一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用的制作方法

专利名称：一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及利用一个人工 microRNA (artificial microRNA, amiRNA)和人工 target mimic 基因所构成的双因子系统来控制水稻不育系及其杂种的株高和穗颈长。本发明利用amiRNA技术在转基因水稻不育系中特异性的沉默赤霉素(GA)合成代谢途径中的Euil (elongated uppermost internodeI)基因的表达。Euil基因的产物可以失活具有生物活性的赤霉素GA4。抑制Euil的表达就可以提高水稻内源GA4的含量，从而提高其株高和穗颈长，缓解水稻不育系的包穗特性。Target mimicry是植物中天然存在的一种抑制特定miRNA作用的机制。利用人工设计的target mimic基因,转化水稻恢复系。当含有amiRNA的水稻不育系和含有人工target mimic的水稻恢复系杂交,在其所配的杂种一代(F1)中，人工target mimic可以特异性抑制amiRNA的效果，使得杂交种的株高和抽穗性恢复到接近野生型杂种的水平。
背景技术：
杂交水稻的发明使水稻增产20%左右(袁隆平，1996)，为保障中国乃至世界粮食的安全做出了巨大贡献。目前，中国的杂交水稻种植面积占总水稻种植面积的50%左右 (张红林等，2009)。杂交水稻的雄性不育系具有“包穗”(即穗子大部分被包裹在叶鞘内) 的特性，因而在杂交水稻制种时难以受粉。水稻不育系的包穗特性是生产上制约杂交水稻发展的重要障碍之一(张红林等，2009)。Yin等(2007)对水稻不育系ZS97A包穗现象机理的研究表明，当水稻细胞质雄性不育发生时，其最上部茎间GAl水平的降低是导致不育系包穗的主要原因。在杂交水稻制种的过程中，育种家需要通过外施“920”(有效成分为 GA3)来解除或缓解不育系的包穗现象。然而，920的施用不仅导致一系列的问题如增加了制种成本、降低了种质量并导致环境 污染；其效果还要取决于喷施者的技术、施用的时期以及施用时的天气状况(张红林等，2009)。
Rutger和Carnahan (1981)在粳稻杂交的后代中发现了一株节间伸长,高杆的突变体，命名为76 :4512。遗传分析表明，该节间伸长性状由隐性单基因控制，并将该隐性突变基因命名为eui (elongated uppermost internode)。Eui突变基因可以导致水稻最上部节间的长度增加约一倍，穗长增加12%。Rutger和Carnahan (1981)提出，利用eui隐性突变基因来培育杂交水稻的高杆恢复系。因为高杆的株型对于作为父本的恢复系可以利于其花粉的传播以及杂交种的商业化制种。恢复系的高杆性状为隐性基因，因而不影响杂交组合的半矮杆性状。Eui基因也被称为杂交水稻生产中除了不育系、保持系和恢复系外的第4 遗传因子(Rutger 和 Carnahan 1981)。
Yang等(1999)通过辐射诱变协青早B，获得两种不同的高杆隐性突变体协青早 eBl和协青早eB2。等位试验证明，协青早eBl的隐性基因与Rutger发现的eui突变体为等位基因，命名为euil ;而协青早eB2中的隐性基因与euil不等位,命名为eui2(Yang et al. 1999)。euil和eui2的显性等位基因EUIl和EUI2已经被分离，其基因功能也已经被阐明。EUIl的基因组序列为9804bp，由2个外显子和I个内含子组成，其全长cDNA为193 Ibp，包含 IlObp 的 5' -UTR, 87bp 的 3' -UTR 和 1734bp 的读码框(open reading frame, ORF) (Ma et al. , 2006) 0 EUIl编码一个含有577个氨基酸的细胞色素CYP714D1蛋白，可以使 GA4 失活(Luo et al.，2006 ；Zhu et al. ,2006)。EUI2 的基因组序列为 1576bp，包含 5 个外显子，4个内含子。其ORF长为933bp，编码310个氨基酸，同源性分析初步认为该基因产物与环氧化物酶有关(朱宏波，2003 ;马洪丽，2007)。
eui突变体主要有两种用途一种是Rutger和Carnahan最初设想的利用eui突变体来培育隐性高杆恢复系，提高其传粉能力；另一种是利用eui突变体培育长穗颈的不育系，免除或减少在杂交中制种过程中920的使用。但是,在Rutger和Carnahan发现eui 突变体后的20多年里，eui基因并没有在杂交水稻生产上被大规模应用。因为优良组合的亲本与eui突变体经过杂交和回交转育后，原有杂交组合的部分优良性状往往会丢失(张书标和杨仁崔，2004)。因此，Yang等(2002)提出直接人工诱变接杂交组合的保持系和恢复系，从而培育长穗颈不育系(eA系)或高杆恢复系(eR系)。利用eA或eR配制的杂交水稻组合称为e-杂交水稻(张书标和杨仁崔，2004)。采用直接诱变的方法，e-杂交水稻的研究获得了一定的进展，少量e-杂交水稻组合在生产上获得了应用。e-杂交稻的制种不需要外施920，且其产量要显著高于相应的非eui杂交组合(张红林等，2009)。但是，由于可用的eA和eR系种质资源还比较少，且受知识产权的限制，目前e_杂交水稻在生产上的应用十分有限(张红林等，2009)。
