专利名称：一种新型高效生防菌肥及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生防菌肥，特别是一种含有从土壤中分离出的命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的生防菌肥，能有效治疗多种土传病害及促进植物生长的芽孢杆菌菌肥。
背景技术：
中国用7%的耕地养活着世界20%以上的人口，创造了在人多地少的国情下实现粮食基本自给的奇迹。然而，我国粮食作物和果蔬的生产却不断遭受到各种微生物病害的侵袭，造成巨大的农业经济损失，成为阻碍我国农业经济发展的严重问题之一。据统计，近年来，我国农作物害虫年平均发生面积超过1亿公顷，较20世纪80年代增加41% ；每年粮食、蔬菜两大作物的病害危害损失分别约为3000多万吨和60多万吨，仅此两项，经济损失就高达300多亿元。面对病害持续猖獗危害，我国目前主要采用以化学防治为主的病害防治手段，每年防治面积达到1亿多公顷，化学农药用量高达20万吨(有效成分)，占世界第一位。半个世纪以来，化学农药防治病虫害对农业生产起了重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏生态平衡。同时，由于病菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，出现了用药量与病害相互递增的恶性循环，增加了农产品中农药的残留量，对人畜安全构成极大的威胁。一系列问题促使人们探寻一种对人类和环境友好并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略。土传病害是指由土传病原物侵染引起的植物病害。我国蔬菜土传病害种类很多， 危害非常严重，主要有各种蔬菜苗期的猝倒病、立枯病；瓜、果、豆类作物的枯萎病；茄子黄萎病、青枯病等；大白菜软腐病；以及疫病、根腐病、菌核病等。这些病害除了猝倒病和立枯病在幼苗期发病外，大部分苗期发生不明显，一般均在营养生长期转入生殖生长(开花结果)期之间开始发病，直至中、后期，其受侵染寄主体内潜伏期较长。由于土传性病害的病原主要存在在土壤中，而且在土壤中的存活时间较长，可达2 5年，造成化学和农业措施防治非常困难，属于顽固性病害。另一方面，我国的耕地资源紧张，长期种植单一作物，无法进行轮作和休田，使得土壤病原菌愈积愈多。因此寻求一种新型高效的防治手段防治大棚蔬菜中的土传病害成为当今农业发展中的一项当务之急。生防菌肥是指，菌肥中的微生物多为拮抗菌，这些拮抗菌可以通过其生长代谢过程或其代谢产物来抑制植物病原菌，甚至杀死病原菌，从而为农作物的生长提供了保障，某些已被确认均有拮抗作用的微生物亦可促进生物菌肥的肥效。生防菌肥除具有一般生物菌肥的功效外，而且对有害微生物也具有生物防治的作用。肥料中的有益微生物生长繁殖，在作物根际土壤微生态系统中形成优势种群，限制了其他病源微生物的生长繁殖，起到减轻作物病害的功效。芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征，而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，并且批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，现已成为一种理想的生防细菌。目前植物病害生防芽孢杆菌的研究开发及应用已取得令人瞩目的成就。尽管当前化学杀菌剂在农药产业中仍占主导地位，但芽孢杆菌微生物杀菌剂，尤其是芽孢杆菌生防菌肥具有对人畜安全、对环境无污染、不易产生抗药性、高效广谱、促进作物生长等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求和农业的可持续发展战略目标。 现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型无公害绿色生防菌肥(称为“绿都1号”)，其对黄瓜枯萎病、辣椒疫霉和番茄青枯病等多种土传病害均有很强的杀菌效果。本发明的目的按下述方案实现一种预防和治疗黄瓜枯萎病、辣椒疫霉和番茄青枯病等多种土传病害的超浓缩芽孢可湿性粉剂，其有效成分是命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液体菌肥。 