专利名称：一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法
技术领域：
本发明涉及烟草组织培养领域，特别是涉及一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法。
背景技术：
烟草(Nicotiana tabacum 1^.),属爺科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana) —年生草本植物。烟草是植物转基因的优良受体和细胞遗传学的模式植物，常被用来开展外源基因的表达和功能验证，同时，在生物工程领域被用来作为一种植物生物反应器有效表达一些有实用价值的蛋白如人血清蛋白、生长调节物质、疫苗、抗体、工业酶、生物多聚物等， 另外，利用烟草尼古丁的神经毒性可用来制造杀虫剂，还可以从烟草中提取苹果酸、柠檬酸等物质。烟草组织培养工作开展较早，主要包括花粉培养、花药培养和外植体愈伤诱导等， 目前，花药培养成为了烟草组织培养的主要手段，但花药培养存在花药萌发时间偏长、加倍效率较低、后期工作量大、花药壁体细胞愈伤组织的干扰、后代群体遗传同源性稍低及难以获得大量有突破性的育种材料等缺点，且对于花粉较少的植物难以获得大量目标材料。
发明内容
本发明针对现有烟草组织培养的不足，提供一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法，从花药中快速大量释放并获取花粉，在花粉处于液体培养的游离状态下用秋水仙素对其实施加倍处理，花药萌发时间短、加倍效率高，较好的解决花药培养过程中存在的诸多问题，为烟草作为植物生物反应器的规模化生产提供大量正常普通栽培种材料载体，同时为烟草分子生物学研究尤其是数量性状的遗传机理剖析提供大批高质量的双单倍体株系作为基础试验材料。所述一种高效烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于依次按以下操作步骤进行(1)、花蕾采取保存于晴天在烟草植株主花序或侧花序上采取无病虫、生长良好的处于单核靠边期的适龄花蕾一株或多株，将取好的花蕾迅速用冰盒保存；O)、花药消毒将步骤1中保存在冰盒内的花蕾在超净工作台上剥取花蕾中的花药，然后将剥取的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜包裹浸入70-75%浓度的酒精中消毒 10-1 ，快速取出立即浸入饱和Ca(a0)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒过程中轻轻晃动烧杯使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次；(3)、花粉获取取出经步骤2消毒好的花药放入圆底试管中，加入l_3ml的B5-13 液体培养，再加入l_2ml用于软化花药壁的酶液，轻轻碾成勻浆，倒入装有300-400目双层尼龙膜的漏斗中过滤，并用离心管收集滤液，向装有滤液的离心管中加入B5-13液体培养至设定刻度，离心处理后去上清液，再加入B5-13液体培养重新悬浮，二次离心后再去上清液；
0)、花粉加倍与培养向步骤3中两次离心后得到的花粉中加入含有浓度为 50-70mg/L秋水仙素的NLN-16液体培养基，使其重新悬浮后分装到培养皿或玻璃三角瓶中，密封好后静置于温度为30-33°C的避光环境下培养48-7池，对花粉进行加倍处理；然后将加倍处理后的花粉转移到离心管，离心处理后去上清液，加入NLN-13液体培养基，分装入培养皿中，再次静置于低温环境下暗培养14-21d ；(5)、幼胚培养待步骤4中装入加倍花粉的培养皿内出现肉眼可见胚时，便将其置于23-26°C恒温摇床上，振荡暗培养7-10d，并对其进行定时观察，将达到子叶期的胚转入MS固体培养基上进行继代培养，其温度为25-27°C，每日光照8-lOh ； (6)、烟苗移栽待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12cm高时，敞开瓶口炼苗2_3d，然后将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中。所述方法还包括染色体倍性的检测步骤，其具体操作如下从步骤5中获得的烟株上采取小面积的无菌苗叶片放置在无菌试验台或是玻璃器皿中，向叶片滴加细胞裂解液，之后，立即将其切碎，然后将切碎的叶片置于流式细胞仪中检测染色体倍性；或者从步骤5中获得六片真叶以上的烟株上上采取叶片，取叶片的下表皮并置于载玻片上，滴入一滴碘-碘化钾溶液染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的显微镜下观察其染色体倍性。步骤1中所述的适龄花蕾为花粉发育时期为单核靠边期、花萼与花冠等长的花蕾，其蕾长范围在2. 