在eui突变体的遗传背景和分子机理都清晰的前提下，通过转基因策略发展 e_杂交水稻成为了一种可能的选择。MicroRNA (miRNA)是一类动、植物中普遍存在的 21-24nt大小的小分子RNA。miRNA通过序列互补的方式特异性介导特定的作用因子识别目标基因的mRNA,然后以“翻译阻遏(translational repression) ”或“位点特异性切割 (site-specific cleavage) ”的机制抑制目标基因的表达。在植物中，miRNA的序列与目标mRNA上的识别位点几乎完全互补，并主要通过mRNA位点特异性切割的方式发生作用 (Ambros 2004 ；Bartel 2004 ;Bushati和Cohen 2007 )。研究发现，在植物体内的表达人工设计的miRNA (artificial microRNA, amiRNA)序列可以同天然miRNA —样抑制特定基因的表达活性(Schwab et al. 2006 ；Khraiwesh et al. 2008 ；ffarthmann et al. 2008 ；Molnar et al. 2009)。Warthmann等(2008)报道,通过表达amiRNA抑制水稻中EUIl基因的表达， 可以增加水稻的株高及穗颈长，使转基因植株表现出euil突变体类似的表型。然而，和自然突变或诱变产生的隐性eui表型不一样，amiRNA是通过RNA之间的反式作用来抑制EUIl 基因的表达，其产生的表型为显性性状。转基因不育系的杂交后代理论上会表现出高杆的特性而不是eui杂种所表现出来的半矮杆的特性。转基因杂交后代的高杆特性会降低其抗倒伏能力，从而影响产量。因此需要在杂交组合中引入一个新的因子来抑制amiRNA的活性从而使杂交组合恢复半矮杆的特性。
Target mimicry是在拟南芥中发现的一种抑制miRNA作用的机制。IPSl是拟南芥中发现的一种不编码蛋白质序列的基因。IPSl上有一段序列与miRNAmiR-399的序列互补，但是在miRNA预期发生切割的位置存在4碱基的错配。这个4碱基的错配使得IPSl 不能被miR-399切割(Franco-Zorrilla et al. 2007)。这种特殊的机制使得IPSl不被 miR-399切割,且能抑制miR-399对其祀标基因的调控作用。利用target mimicry机理,设计人工的target mimic基因可以特异性的抑制特定miRNA分子的功能(Franco-Zorrillaet al. 2007)。
本发明拟采用基因工程的方法，通过构建一个“双因子”的系统替代人工诱变的方法，培育转基因的e-杂交水稻。本发明的策略在于利用amiRNA技术在水稻保持系中敲除 EUIl基因的表达，获得转基因长穗颈的保持系。将转基因保持系与相应不育系杂交和回交， 育成转基因长穗颈的不育系。在水稻恢复系中导入人工target mimic基因。由于target mimic基因不编码蛋白，因此不干扰转基因恢复系的正常生长。表达amiRNA的不育系与含有target mimic的恢复系所配置的杂种中，由于target mimic抑制了 amiRNA的活性,杂交种的表型仍然为半矮杆。
目前水稻转基因技术已经臻于成熟，和直接突变杂交组合的保持系、恢复系以及不育性的策略比较起来，转基因操作更加直接和精确，因而具有可控性好、筛选工作量小， 育种时间短等优点。此外人工诱变往往会造成EUIl基因的表达活性彻底丧失，而转基因的方法由于不同转化子外源基因的插入位置效应，其导致的基因失活效果不同，因而可以根据需要筛选表型强度合适的转化子，从而更加灵活。此外由于整个策略都是基于RNA水平的调控，不产生新的蛋白因而在转基因安全性方面也非常的可靠。
水稻不育系的还存在“包穗”缺陷，在杂交水稻的生产上为了解决“包穗”现象， 往往过多使用920 (又称赤霉素)，因而增加了水稻制种成本，影响制种质量，导致环境的污染，且效果易受外界因素(喷施者的技术、施用的时期以及施用时的天气状况)的影响。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用基因工程的方法将外源基因MIMa 导入水稻受体，以调控水稻株高和穗颈长性状，解除水稻不育系的“包穗”缺陷。
本发明通过以下技术方案实现
申请人克隆了一种减弱人工microRNA干涉eu1-Ι基因功能的target mimic基因 MIMa,该基因能够调控水稻株高和穗颈长性状，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO :3所/Jn ο
该基因的具体应用方法包括如下步骤
(I)将干涉水稻eu1-Ι基因的microRNA基因构建到pC1300-Ub1-nos载体上，得到重组质粒ρΕΠ-amiRNA，用该重组质粒转化水稻ZS97B，得到转基因材料eZS97B ；
(2)将转基因材料eZS97B与水稻材料ZS97A杂交得到长穗颈的水稻材料eZS97A， 其保藏号为CCTCC NO P201111 ；
