其鉴定。本主题发明部分涉及检测本主题事件的存在以确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的事件。此外，包括了用于检测所述事件的方法，且其有助于例如，遵守要求来源于重组作物植物的食物的上市前批准和标记的规定。可以通过任何公知的核酸检测方法如聚合酶链式反应(PCI )或使用核酸探针的DNA杂交来检测本主题事件的存在。例如，Windels等(Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b :459462,1999)讨论事件特异性PCR测定法。其涉及使用跨越插入和侧翼DNA之间的连接的引物组通过PCR来鉴定草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。更具体而言， 一个引物含有来自插入的序列，而第二引物含有来自侧翼DNA的序列。通过来自Sphingobium herbicidovorans、编码芳氧基链烷酸双加氧酶(AAD-1) 蛋白的aad-Ι基因的插入来修饰玉米。该性状赋予针对2，4_ 二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如喹禾灵)除草剂的耐受性，并可在植物转化过程中和育种苗圃中用作选择性标记。用来自质粒PDAS1740的DNA片段来通过育种进行玉米的转化，以产生事件DAS-40278-9。从就AAD-I玉米事件DAS-40278-9的分子表征选择的来源于事件DAS-40278-9的五个世代和每世代四株植物的二十株个体玉米植物提取基因组DNA样品。使用AAD-I特异性快速测试条试剂盒(AAD-lspecific rapid test strip kit)测试AAD-I蛋白表达。仅选择就AAD-I蛋白表达测试为阳性的植物用于后续的分子表征。Southern杂交确证aad-1 基因存在于就AAD-I蛋白表达测试为阳性的玉米植物，且所述aad-Ι基因当与aad-Ι基因探针杂交时作为单个完整的拷贝插入这些植物。
本文中亦描述了 AAD-I玉米事件DAS-40278-9中插入的DNA的分子表征。该事件是通过用质粒PDAS1740的Fsp I片段的Whiskers转化来产生的。使用Southern印迹分析建立插入的DNA片段的整合样式，并确定事件DAS-40278-9中的aad-Ι基因的插入/拷贝数。生成数据以阐明所述aad-Ι转基因插入玉米基因组的整合和完整性。评价了非编码区(设计用于调节编码区)如启动子和终止子，基质连接区RB7 Mar v3和RB7 Mar v4的整合的表征，以及世代之间该转基因插入的稳定性。在植物的五个不同世代之间阐述了插入的DNA的稳定性。此外，通过几乎覆盖质粒PDAS1740的限制性位点(Fsp I)侧翼的整个骨架区的探针阐明了不存在包括氨苄青霉素抗性基因(Ap1O区的转化质粒骨架序列。基于事件DAS-40278-9的这些Southern印迹分析绘制插入的具体物理图。在玉米组织中确定AAD-I蛋白的水平。此外，对玉米草料(forage)和谷粒进行了组成分析以调查同基因非转化的玉米品系和转基因玉米品系DAS-40278-9 (未喷洒的，喷洒2，4-D的，喷洒喹禾灵，以及喷洒2，4-D和喹禾灵)的等价性。亦将同基因非转化的玉米品系的农艺学特征与DAS-40278-9玉米相比。在同一年在位于Iowa，Illinois (2 个位置)，Indiana, Nebraska 和 Ontario, Canada的六个位置进行非转基因对照和含有芳氧基链烷酸双加氧酶_1 (AAD-I)的杂交玉米品系的田间表达，营养组成和农艺学试验。在本文中总结了叶、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中AAD-I蛋白的表达水平，农艺学确定的结果，和来自对照和DAS-40278-9 AAD-I玉米的草料和谷粒样品的组成分析。在玉米叶、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中使用定量酶联免疫吸附分析(ELISA) 方法来测量可溶性、可提取的AAD-I蛋白。如本文中更加详细讨论的，在根和花粉组织中观察到良好的平均表达值。对于所有的喷洒处理以及对于用2，4-D和喹禾灵除草剂喷洒和未喷洒的地块(plot)表达值是类似的。进行组成分析，包括营养成分(proximates)、矿物质、氨基酸、脂肪酸、维生素、抗营养和次级代谢物，以调查DAS-40278-9 AAD-I玉米(经或不经除草剂处理)与对照的等价性。自对照和DAS-40278-9 AAD-I玉米地块收集的农艺学分析，对于DAS-40278-9 AAD-I 组合物样品的结果均相对于对照品系和/或常规玉米一样或更加良好(生物学上和农艺学上)。如上文在背景部分所提及，转基因导入和整合植物基因组涉及一些随机事件(因此对于表达的给定插入使用名称“事件”)。即，存在多种转化技术如土壤杆菌转化，“基因枪 (gene gun) ”，和WHISKERS的情况下，无法预测转基因会插入基因组的何处。因此，鉴定插入两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入事件的植物可为重要的。举例而言， 可设计生成跨越插入和宿主基因组连接区的PCR扩增子的PCR引物。