专利名称：一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法
技术领域：
本发明涉及一种剑麻组织培养的方法，特别是涉及一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，属于组织培养育苗技术领域。
背景技术：
剑麻为重要的热带纤维作物，主要分布在南北回归线之间的部分热带、亚热带地区，种植区域十分有限，资源总量稀缺；剑麻纤维是航运、渔船、钻探所用绳缆、绳网，电梯、 吊车的钢索绳心等不可替代的原料，目前剑麻制品已广泛用于金属抛光、特种纸浆、金属制品、运输、矿山、家庭装饰、地毯、工艺、医药和汽车工业中。我国剑麻生产上目前种植的唯一剑麻品种H. 11648是20世纪60年代从国外引进的优良品种，其纤维产量高，抗寒性强，在我国大面积推广种植，大幅度提高了剑麻产量，使我国剑麻跃居世界前列，成为可出口创汇的优势产业。然而，H. 11648的种植目前已经历了 3个生命周期，由于种植品种的长期单一和种苗的随意繁衍，造成目前剑麻早花早衰现象极其突出，纤维抽出率有逐年下降的趋势，甚至出现叶缘有刺的返祖现象，这是品种退化的一种象征；由于品种退化，抗性减弱，剑麻病害不断滋生，严重影响麻园高产稳产。剑麻生命周期长，一生仅开一次花，其基因的分配与重组的机会有限，而且剑麻是引进的外来物种，种质资源全部需要从国外引进，新品种培育常常受到种质资源的约束，因而有性杂交育种时间长、效率低，种植品种单一的局面还将长时期存在。麻园高产稳产，种苗培育是关键，种苗优良，植株生势壮旺，抗性强，鲜叶产量高；几十年的剑麻生产实践证明，H. 11648是优良的剑麻品种，其丰产性是目前其它品种难以比拟的，通过对H. 11648进行提纯复壮，恢复其种性，在短期内即可缓解由于剑麻品种缺乏带来的风险。通过H. 11648 优良单株筛选，利用组织培养腋芽成苗途径对优良单株进行快速繁殖，应用株系提纯法是实现H. 11648提纯复壮的有效途径。因此，剑麻组织培养不仅是目前剑麻生产的迫切需求， 对利用基因工程进行剑麻品种遗传改良以缓解剑麻种植品种长期缺乏有重要现实意义。 国内外对剑麻的组织培养和植株再生也做了一定的探索，在国外，利用种子、 珠芽、走茎以及茎段等为外植体，通过直接或间接的器官发生方式已成功的建立了亚洲马 H麻 C4. cantala Robx)、灰卩十麻 Cl fourcroydes Lem)> Hil^lJ (A sisalana Perrine)、蓝剑麻(A tequilana Weber cultivar azul )> A. parrasana Berger> A. tequilana ^A. crassispina > A. duranguensis ,A. vera-cruz Mill·、A. atroFii-e1/ ^·禾口 A. arizonica等体外再生体系，并获得了完整的再生植株，在国内，广东省农垦科技中心以剑麻钻心芽茎尖作为外植体，通过快繁的方式获得大量丛生芽。广东湛江农垦科研所2005 年初利用H. 11648高产植株的珠芽做外植体，通过快繁的方式成功培育了 2万多株小苗， 中国热带农业科学院和海南大学分别利用剑麻(Agave sisalana Perrine ex Engelmann) 嫩芽和无菌苗叶片为外植体，通过愈伤诱导获得完整再生植株，中国热带农业科学院以 H. 11648麻茎尖为外植体，通过快繁的方式获得了一定数量的H. 11648植株，但以上方法获得的丛芽或再生植株均存在不同程度的玻璃化现象，本课题组也开展了剑麻再生体系构建研究，获得了一定数量的再生植株，但再生植株玻璃化率最高可达80%以上，严重影响了剑麻体外快速繁殖，同时对利用生物技术手段开展剑麻遗传改良也有不利影响。 组培苗玻璃化现象在植物组织培养中普遍存在，玻璃化的植株常呈半透明状，夕卜观形态往往异常。通常玻璃化植株在后续培养期间很难恢复正常生长，在继代培养中仍然形成玻璃化苗，且玻璃化苗的分化能力低，难以增殖生根成苗。由于玻璃化苗的生理功能异常，难以移栽成活，因此对利用组织培养技术开展植物体外快繁极为不利，组培苗玻璃化问题也成了组培苗生产中亟待解决的问题。对于组培苗玻璃化的诱发因素早在1981年 Debergh等就进行了系统研究，但由于不同植物玻璃化的诱发因素很不相同，大家众说纷纭，对其玻璃化的发生规律和机理至今还缺乏真正的了解，也没有普遍适用的行之有效的防止玻璃化发生技术措施。本方法不仅在很大程度上克服了剑麻组培快繁中的玻璃化现象，同时也可在一定程度上使已经玻璃化的植株恢复正常生长，同时还能诱导玻璃化的愈伤组织再生出正常植株，为利用生物技术开展剑麻相关研究打下了良好的基础。
发明内容
为实现上述目的本发明所采用的技术方案是
一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于实施步骤如下
(1)外植体表面消毒及培养