(3)设计扩增 MMa 基因的引物 MIMIII, MIMIV, EuiMIMIa 和 EuiMIMIIa,然后用两轮PCR合成MMa基因，并将MMa基因构建到pC1300-Ubi_nos载体上，得到重组质粒 pC1300-MMa，用该重组质粒转化水稻材料MH63，得到转基因水稻材料MH63_MMa，其保藏号为 CCTCC NO P201112 ；
(4)用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63_MIMa进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料；
其中步骤(I)所述的microRNA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示；
步骤⑴所述的重组质粒pC1300-Ubi_nos含有序列表SEQ ID N0:1所示的 microRNA 基因；
步骤(3)所述的MMII1、MMIV、Eui]\OMIa和EuiMMIIa引物序列的核苷酸序列如下所示
MIM-1II CCCTGCCTTCATACGCTATT(5' -3/ )；
MIM-1V ATTGCCAAATGTTTGAACGA(5' -3/ )；
EuiMIM-1a atATGAGAACTAAACCGCACGGGTGCccttagtagaggtaaaagtc(5' -3/ )；
EuiMIM-1Ia ggGCACCCGTGCGGTTTAGTTCTCATattattcggtggatgtctgt(5' -3/ )；
其中步骤(3)所述的重组质粒pC1300-Ubi_nos含有序列表SEQ ID NO 5所示的 MMa基因；
其中步骤⑶所述的PCR方法如下所述
使用引物组合EuiMMIa+MMIII和EuiMMIIa+MMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为5 Xphusion HF reaction Buffer 10 μ 1,2 μ M dNTPs 5 μ I, 50ng/ μ I ΜΤ375 质粒2 μ 1,10 μ M左、右引物各2 μ I, phusion DNA polymerase 0· 5 μ I,补灭菌超双蒸水至 50μ I ；
反应条件为98°C 30s ；98°C 10s，55°C 30s，72°C 15s 重复循环 35 次；72 °C 5min。将PCR产物于0.8%琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于30 μ I elution buffer ;用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR;反应 体系为10x ExTaqE Buffer 5μ1，2μΜ dNTPs 5 μ 1，两种第一轮 PCR 产物各 2 μ 1，10 μ M 的引物 MMIII 和 MIMIV 各 2 μ I, Ex Taq O. 5 μ I,补灭菌双蒸水至 50 μ I ;
反应条件为94°C2min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C Imin 重复循环 35 次；72°C 5min ;最终PCR产物克隆于T载体pGEM_T上，然后测序验证；利用BamHI和Kpn I酶切含有MMa的T体释放出MMa基因，并将MMa克隆于中间载体pC1300-Ubi_Nos上获得最终表达载体pC1300-MMa。
具体地，本发明还包括如下一些步骤
根据Warthmann等(2008)的报道构建了针对水稻Euil基因的amiRNA表达载体， 转化水稻保持系ZS97 (又称珍汕97) B获得长穗颈的保持系eZS97B。通过eZS97B和不育系ZS97A杂交获得长穗颈的水稻不育系ZS97A。构建一个抑制amiRNA的target mimic表达载体，并转化到水稻恢复系MH63 (又称明恢63)，获得转基因恢复系MH63-MM。在eZS97A 和Mh63-MIM的杂交种中，由于target mimic基因抑制了 amiRNA的功能,从而使得杂交种的株高和穗颈长基本回复到野生型的水平。
申请人于2011年9月27日将本发明涉及的生物材料，即水稻eZS97A，MH63H\OMa， 送至湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号分别为 CCTCC NO P201111 和 CCTCC NO P201112。
本发明的优点在于，本发明获得水稻株高和穗颈长性状改良的转基因水稻，可以避免在杂交种生产上过度使用920，从而可以降低水稻制种的成本，提高种子质量，而且有利于保护环境。


序列表SEQ ID NO :1 是人工 microRNA eu1-amiRNA 前体序列，长度为 245nt。
序列表SEQ ID NO :2 是人工 microRNA eu1-amiRNA 的 DNA 序列，长度为 21nt。