其有效细菌每毫升的含量为2X IOici-SXIOici个。本发明的目的在于提供一种含本发明所述枯草芽胞杆菌悬液的可湿性粉剂，所述可湿性粉剂包括芽孢杆菌悬液、载体草炭土、稳定剂PGA(藻酸丙二醇酯)和CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、助剂木质素M9、微量元素液和硅藻土。本发明中，所述用于配置可湿性粉剂的芽孢杆菌悬液的活菌数为2. OX 101°个/ml 至 3. OX IO1 个/ml。本发明中，可湿性粉剂中所含的微量元素液是由硼酸、钼酸钠和蒸馏水配置而成的，其中硼酸0. 01重量份、钼酸钠0. 01重量份、蒸馏水0. 98重量份。具体地，本发明所述的生防菌肥可湿性粉剂的组成配比为枯草芽胞杆菌悬液 0. 2-2重量份，所述枯草芽孢杆菌悬液的活菌数为2. OX 101°个/ml至3. OX 101°个/ml ；稳定剂为PGA 0. 5-5重量份，CMC-Na 1-10重量份；草炭土 50-70重量份；助剂木质素M9 1-10重量份；微量元素液0. 5-5重量份，所述微量元素液由0. 01重量份的硼酸、0. 01重量份的钼酸钠和0. 98重量份的蒸馏水配置而成；硅藻土补齐剩余重量。优选地，本发明所述生防菌肥可湿性粉剂的组成及配比为枯草芽胞杆菌悬液 0. 4-0. 8重量份，所述枯草芽孢杆菌悬液的活菌数为2. OX 101°个/ml至3. OX 101°个/ml ；稳定剂为PGA 1重量份，CMC-Na 2重量份；草炭土 60重量份；
助剂木质素M9 2重量份；微量元素液1重量份，所述微量元素液由0. 01重量份的硼酸、0. 01重量份的钼酸钠和0. 98重量份的蒸馏水配置而成；硅藻土补齐剩余重量。本发明的再一目的在于提供一种制备本发明所述生防菌肥的生产工艺，其生产工艺为芽孢杆菌活化、扩繁、接种培养、发酵罐培养、制备液体菌肥，加草炭土载体、稳定剂和助剂、制作固体菌肥。上述生产工艺包括(1)菌种活化将4°C下斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株置于活化培养1 池，然后将其划线接种于LB固体平板培养基上，培养Mh。(2)菌株种子液制备挑取活化的菌株菌落，接种到LB液体培养基中，于30°C、150rpm下培养20h。(3)种子罐接种培养将上述种子液按3%的体积比接种至培养液中，转速210转/分，3d，PH值5-9，通气量1 1。(4)发酵罐发酵移种至发酵罐，转速200转/分，5d，PH值5-9，通气量1 1。检查芽胞形成的比率，并要求生孢率达90%以上。收集菌液为液体菌肥。(5)载体材料及稳定剂助剂的准备选择对芽孢杆菌菌株无毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5 7. 0之间、颗粒细小且
易与种子粘着、不易结块、廉价的草炭土为接种载体。
稳定剂为PGA1份(重量分数)
CMC-Na2份(重量分数)
主要载体为草炭土60份(重量分数)
其它助剂为M92份(重量分数)
微量元素液1份(重量分数)其中微量元素液为硼酸0. 01份，钼酸钠0. 01份，蒸馏水0. 98份。硅藻土补齐(6)固体菌肥“绿都1号”制作按照1 10(V/w，ml/g)将发酵菌悬液接种到高温灭菌后的草炭土上混勻后，加稳 定剂、助剂(在无菌操作下)，包装。下面叙述生防菌肥“绿都1号”的优点和积极效果1广谱性好。对黄瓜枯萎病、辣椒疫霉、番茄青枯病等多种土传病害有明显的防治 效果。尤其在番茄晚霉病菌的防治方面有突出效果。(见表2)