以剑麻珠芽苗(5-lOcm)或吸芽苗(10-20cm)的茎尖为材料进行消毒，先将外层老叶剥离，流水冲洗，用0. 3%高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精浸泡 lmin，再用0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用无菌水冲洗3_5次；晾干后切除部分外植体，纵切后接种于改良SH+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2. 5-5. Omg/L培养基上，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度20001UX，培养温度为28士2°C ；
(2)丛芽诱导和增殖培养
将初代培养45天后的茎尖转入丛芽诱导和增殖培养基上进行丛芽诱导和增殖，丛芽诱导和增殖培养基为改良SH培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸 (NAA)和吲哚3丁酸(IBA);6-BA 的浓度为 1. 0-5. Omg/L ； NAA 的浓度为 0-1. 5mg/L，IBA 的浓度为 0-1. Omg/L，pH 为 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，光照为 2000Lx，温度 28士2°C;
(3)生根培养
经增殖培养和壮苗后，将高5cm以上，带有4-5片叶的小苗转入生根培养基进行生根培养，生根基本培养基为改良SH，添加外源激素为IBA，激素浓度为0.5-2. 5 mg/L, pH为 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗 10_12h，温度 28士2°C ；
(4)无菌苗移栽
待植株生根2-3周时，将瓶苗置于自然条件下炼苗1周，然后取出洗去基部的培养基， 用高锰酸钾1000倍液浸泡3-5min，移植到基质为椰糠和河沙(椰糠河沙为1:1)的塑料遮光大棚中培育，遮光度75%以上，白天最高温度不超过32°C，夜晚最低温度不低于20°C， 每天早晚各浇透水1次，植株的成活率在95%以上，幼苗长出新叶后开始追施2%复合肥水月巴，施肥后要立即用清水淋洗小苗叶片，待幼苗长出新叶3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然环境下继续培育。上述的改良SH培养基大量修改的成分为硝酸钾2000-2520 mg/1，磷酸二氢钾300-353 mg/1，硝酸氨 100-300 mg/1，SH 铁盐中的 FeSO4 7H20 为 15-27. 8mg/l，Na2-EDTA 为 15-37. 3mg/l, SH 微量的 ZnSO4 7H20 为 5_15mg/l。本发明的优点在于
本发明首次通过调节培养基的有效组分来控制组培苗玻璃化现象，利用本法在剑麻茎尖丛芽诱导中能高效诱导出正常植株，还可使已玻璃化的再生植株恢复正常生长，为剑麻的组培快繁，再生体系建立、遗传转化等奠定了良好的基础。该方法实施步骤简单易行，快速、高效，实施条件宽松，效果非常显著。
图1为本发明例1茎尖诱导的丛芽图2为本发明例2玻璃化的植株
图3为本发明例2玻璃化的植株培养20天后的恢复情况图4为玻璃化的愈伤组织； 图5为玻璃化的愈伤组织诱导的不定芽(1个月) 图6为不定芽生根培养(20天)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1
取保存于南亚热带作物研究所剑麻种质圃的高8-lOcm珠芽苗15株，去除根及老叶， 流水冲洗，用高锰酸钾溶液1000倍处理30min，接着用75%酒精浸泡lmin，再用0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用无菌水冲洗3-5次。晾干后切除部分外植体，纵切后接种于改良SH+6-BA3. 0-5. Omg/L培养基上，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时， 光照强度20001UX，培养温度为28士2°C。培养45天后转接入丛芽诱导和增殖培养基，丛芽诱导和增殖基本培养基为改良SH培养基，添加外源激素为6-BA、NAA和IBA ；6-BA的浓度为 1. 0-5. Omg/L ；NAA 的浓度为 0-1. 5mg/L，IBA 的浓度为 0-1. Omg/L，pH 为 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗10-12h，光照为2000Lx，温度28士2°C。每45-60天继代1次，半年后共获得 5347株完整植株，正常植株比例在98%以上。实施例2
取85簇(每簇5-8株)部分或完全玻璃化的再生植株接种于改良SH培养基上，添加外源激素为 6-BA、NAA 和 IBA ；6-BA 的浓度为 1. 0-5. Omg/L ；NAA 的浓度为 0-1. 5mg/L, IBA 的浓度为0-1. Omg/L, pH为5. 8-6. O ；光照12_14h，黑暗10_12h，光照强度为2000Lx，温度 28士2°C。培养1个月后23簇已完全恢复正常生长，34簇部分恢复，玻璃化苗恢复比例为 67. 06%ο实施例3