序列表SEQ IDNO :3是人工target mimic基因MIMa序列，长度为656nt。序列表SEQ ID NO 4是MMa基因中人工设计和替换的DNA序列，长度为24nt。
序列表SEQ ID NO :5是人工target mimic基因MIMb序列，长度为656nt。
序列表SEQ ID NO 6是MMa基因中人工设计和替换的DNA序列，长度为24nt。
图1:本发明的具体流程。
图2 :本发明所涉及的质粒载体pC1300-Ubi_nos示意图。
图3 :本发明所涉及的表达载体pEU1-amiRNA示意图。
图4 :本发明所涉及的质粒MT375示意图。
图5 :MMa和MMb的序列。除24nt的序列为人工设计外,其余的序列同OsIPSl。
图6 :本发明所涉及的表达载体pC1300-MMa示意图。
图7 :本发明所涉及的表达载体pC1300_MMb示意图。
图8 :转eu1-amiRNA基因水稻不育系ZS97B植株的表型性状和分子检测。A)不同Ttl代转基因植株的整株表型状况。左一为野生型对照，另外三株为转基因植株。转基因植株的株高明显高于对照，且不同转基因植株的表型性状的强弱不一。B)不同Ttl代转基因植株的最上部节间的长度的比较。左一的节间来自野生型对照，其余三个节间来自转基因植株。转基因植株的最上部节间长度高明显长于于对照，且不同转基因植株的表型性状的强弱不一。C)两个表型最强转基因植株eZS97B-ll和eZS97B_20的分子检测。通过stem loop RT-PCR, eZS97B-lI和eZS97B_20均可检测到eu1-amiRNA的表达，而野生型对照中检测不到。与之对应的，转基因植株eZS97B-ll和eZS97B_20中eu1-amiRNA的靶标基因Euil 的表达量相对于野生型的对照大幅的下降。
图9 =Target mimic基因在Ttl代转MH63植株中的表达量检测。通过qRT的检测， 有7个转MMa MH63植株和3个转MMb MH63植株外源基因表达量有大幅的提高。MMa_16 和MMb-6是两个被选的家系，其相对表达量在图中用红色柱子表示。
图10 :转eu1-amiRNA基因ZS97A的表型。A)转eu1-amiRNA基因ZS97A的整株表型，左边的为野生型对照，转基因植株的株高明显增高；B)转eu1-amiRNA基因ZS97A植株的最上部节间的表型。左边为野生型对照，转基因植株的最上部节间长度明显变长。
图11 :转基因杂交组合中株高与target mimic表达量以及穗颈长与target mimic表达量的散点图。A)转基因杂交组合eZS97B/MH63_MIMa中株高与target mimic表达量的散点图；B)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MMb中株高与target mimic表达量的散点图；C)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MMa中穗颈长与target mimic表达量的散点图； D)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MMb中穗颈长与target mimic表达量的散点图。整体上看，target mimic高效表达的杂交后代的株高和穗颈长均明显低于target mimic不存在或未有效表达的转基因杂交后代。
图12:不同转基因杂交组合的表型及其Euil基因的表达情况。A)只有 eu1-amiRNA的杂交组合的整株表型。如果杂种后代仅有eu1-amiRNA存在，其株高和穗颈长均明显高于野生型对照(野生型对照在图片左侧)；B) eu1-amiRNA和target mimic均存在的转基因杂交组合。如果杂种中同时存在eu1-amiRNA和targetmimic,贝U其株高和穗颈长可以恢复到与野生型对照相当的水平(野生型对照在图片左侧)。
图13 :本发明所涉及的表达载体PNW55示意图。
具体实施例方式
实施例1构建amiRNA表达载体
Warthmann等(2008)报道了利用玉米Ubiquitin启动子组成性表达特异性的 amiRNA 序列(TTGAGAACTATGCACGGGCGC)，可以特异性抑制水稻 Euil 基因(0s05g40384)的表达，提高水稻的节间特别是最顶部一节的节间长度而显著增加水稻的株高和穗颈长。在本发明中，我们利用质粒pNW55(由德国马普生物发育研究所DetlefWeigel教授提供)作为模板，根据Warthmann等(2008)描述的重叠延伸PCR(overlap extension PCR)的方法获得针对水稻Euil基因的amiRNA前体基因(命名为eu1-amiRNA)，并克隆于T载体pGEM-T 上(Promega,美国)，然后测序验证。用限制性内切酶BamH I和Kpn I从T载体上切下 amiRNA前体基因，克隆于本实验室先前构建的表达载体pC1300-Ub1-nos (图2)上，获得植物表达载体ρΕΠ-amiRNA (图3)。
amiRNA构建的具体步骤
