专利名称：一种禾草种子高效无菌苗获得的方法
技术领域：
本发明涉及一种禾草种子高效无菌苗获得的方法。
背景技术：
羊草(Leymuschinensis)、新麦草(Psathyrostachys juncea)、高羊茅(Testucaarundinacea)等禾本科草的种子外面有外稃和内稃包裹，用普通方法灭菌常常不彻底，在用种子诱导愈伤组织或种无菌苗方面存在困难。过去诱导无菌苗和愈伤组织多用幼穗做材料，受季节影响，只能在幼穗期进行。用成熟种子诱导需要人工剥去外稃和内稃，费时费力。因此如何高效率灭菌获得禾草种子无菌苗和愈伤组织的方法在科研和实践上有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种禾本科草的无菌苗获得的方法，包括如下步骤将预处理过的禾本科草种子培养，得到所述无菌苗；所述预处理包括如下步骤I)去稃将禾本科草种子与浓硫酸混合1-3分钟，优选混合2分钟，去除所述浓硫酸；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到去稃后的禾本科草种子；2)灭菌将去稃后的禾本科草种子与乙醇水溶液混合2-4分钟，优选混合3分钟，去除乙醇水溶液；然后将禾本科草种子与体积百分含量为8-12%的次氯酸钠水溶液混合12-17分钟，优选混合15分钟，去除次氯酸钠水溶液；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到灭菌后的禾本科草种子。步骤I)中，所述浓硫酸的体积百分浓度为98% ;步骤2)中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为65% -75%，优选为70%，所述次氯酸钠水溶液的体积百分浓度为10%。所述禾本科草种子、所述浓硫酸、所述乙醇水溶液和所述次氯酸钠水溶液的配比是(6-10) g (80-120) ml (80-120) ml (80-120) ml ;优选配比是8g 100ml 100ml 100ml。进一步讲，上述预处理还包括在步骤I)去稃之前的除杂，所述除杂包括如下步骤将禾本科草种子与65%-75% (体积百分含量)乙醇水溶液混合，去除不饱满的种子和杂物。上述培养是指将预处理过的禾本科草种子置于诱导培养基中诱导培养，所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D形成的固体培养基，所述2，4-D在所述诱导培养基中的终浓度为l_3mg/L。所述2，4-D在所述MS诱导培养基中的终浓度为2mg/L。所述MS基本培养基的溶剂是水，溶质如表I所示。表I. MS基本培养基(pH5. 8)的溶质
权利要求
1.禾本科草的无菌苗获得的方法，包括如下步骤将预处理过的禾本科草种子培养，得到所述无菌苗；所述预处理包括如下步骤 1)去稃将禾本科草种子与浓硫酸混合1-3分钟，优选混合2分钟，去除所述浓硫酸；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到去稃后的禾本科草种子； 2)灭菌将去稃后的禾本科草种子与乙醇水溶液混合2-4分钟，优选混合3分钟，去除乙醇水溶液；然后将禾本科草种子与体积百分含量为8-12%的次氯酸钠水溶液混合12-17分钟，优选混合15分钟，去除次氯酸钠水溶液；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到灭菌后的禾本科草种子。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤I)中，所述浓硫酸的体积百分浓度为98% ;步骤2)中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为65% -75%，优选为70%，所述次氯酸钠水溶液的体积百分浓度为IO %。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述禾本科草种子、所述浓硫酸、所述乙醇水溶液和所述次氯酸钠水溶液的配比是(6_10)g (80-120)ml (80-120)ml (80-120)ml ;优选配比是 8g 100ml 100ml 100ml。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述预处理还包括在步骤I)去稃之前的除杂，所述除杂包括如下步骤将禾本科草种子与65%-75% (体积百分含量)乙醇水溶液混合，去除不饱满的种子和杂物。
5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述培养是指将预处理过的禾本科草种子置于诱导培养基中诱导培养，所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加2,4-D形成的固体培养基，所述2，4-D在所述诱导培养基中的终浓度为l-3mg/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述2，4-D在所述MS诱导培养基中的终浓度为2mg/L。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述MS基本培养基的溶剂是水，溶质 如表I所示。
8.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述培养的时间为7天以上，优选11天以上；所述培养的光照周期为每天16小时光照/8小时黑暗。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述光照周期中光照时的光照强度为4000-120001UX，优选为80001ux，温度为25_30°C，优选为28 V ;所述光照周期中黑暗时的温度为18-22°C，优选为20°C。
10.如权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述禾本科草种子为羊草种子。
全文摘要
本发明公开了一种禾草种子高效无菌苗获得的方法。该方法包括如下步骤将预处理过的禾本科草种子培养，得到所述无菌苗；所述预处理包括如下步骤1)去稃将禾本科草种子与浓硫酸混合1-3分钟，去除所述浓硫酸；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到去稃后的禾本科草种子；2)灭菌将去稃后的禾本科草种子与乙醇水溶液混合2-4分钟，去除乙醇水溶液；然后将禾本科草种子与体积百分含量为8-12％的次氯酸钠水溶液混合12-17分钟，优选混合15分钟，去除次氯酸钠水溶液；然后将所述禾本科草种子用水清洗，得到灭菌后的禾本科草种子。本发明提供的高效率灭菌获得禾草种子无菌苗和愈伤组织的方法在科研和实践上有重要的意义。
文档编号A01H4/00GK102870671SQ20111019269
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者刘公社, 马兴勇, 程丽琴, 李晓峰, 彭献军, 齐冬梅, 陈双燕 申请人:中国科学院植物研究所