取玻璃化的带芽的愈伤团块62块，去除玻璃化的芽和嫩叶，接种于改良SH培养基上， 添加外源激素为6-BA、NAA和IBA ；6-BA的浓度为1. 0-5. Omg/L ；NAA的浓度为0-1. 5mg/L, IBA 的浓度为 0-1. Omg/L, pH 为 5. 8-6. O ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，光照为 2000Lx，温度28 士 2°C。2周后观察有55个愈伤团块有不定芽诱导， 其中有47个愈伤团块诱导出的不定芽基本正常，有8个愈伤团块诱导的不定芽有不同程度的玻璃化，不定芽诱导比例为88. 71%， 其中正常不定芽比例为85. 45%。
权利要求
1.一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于包括如下步骤(1)外植体表面消毒及培养以剑麻珠芽苗或吸芽苗的茎尖为材料进行消毒，先将外层老叶剥离，流水冲洗，用0. 3% 高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精处理lmin，再用0. 1%氯化汞溶液处理15-30 min,最后用无菌水冲洗3_5次，晾干后纵切，接种于改良SH+6-苄氨基腺嘌呤 6-BA2. 5-5. Omg/L培养基上进行初代培养40-50天；培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度20001UX，培养温度为28士2°C ；(2)丛芽诱导和增殖培养将经初代培养的茎尖转入丛芽诱导与增殖培养基上进行丛芽诱导和增殖，丛芽诱导与增殖培养基为改良SH培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸 IBA ；6-BA 的浓度为 1. 0-5. Omg/L ； NAA 的浓度为 0-1. 5mg/L, IBA 的浓度为 0-1. Omg/ L，pH 为 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗 10_12h，光照为 2000Lx，温度 28士2°C ；(3)生根培养经丛芽诱导、增殖培养并壮苗后，将高5cm以上，带有4-5片叶的小苗转入生根培养基进行生根培养，生根基本培养基为改良SH，添加外源激素为吲哚3 丁酸IBA，激素浓度为 0. 5-2. 5 mg/L，pH 为 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，温度 28士2°C ；(4)无菌苗移栽待植株生根2-3周，小苗长出3-5条壮根时，将瓶苗置于自然条件下炼苗1周，然后取出洗去基部的培养基，用高锰酸钾1000倍液浸泡3min，移植到基质为椰糠和河沙的塑料遮光大棚中培育，遮光度75%以上，白天最高温度不超过32°C，夜晚最低温度不低于20°C，每天早晚各浇透水1次，植株的成活率在95%以上；幼苗长出新叶后开始追施2%复合肥水肥， 施肥后要立即用清水淋洗小苗叶片，待幼苗长出新叶3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然环境下继续培育。
2.根据权利要求1所述的一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于 所述的剑麻珠芽苗为5-lOcm高的种苗。
3.根据权利要求1所述的一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于 所述的吸芽苗为10-20cm高的种苗。
4.根据权利要求1所述的一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于 所述的改良SH培养基大量修改的成分为硝酸钾2000-2520 mg/1，磷酸二氢钾300-353 mg/ 1，硝酸氨 100-300 mg/1, SH 铁盐中的 FeSO4 7H20 为 15-27. 8mg/l，Na2-EDTA 为 15-37. 3mg/ 1, SH 微量的 ZnSO4 7H20 为 5_15mg/l。
5.根据权利要求1所述的一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，其特征在于 所述的椰糠和河沙的比例为1:1。
全文摘要
本发明涉及一种克服剑麻组织培养苗玻璃化现象的方法，该方法是在离体条件下，利用剑麻茎尖为外植体经过表面消毒后，接种到添加有6-BA的改良SH培养基上进行初代培养约45天，然后将无菌外植体接种到含有6-BA的改良SH培养基上进行诱导分化和培养，诱导出的丛芽应用诱导分化相同的培养基每45天进行继代增殖，经过生根培养可获得大量健康种苗；该方法通过调节培养基的有效组分来控制组培苗玻璃化现象，方法简便、经济、高效，常见剑麻品种用此法生产组培苗均能有效克服玻璃化现象，具有广阔的应用前景。
文档编号A01H4/00GK102283128SQ201110204540
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者周文钊, 张燕梅, 戴梅莲, 李俊峰, 林映雪, 陆军迎 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所