2抑菌活性高。在接菌量为108cfu/ml，对黄瓜枯萎病、辣椒疫霉、番茄青枯病的平皿抑菌率24h达75%以上，48h后达85%以上。3对多种植物有促生和促进种子发芽的作用。其可在作物表面产生植物生长调节素类物质，如分裂素、吲哚乙酸等，促进植物生长。4适应范围广。在孢子状态下稳定性好，能耐氧化、耐挤压、耐高温，能长期耐60°C 高温，在120°C温度下能存活20分钟。5在作物表面快速定植繁殖，并在植物表面产生抗菌物质，抑制有害病原微生物的生长或直接将病原微生物杀灭。例如其可持续分泌释放脂肽抗菌物质和细胞壁降解酶等活性物质，溶解细胞壁或细胞膜，造成原生质泄漏使菌丝断裂或畸形，同时抑制孢子萌发，长久保护作物免受病原微生物的侵害。该微生物可湿性粉剂的广谱性决定了其推广应用的广泛性和广阔性，不仅可防蔬菜、瓜类土传病害，而且对花卉、草坪的土传病害也有防治效果。该微生物可湿性粉剂还具有促生作用，所以其既是菌肥又是杀菌剂。该可湿性粉剂具有强的抗耐性和适应性，使其可在不同气候条件、不同生态条件下推广应用。具有低价高效性，具有良好的市场前景。本发明的生防菌肥属可湿性粉剂，白色，细度小于lOOum，含量为ZXIOici-SXIOiq 个有效细菌/g，可作为植物拌种剂和叶面喷雾剂使用，并可与其他化学农药并用或混用，能治疗黄瓜枯萎病、辣椒疫霉、番茄青枯病等多种土传病害，阻止病原菌对作物、果实等表面的破坏，从而达到预防和治疗的效果。
图1为本发明生防菌肥“绿都1号”生产流程。 具体实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实施例1 (1)分离a土样的采集与处理从陕西秦岭原始森林不同地点采集土壤20份，各称取3g，置于盛有12mL无菌蒸馏水的三角瓶中，沸水浴IOmin后，迅速降至室温，静置，1500r/min离心 15min，取上清液获得菌悬液。采用梯度稀释分离法，将不同稀释度的芽孢菌悬液涂布于20 个LB琼脂平板上，于30°C培养箱中培养至长出单个菌落。b挑菌及纯化根据芽孢杆菌菌落形态特征，选取菌落形态明显不同的几种菌落， 用无菌接种环分别于LB琼脂平板上划线接种，于30°C培养箱中培养，直到长出单个菌落。 再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于30°C培养箱中培养，直到长出单个菌落。(2)初筛初筛采用抑菌圈法或十字交叉法。首先刮取病原菌孢子制成孢悬液，将孢悬液(1 X 106个^171)与融化并冷却至45°C左右的PDA培养基混勻，制平板。挑取30°C活化培养Mh的供试菌点接于病原菌平板上，30°C培养48h，观测抑菌圈。也可将待测菌和病原菌排列成十字交叉排列。培养2-3d后，观察抑菌圈大小。测量各拮抗菌株菌落边缘与病原真菌落边缘之间的抑菌带宽度，筛选出拮抗作用明显且生长较快的菌株。(3)复筛复筛采用牛津杯法。将初筛得到的菌株分别接种于装有50ml液体LB培养基的三角瓶中，30°C、220r/min振荡培养Mh。收集培养液离心(lOOOOr/min，4°C )，将上清用 0. 22μπι微孔滤膜过滤除菌。在病原菌平板上等距离放置4个牛津杯，每杯中接入不同菌株的无菌培养滤液50μ L，30°C培养48h，测量抑菌圈直径并记录试验结果。(4)菌种保存将复筛后得到抑菌能力最强的芽孢杆菌接种固体于LB培养基斜面上，4°C保存。(5)菌株种子液制备将4°C下斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株置于活化培养1 2h，然后将其划线接种于LB固体平板培养基上，培养Mh。挑取活化的菌株菌落，接种到LB液体培养基中，于 30°C、150rpm 下培养 20h。(6)种子罐接种培养将上述种子液按3%的体积比接种至培养液中，转速210转/分，3d，PH值5-9，通气量1 1。(7)发酵罐发酵移种至发酵罐，转速200转/分，5d，PH值5-9，通气量1 1。检查芽胞形成的比率，并要求生孢率达90%以上，收集菌液为液体菌肥。实施例2生防菌可湿性粉剂中载体草炭土的制备(1)载体材料及稳定剂助剂的准备选择对芽孢杆菌菌株无毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5 7. O之间、颗粒细小且易与种子粘着、不易结块、廉价的草炭土为接种载体。将草炭土干燥、粉碎，用100筛孔过筛，并将其置于高压灭菌锅内在100 121°C下，连续灭菌30 40分钟后，备用。实施例3生防菌可湿性粉剂固体菌肥的制备取实施例1中制备所得的芽孢杆菌液体菌肥悬液，选择处理好的草炭土，以及稳定剂、助剂、微量元素液表1本发明生防菌肥可湿性粉剂其它辅助原料的配比组成表
权利要求