为了构建amiRNA，我们一共合成了 6条PCR引物，其中，引物G-4368和G-4369为通用引物，引物amil、amill、amiIII和amiIV(引物的具体序列见表I)，第一步反应以pNW55 为模板，使用弓 I 物组合 G-4368+ami 11、ami I+ami IV 和 ami III+G-4369，反应体系为IOx pfu reaction Buffer 10 μ 1,2μΜ dNTPs 5 μ l,50ng/y I pNW55 质粒 2 μ 1，10 μ M 左、右引物各 2μ1,ρ \ι polymerase (New England Biolabs,美国)0. 5 μ I,补灭菌超纯水至 50 μ I。反应条件为95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 重复循环 30 次；72°C 7min。将 PCR 产物于0.8%琼脂糖胶电泳，挖胶后用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN，德国)回收 PCR产物，最后溶于30 μ I elution buffer。用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮 PCR。反应体系为IOx ExTaqE Buffer 5μ1，2μΜ dNTPs 5 μ 1，两种第一轮 PCR 产物各 2μ 1，10μΜ 的引物G-4368 和G-4369各 2μ I,Ex TaqE (TaKaRa，中国大连)0. 5 μ 1，补灭菌超纯水至5(^1。反应条件为941 2min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin重复循环35 次；72°C 7min。最终PCR产物克隆于T载体pGEM_T(Promega，美国)上，然后测序验证。利用BamH I和Kpn I酶切含有amiRNA的T载体释放出amiRNA基因，并将amiRNA基因克隆于中间载体pC1300-Ub1-Nos上获得最终表达载体ρΕΠ-amiRNA (图3)。
实施例2人工target mimic表达载体的构建
质粒MT375(由德国马普生物发育研究所Detlef Weigel教授提供)携带有水稻天然 target mimic 基因 OsIPSl (登录号=GenBank AY568759. 1，见图 4)，OsIPSl 转录的 mRNA上带有24nt与水稻miRNA osa_MIR399互补的序列为模板。采用重叠延伸PCR的方法(Franco-Zorrilla, et al. 2007)将天然OsIPSl上与osa_MIR399互补的序列替换为针对eu1-amiRNA互补的序列，形成人工target mimic基因(见序列表SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 5) ο Target mimic基因的设计参考了 Franco-Zorrilla等(2007)在植物中发现的target mimicry的作用机理。我们设计了两条序列略有差异的target mimic基因，分别命名为MMa(见序列表SEQ IDNO :3)和MMb (见序列表SEQ IDNO :5))。MMa是模拟 eu1-amiRNA在Euil基因上的祀位点序列设计，即除了与amiRNA序列结合的第10和11个碱基之间有4个碱基的不匹配的小环突起且第10个碱基不能与amiRNA配对(该设 计为了避免target mimic基因编码的mRNA序列被amiRNA切割),其余的序列和eu1-amiRNA的革巴位点完全一致(见图5)。而MIMb则根据eu1-amiRNA的序列设计，即除了与amiRNA结合的第10和11个碱基之间有4个碱基的不匹配的小环突起且第10个碱基不能与amiRNA 配对外，其余序列与amiRNA完全互补(见图5)。因此，MIMa和MMb的序列存在2个碱基的差别，且MIMb与eu1-miRNA的互补性高于MIMa。设计MIMa和MIMb两种不同的target mimic基因，是为了考察提高target mimic与eu1-amiRNA的配对能力是否能提高target mimic对amiRNA的抑制效果。
MIMa和MMb构建的具体步骤
为了构建MMa和MMb，我们一共合成了 6条PCR引物。其中，引物MMIII和 MIMIV为通用引物，引物EuiMIMIa, EuiMIMIIa, EuiMIMIb和EuiMIMIIb (引物的具体序列见表I)是含有突变位点的特异引物。下面是MMa的构建过程，除了使用不同的特异引物外，MIMb的构建过程与之完全一样。使用引物组合EuiMMIa+MMIII和EuiMMIIa+MMIV 进行第一轮 PCR 反应，反应体系为5Xphusion HF reaction Buffer 10 μ 1,2μΜ dNTPs 5 μ I, 50ng/ μ I ΜΤ375 质粒 2 μ 1,10 μ M 左、右引物各 2 μ I, phusion DNA polymerase (New England Biolabs，美国)0. 5 μ 1，补灭菌超纯水至50 μ I。反应条件为98°C 30s ；98°C 10s，55°C 30s, 72°C 15s重复循环35次；72°C 5min。