该PCR扩增子可用于鉴定独特或不同类型的插入事件。由于“事件”原本为随机事件，因此作为本公开的一部分，在美国典型培养物保藏中 (American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110)保藏了包含所述事件的玉米品系的至少2500个种子，并使公众可以不受限制的获得(但专利权适用)。该保藏命名为ATCC保藏号PTA-10244(黄色马齿型玉 ^ (Yellow Dent maize) 1 禾中 (Zea Mays L. ) :DAS-40278-9, Dow AgroSciences LLC保藏；ATTC接收种子/菌株的日期2009年7月10日，2009年8月17日确认存活)。该保藏是，并会维持是为了专利程序的目的依照布达佩斯条约进行的，并受其涉及种子保藏的条款约束。该保藏会不设限地保持在ATCC保藏机构(其为公开保藏机构)至下述之中最晚者30年，或最后一次要求之后五年，或本专利的有效期限，并在此期间，若其不具生活力，则会加以替换。保藏的种子是本主题发明的一部分。显然，可从这些种子培育玉米植物，且此植物是本主题发明的一部分。本主题发明还涉及这些玉米植物中所含的DNA序列，其可用于检测这些植物及其后代。本主题发明的检测方法和试剂盒可涉及鉴定任何一个、两个或甚至所有三个这些事件，取决于该测试的最终目的。本文中提供的定义和实例是为了帮助描述本发明并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非临行指明，应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解术语。使用如列于37 CFR § 1. 822的DNA碱基命名法。如用于本文，术语“后代”指包含AAD-I玉米事件DAS-40278-9的亲本植物的任何世代的后代。转基因“事件”是通过用异源DNA，即含有感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，重新产生由将所述转基因插入植物基因组所得的植物群体，并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指起始转化体和转化体含有所述异源DNA的后代。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，插入的转基因DNA和来自转化的亲本的侧翼基因组DNA (基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自起始转化体及其包含插入的DNA和直接邻接插入的DNA的侧翼基因组序列的后代的DNA，期待其会转移至下述后代，所述后代作为一个含有所述插入的DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该插入的 DNA的亲本系有性杂交的结果而接受了含有感兴趣的转基因的插入的DNA。“连接序列”跨越了插入基因组的DNA与来自插入点侧翼的玉米天然基因组的DNA 连接的点，其中植物基因物质中一种或其他连接序列的鉴定或检测足以对所述事件具诊断性。包括了跨越本文中所述的玉米事件中的插入和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断性序列的具体实例；然而，其他与插入的连接处或插入和基因组序列的连接处重叠的序列也具诊断性，并可根据本发明使用。本主题发明涉及此类侧翼、连接处和插入序列的鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。根据本主题发明，使用跨越插入的DNA及其边界的扩增子的PCR分析方法可用于检测或鉴定商业化的转基因玉米品种或来源于本主题专利的转基因玉米品系的品系。这些插入的每一个的整个序列，以及相应的侧翼序列的部分，在本文中提供为SEQ ID N0:29。相对于SEQ ID NO :29 (总共8557碱基对)的本事件的插入和侧翼序列的坐标列于下表。例如，这在实施例3. 8中更加详细地讨论。
权利要求
1.一种转基因玉米植物，其包含基因组，所述基因组包含SEQ ID N0:29。
2.—种玉米种子，其包含基因组，所述基因组包含如以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子中存在的AAD-I事件DAS-40278-9。
3.一种玉米种子，其包含基因组，所述基因组包含SEQ ID N0:29。
4.一种玉米植物，其通过培育权利要求2的种子产生，所述植物包含SEQ ID NO 29
5.一种权利要求4的玉米植物的后代植物，所述后代植物包含AAD-I事件 DAS-40278-9。
6.一种权利要求1的玉米植物的除草剂耐受后代植物，所述后代植物包含SEQ ID NO29。
7.一种转基因玉米植物，其包含在位于染色体2上SSR标志物UMC1265和MMCOl 11之间的大约20cM的玉米染色体靶位点中的转基因插入，其中UMC1265可通过SEQ ID NO 30 和SEQ ID NO 31部分扩增，MMCOl 11可通过SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33部分扩增，其中所述靶位点包含异源核酸。