0-2. 3cm之间。步骤2中饱和Ca(Cno)2溶液浓度为10%，其消毒时间为8-lOmin ；无菌水冲洗2_3 次，每次为3-5min。步骤3中所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液，酶液中纤维素酶、 果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0. 6%,0. 2%和0.5%。步骤3中第一次离心和步骤4中的离心时间为5-6min，转速为1000-1100r/min， 步骤3中第二次离心时间为5-6min，转速500_600r/min。步骤4选用直径为7. 5cm的培养皿或IOOml的玻璃三角瓶，分装到培养皿或玻璃三角瓶中的花粉混合液其密度为3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。步骤4中的第一次避光培养的温度为32°C，第二次避光培养的温度为25°C。步骤5中恒温摇床的振荡转速为55-65r/min。本发明对不同烟草类型均适用，尤其适用于普通烟草类型中的烤烟、白肋烟等。 用本发明的方法对烤烟和白肋烟的离体花粉进行液体培养，具有花粉萌发成胚时间短、加倍效率高、产量大及较容易获得优良变异育种中间材料等优点，在DH群体构建、育种材料提纯复壮、种质资源创新、多倍体育种及花粉发育进程研究等方面内容，具有较大的实用价值。可为烟草作为植物生物反应器的规模化生产提供大量正常普通栽培种材料载体， 同时为烟草分子生物学研究尤其是数量性状的遗传机理剖析提供大批高质量的双单倍体 (doubled haploid,DH)株系作为基础试验材料，也可以为烟草细胞学、胚胎学、突变体研究以及生理学等生命科学基础理论研究提供良好的研究对象。
图1为已知普通栽培种烤烟流式细胞仪倍性检测图；图2为单倍体流式细胞仪倍性检测图；图3为双单倍体流式细胞仪倍性检测图；图4为单倍体气孔叶绿体数检测示意图；图5为双单倍体气孔叶绿体数检测示意图；图6为多倍体气孔叶绿体数检测示意图
具体实施例方式实施例1、烤烟花粉的离体液体培养，具体步骤依次如下(1)、花蕾采取于晴天取典型烟草植株主花序上无病虫、生长良好的、处于单核靠边期的花蕾，其外观表现为花萼与花冠大致等长，蕾长在2. 1-2. 21cm之间，取好的花蕾迅速用冰盒4-7°C保存；O)、花药消毒在超净工作台内用镊子小心将步骤1中花蕾的花药剥取出，然后用无菌市售丝袜包裹花药浸入浓度为70%的酒精中消毒15s，快速取出立即浸入浓度为 10%的饱和次氯酸钙(Ca(ClO)2)溶液中消毒8min，不时轻轻晃动烧杯以使其消毒充分，最后用无菌水冲洗2次，每次5min ；(3)、花粉获取取步骤2中消毒好的花药放入圆底大试管中，加入aiil的B5-13液体培养(B5基本培养基中蔗糖浓度为13% )，再加入纤维素酶的质量浓度为0. 6%、果胶酶的质量浓度为0. 2%和蜗牛酶的质量浓度为0. 5%的混合酶液用于软化花药壁，之后用玻璃棒轻轻碾成勻浆，倒入装有300目双层尼龙膜的漏斗中过滤，用IOml的离心管收集滤液， 加B5-13液体培养至所需刻度，离心6min，转速lOOOr/min，弃上清液，加B5-13液体培养重新悬浮，离心6min，转速500r/min ；(4)、花粉加倍与培养将步骤3中离心后的上清液去掉，加入含有浓度为55mg/L 秋水仙素的NLN-16液体培养基重新悬浮后，分装到直径为7. 5cm的培养皿中，密度约为3 蕾/ml-4蕾/ml，每皿^il，32°C静置避光培养56h，然后将加倍处理后的花粉转移到IOml离心管，离心6min，转速lOOOr/min，去上清液，加入NLN-13液体培养基，分装入直径为7. 5cm 培养皿，每皿约anl，25°C静置暗培养18d ；(5)、幼胚培养待步骤4中培养皿中出现肉眼可见胚时，置于25°C恒温摇床上，振荡暗培养8d，转速为65r/min，达到子叶期的胚可转入MS固体培养基上进行电脑自动控制的继代培养，温度为25°C，每日光照他。(6)、染色体倍性检测可以取出步骤e中获得的烟株上的上层叶片，叶片面积大小为2cmX2cm左右，放入细胞裂解液后，立即用锋利的刀片切碎，然后将该混合液置于流式细胞仪(PARTEC，德国)中检测染色体倍性，上样后流式细胞仪自动生成代表该样品染色体倍性的DNA含量分布图(如图2、3)。以已知普通栽培种烤烟(图1)作为对照来调整流式细胞仪，使代表对照样品DNA含量的波峰位于100道附近。然后测定待测样本的波峰，出现在50道和100道附近的峰值分别代表单倍体合单双倍体，从而确定各再生植株的染色体倍性。(7)、烟苗移栽待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12cm高时，敞开瓶口炼苗2-3d，可移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中，移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带的培养基，然后待开花可套袋结实。