1.一种新型生防菌肥可湿性粉剂，所述可湿性粉剂包括枯草芽孢杆菌悬液、载体草炭土、稳定剂PGA和CMC-Na、助剂木质素M9、微量元素液和硅藻土。
2.根据权利要求1所述的可湿性粉剂，其中所述枯草芽孢杆菌悬液的活菌数为 2. OX 1010 个/ml 至 3. 0X 1010 个/ml。
3.根据权利要求1所述的可湿性粉剂，其中所述微量元素液的由硼酸、钼酸钠和蒸馏水制成。
4.根据权利要求1-3中任意一权利要求所述的可湿性粉剂，其中所述可湿性粉剂的组成及重量配比为 枯草芽胞杆菌悬液0. 2-2重量份，所述枯草芽孢杆菌悬液的活菌数为2. OX 1010个/ ml 至 3. OX 1010 个/ml ；稳定剂为PGA 0. 5-5重量份，CMC-Na 1-10重量份； 草炭土 50-70重量份； 助剂木质素M9 :1-10重量份；微量元素液0. 5-5重量份，所述微量元素液由0. 01重量份的硼酸、0. 01重量份的钼酸钠和0. 98重量份的蒸馏水配置而成； 硅藻土补齐剩余重量。
5.根据权利要求4所述的生防菌可湿性粉剂，其中所述的可湿性粉剂的组成及重量配比为枯草芽胞杆菌悬液0. 4-0. 8重量份，所述枯草芽孢杆菌悬液的活菌数为2. OX 1010个 /ml 至 3. OX 1010 个/ml ；稳定剂为PGA 1重量份，CMC-Na 2重量份； 草炭土 60重量份； 助剂木质素M9 :2重量份；微量元素液1重量份，所述微量元素液由0. 01重量份的硼酸、0. 01重量份的钼酸钠和 0. 98重量份的蒸馏水配置而成； 硅藻土补齐剩余重量。
6.一种制备权利要求1-4中任意一项权利要求所述的生防菌可湿性粉剂的方法，所述方法包括枯草芽孢杆菌活化、发酵罐培养、制备液体菌肥、加草炭土载体、稳定剂和助剂制备固体菌肥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括(1)菌种活化将。C下斜面保存的枯草芽胞杆菌菌株活化l_2h，然后将其划线接种于LB固体平板培养基上，培养24h;(2)菌株种子液制备挑取活化的菌株菌落，接种到LB液体培养基中，于30°C、150rpm下培养20h ；(3)种子罐接种培养将上述种子液按3 %的体积比接种至培养液中，转速210转/min，pH为5_9，通气量 1:1;(4)发酵罐发酵移种至发酵罐，转速200转/min，5d，pH值为5-9，通气量1 1，检查芽胞形成的比例， 并要求生孢率达90%以上，收集菌液为液体肥料；(5)载体材料及稳定剂助剂的准备选择对芽孢杆菌无毒、吸水保水性能好、PH值在6. 5-7. 0之间、颗粒细小且易与种子粘着、不易结块、廉价的草炭土为接种载体； 稳定剂为PGA 1重量份； CMC-Na 2重量份； 草炭土 60重量份； 助剂木质素M9 2重量份； 微量元素液1重量份，其中微量元素液由硼酸0. 01重量份、钼酸钠0. 01重量份、蒸馏水0. 98重量份配置而成；硅藻土补齐；(6)固体菌肥制作按照1 10 (v/w，ml/g)将发酵悬液接种到高温灭菌后的草炭土混勻后，无菌条件下， 加稳定剂、助剂及微量元素液，硅藻土补齐，包装，既得；
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的芽孢杆菌菌液活菌数为2.OX 1010个/ml 至 3. 0X1010 个/ml。
9.权利要求1-4中任意一项权利要求所述的生防菌可湿性粉剂在植物枯萎病、疫霉或枯萎病中的运用。
10.权利要求9所述的运用，其中所述植物为黄瓜、草莓、辣椒或番茄。
全文摘要
本发明涉及一种新型高效生防菌肥“绿都1号”生产工艺。该微生物制剂经菌种复活、扩繁、扩大培养、液体菌肥制备、固体菌肥制备等制成一种含有活性微生物的特定制剂。该能治疗有效抑制黄瓜枯萎病、辣椒疫霉和番茄青枯病等多种土传病害。生防菌肥“绿都1号”不仅可改善土壤肥力且肥效持久，促进某些作物的生长，增加产量，还对有害微生物有生物防治的作用，起到减轻作物病害的功效。该菌肥同时具有成本低、使用方便、工艺流程简单、无污染、无残毒等优点。
文档编号A01N63/00GK102344320SQ201110200420
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者杨轩, 杨长锁 申请人:杨凌绿都生物科技有限公司