8.一种制备转基因玉米植物的方法，包括将异源核酸插入于染色体2上SSR标志物 UMC1265和MMC0111之间的大约20cM处的位置，其中UMC1265可通过SEQ ID NO :30和SEQ ID NO 31部分扩增，且MMCOl 11可通过SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33部分扩增。
9.权利要求4的植物的部分，其中所述部分选自下组花粉、胚珠、花、荚壳(boll)、绒毛(lint)、茎(shoot)、根和叶，所述部分包含SEQ ID NO :29。
10.一种转基因玉米植物，其包含转基因，所述转基因插入或侧翼为选自下组的基因组序列SEQ ID NO 29 的残基 1-1873 和 SEQ ID NO 1 的残基 6690-8557。
11.一种分离的多核苷酸分子，其中所述分子包含至少15个核苷酸，并在严格洗涤条件下维持与选自下组的核酸序列的杂交SEQ ID NO : 的残基1-1873，SEQ ID NO : 的残基6690-8557，及其互补物。
12.—种分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 1-28 和 30-33。
13.一种分离的多核苷酸，其在严格洗涤条件下与选自下组的核苷酸序列杂交SEQ ID NO 29的残基1863至1875，SEQ ID NO 29的残基6679至6700，及其互补物。
14.权利要求13的多核苷酸，其中所述多核苷酸是由聚合酶链式反应生成的扩增子。
15.一种在包含玉米DNA的样品中检测玉米事件的方法，其中所述方法包括将所述样品与至少一种对AAD-I玉米事件DAS-40278-9具诊断性的多核苷酸相接触，所述AAD-I玉米事件DAS-40278-9存在于以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC) 的种子中。
16.权利要求15的方法，其中所述方法包括将所述样品与下述相接触a.第一引物，其结合于选自下组的侧翼序列=SEQID NO J9的残基1-1873，SEQ ID N0 29的残基6690-8557，及其互补物；和b.第二引物，其结合于包含SEQID NO 1的残基1874-6689的插入序列或其互补物；对所述样品进行聚合酶链式反应，并测定由所述引物生成的扩增子。
17.权利要求16的方法，其中所述引物选自下组=SEQID NO :1_28。
18.权利要求15的方法，其中所述多核苷酸包含至少30个核苷酸，并在严格条件下与选自下组的序列杂交SEQ ID NO 29的残基1863至1875，SEQ ID NO 29的残基6679至 6700，及其互补物；其中所述方法进一步包括将所述样品和所述多核苷酸置于严格杂交条件下；并就所述多核苷酸对所述DNA的杂交测定所述样品。
19.一种DNA检测试剂盒，其包含权利要求17的第一引物和第二引物。
20.一种用于进行权利要求18的方法的DNA检测试剂盒。
21.—种DNA检测试剂盒，其包含如SEQ ID NO :13中限定的多核苷酸。
22.—种多核苷酸，其包含SEQ ID N0:29。
23.—种产生权利要求22的多核苷酸的方法。
24.—种将转基因插入玉米基因组的DNA区段的方法，所述DNA区段包含5’端和3’ 端，所述5，端包含SEQ ID NO 29的核苷酸残基1_1873，且所述3，端包含SEQ ID NO=I的核苷酸残基6690-8557。
25.—种对玉米植物进行育种的方法，所述方法包括将包含SEQ ID N0:29的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生包含基因组的第三玉米植物，和就所述基因组中SEQ ID NO 29的存在测定所述第三玉米植物。
26.一种将除草剂耐受性状渐渗入玉米植物中的方法，所述方法包括将包含SEQ ID NO 29的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生包含基因组的第三玉米植物，和就所述基因组中SEQ ID NO 29的存在测定所述第三玉米植物。
全文摘要
本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受植物。本发明包括玉米植物中的新颖aad-1转化事件，所述事件包含如本文中所述的多核苷酸序列，其插入玉米细胞的基因组内的特定位点。在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可与其他性状包括，例如其他除草剂耐受基因和/或昆虫抑制性蛋白相“层叠”。此外，本主题发明提供了用于检测(例如玉米粒的)样品中本主题事件的存在的测定法。所述测定法可基于插入玉米基因组的重组构建体的DNA序列，和基于所述插入位点侧翼的基因组序列。亦提供了可用于进行所述测定的试剂盒和条件。
文档编号A01H5/00GK102573452SQ201080047187
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月18日 优先权日2009年8月19日
发明者D.莫姆, G.吉尔斯, J.布赖恩, J.汉米尔顿, N.周, N.瓦诺普多普, N.阿诺德, T.凯泽, T.赖特, Y.C.崔 申请人:陶氏益农公司