由步骤(6)检测出来试验结果表明，在随机检测的57个样品中，有44个为双单倍体，占77. 2%，因此，用本发明方法对烤烟花粉进行离体液体培养加倍效率可达75%以上。实施例2、白肋烟花粉的离体液体培养(1)、花蕾采取于晴天取典型烟草植株侧花序上无病虫、生长良好的、处于单核靠边期花蕾，其外观表现为花萼与花冠大致等长，蕾长在2. 0-2. ^cm之间，取好的花蕾迅速用冰盒4_7°C保存；O)、花药消毒在超净工作台内用镊子小心剥取步骤1中花蕾的花药，然后用无菌纱布包裹花药浸入浓度为75%的酒精中消毒10s，快速取出立即浸入浓度为10%的饱和次氯酸钙(Ca(ClO)2)溶液中消毒lOmin，不时轻轻晃动烧杯以使其消毒充分，最后用无菌水冲洗3次，每次5min ；(3)、花粉获取取步骤2中消毒好的花药放入圆底大试管中，加入3ml的B5-13液体培养(B5基本培养基中蔗糖浓度为13% )，再加入纤维素酶的质量浓度为0. 6%、果胶酶的质量浓度为0. 2%和蜗牛酶的质量浓度为0. 5%的混合酶液用于软化花药壁，之后用玻璃棒轻轻碾成勻浆，倒入装有400目双层尼龙膜的漏斗中过滤，用IOml的离心管收集滤液， 加B5-13液体培养至所需刻度，离心5min，转速1100r/min,弃上清液，加B5-13液体培养重新悬浮，离心5min，转速600r/min ；(4)、花粉加倍与培养将步骤3中离心后的去上清液，加入含有浓度为65mg/L秋水仙素的NLN-16液体培养基重新悬浮后，分装到IOOml的玻璃三角瓶中，密度约为3蕾/ ml-4蕾/ml，每瓶10ml，32°C静置避光培养69h，然后将加倍处理后的花粉转移到IOml离心管，离心5min，转速llOOr/min，去掉上清液，加入NLN-13液体培养基，分装入直径为7. 5cm 培养皿，每皿约anl，25°C静置避光培养20d ；(5)、幼胚培养待步骤4中培养皿中出现肉眼可见胚时，置于25°C恒温摇床上，振荡暗培养10d，转速为55r/min，达到子叶期的胚可转入MS固体培养基上继代培养，温度为 25°C，每日光照10h，电脑自动控制。(6)、染色体倍性检测取步骤e中六片真叶以上的烟株叶片，用手小心地撕下叶片的下表皮并置于载玻片上，滴一滴1 %碘-碘化钾溶液染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的显微镜下，每切片随机选取5个气孔观察计数(如图4、5、6)，以每个气孔叶绿体平均个数在14个以下的为单倍体(如图4)，14-24个的为双单倍体(如图5)， M个以上的为多倍体(如图6)。(7)、烟苗移栽待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12cm高时，敞开瓶口炼苗2-3d，可移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中，移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带的培养基。由步骤6检测的试验结果表明，在随机检测的89个样品中，有67个双单倍体，占 75.3%，因此，用本发明方法对白肋烟花粉进行离体液体培养加倍效率可达70%以上。NLN四个母液配方如下1.大量元素(20倍)，单位g/L
权利要求
1.一种高效烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于依次按以下操作步骤进行(1)、花蕾采取保存于晴天在烟草植株主花序或侧花序上采取无病虫、生长良好的适龄花蕾一株或多株，将取好的花蕾迅速用冰盒保存；(2)、花药消毒将步骤1中保存在冰盒内的花蕾在超净工作台上剥取花蕾中的花药，然后将剥取的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜包裹浸入70-75%浓度的酒精中消毒 10-1 ，快速取出立即浸入饱和Ca(a0)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒过程中轻轻晃动烧杯使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次；(3)、花粉获取取出经步骤2消毒好的花药放入圆底试管中，加入l-3ml的B5-13液体培养，再加入l_2ml用于软化花药壁的酶液，轻轻碾成勻浆，倒入装有300-400目双层尼龙膜的漏斗中过滤，并用离心管收集滤液，向装有滤液的离心管中加入B5-13液体培养至设定刻度，离心处理后去上清液，再加入B5-13液体培养重新悬浮，二次离心后再去上清液；(4)、花粉加倍与培养向步骤3中两次离心后得到的花粉中加入含有浓度为50-70mg/ L秋水仙素的NLN-16液体培养基，使其重新悬浮后分装到培养皿或玻璃三角瓶中，密封好后静置于温度为30-33°C的避光环境下培养48-7池，对花粉进行加倍处理；然后将加倍处理后的花粉转移到离心管，离心处理后去上清液，加入NLN-13液体培养基，分装入培养皿中，再次静置于低温环境下暗培养14-21d ；(5)、幼胚培养待步骤4中装入加倍花粉的培养皿内出现肉眼可见胚时，便将其置于 23-26°C恒温摇床上，振荡暗培养7-10d，并对其进行定时观察，将达到子叶期的胚转入MS 固体培养基上进行继代培养，其温度为25-27°C，每日光照8-lOh ；(6)、烟苗移栽待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12cm高时，敞开瓶口炼苗2_3d，然后将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中。
2.根据权利要求1所述的一种高效烟草花粉离体液体培养的方法方法，其特征在于 所述方法还包括染色体倍性的检测步骤，其具体操作如下从步骤5中获得的烟株上采取小面积的无菌苗叶片放置在无菌试验台或是玻璃器皿中，向叶片滴加细胞裂解液，之后，立即将其切碎，然后将切碎的叶片置于流式细胞仪中检测染色体倍性；或者从步骤5中获得六片真叶以上的烟株上上采取叶片，取叶片的下表皮并置于载玻片上，滴入一滴碘-碘化钾溶液染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的显微镜下观察其染色体倍性。
3.根据权利要求1所述的一种高效烟草花粉离体液体培养的方法方法，其特征在于 步骤1中所述的适龄花蕾为花粉发育时期为单核靠边期、花萼与花冠等长的花蕾，其蕾长范围在2. 0-2. 3cm之间。
4.根据权利要求1所述的一种高效烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于步骤 2中饱和Ca(Cno)2溶液浓度为10%，其消毒时间为8-lOmin ；无菌水冲洗2_3次，每次为 3-5min。
5.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于步骤3中所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液，酶液中纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0. 6%、0. 2%和0. 5%。
6.根据权利要求1所述的一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于步骤3中第一次离心和步骤4中的离心时间为5-6min，转速为lOOO-llOOr/min，步骤3中第二次离心时间为5-6min，转速500_600r/min。
7.根据权利要求1所述的一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于步骤4选用直径为7. 5cm的培养皿或IOOml的玻璃三角瓶，分装到培养皿或玻璃三角瓶中的花粉混合液其密度为3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。
8.根据权利要求1所述的一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于步骤4中的第一次避光培养的温度为32°C，第二次避光培养的温度为25°C。
9.根据权利要求1所述的一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于步骤5中恒温摇床的振荡转速为55-65r/min。
全文摘要
本发明涉及一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法。该方法的操作步骤主要是在无菌条件下对经过消毒处理后的花药在B5-13液体培养的作用下通过碾压快速释放大量花粉，低速离心收集花粉，先在含有50-70mg/L浓度的秋水仙素的NLN-16液体培养基中32℃静置避光进行加倍处理，再在NLN-13液体培养基中25℃进行静置诱胚避光培养，待肉眼可见胚后置于25℃恒温摇床上振荡暗培养7-10d，达到子叶期的胚即可转入固体培养基上进行继代培养，移栽季节幼苗经炼苗后即可移栽入大田开花套袋结实。该方法具有构思新颖、设计巧妙，科学实用、高效稳定、产量大、能大大缩短烟草育种周期等特点。
文档编号A01H4/00GK102283125SQ20111020035
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年12月13日
发明者张俊杰, 曹景林, 林国平, 王毅, 祖秉桥, 蔡长春 申请人:湖北省烟草科研所