将PCR产物于0. 8%琼脂糖胶电泳， 挖胶后用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN，德国)回收PCR产物，最后溶于30 μ I elution buffer。用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR。反应体系为10x ExTaqE Buffer 5μ1，2μΜ dNTPs 5 μ 1，两种第一轮PCR产物各 2 μ 1，10 μ M 的引物MMIII 和MMIV各2μ1，Εχ TaqE (TaKaRa，中国大连)0. 5 μ 1，补灭菌超纯水至50 μ I。反应条件为94°C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin 重复循环 35 次；72°C 5min。最终 PCR 产物克隆于T载体pGEM-T (购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)上，然后测序验证。利用 BamH I和Kpn I酶切含有MMa和MMb的T体释放出MMa和MMb基因，并将MMa和MMb 克隆于中间载体pC1300-Ub1-Nos上获得最终表达载体pC1300H\OMa和pC1300H\OMb (图6 和7)。
表1.本发明所涉及的引物序列
权利要求
1.一种减弱人工microRNA干涉eui_l基因功能的target mimic基因MIMa在调控水稻株高和穗颈长性状中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO 3所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征包括如下步骤 (1)将干涉水稻eu1-1基因的microRNA基因构建到pC1300-Ubi_nos载体上，得到重组质粒pEM-amiRNA，用该重组质粒转化水稻ZS97B，得到转基因材料eZS97B ； (2)将转基因材料eZS97B与水稻材料ZS97A杂交得到长穗颈的水稻材料eZS97A，其保藏号为 CCTCC NO P201111 ； (3)设计扩增MIMa基因的引物MIMIII,MIMIV、EuiMIMIa和EuiMIMIIa,然后用两轮PCR合成MMa基因，并将MMa基因构建到pC1300-Ubi_nos载体上，得到重组质粒pC1300-MMa，用该重组质粒转化水稻材料MH63，得到转基因水稻材料MH63_MMa，其保藏号为 CCTCC NO P201112 ； (4)用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63_MIMa进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料； 其中步骤(I)所述的microRNA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示； 步骤(I)所述的重组质粒pC1300-Ubi_nos含有序列表SEQ ID NO 1所示的microRNA基因; 步骤(3)所述的MMII1、]\OMIV、Eui]\OMIa和EuiMMIIa引物序列的核苷酸序列如下所示MIM-1II CCCTGCCTTCATACGCTATT (5' -3')；MIM-1V ATTGCCAAATGTTTGAACGA (5' -3')；EuiMIM-1a atATGAGAACTAAACCGCACGGGTGCccttagtagaggtaaaagtc(5' -3')；EuiMIM-1Ia ggGCACCCGTGCGGTTTAGTTCTCATattattcggtggatgtctgt(5' -3')； 其中步骤(3)所述的重组质粒pC1300-Ub1-nos含有序列表SEQ ID NO :5所示的MMa基因; 其中步骤(3)所述的PCR方法如下所述 使用引物组合EuiMMIa+MMIII和EuiMMIIa+MMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为5Xphusion HF reaction Buffer 10 u I,2 u M dNTPs 5 u I,50nh/u I MT375 质粒2 u 1,10 u M左、右引物各2 u I, phusion DNA polymerase 0. 5 U I,补灭菌超双蒸水至50u I ； 反应条件为98°C 30s ；98°C 10s，55°C 30s, 72°C 15s 重复循环 35 次；72°C 5min。将PCR产物于0.8%琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于30 ill elution buffer ;用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR ;反应体系为10x ExTaqE Buffer 5u I,2uM dNTPs 5 u I，两种第一轮 PCR 产物各 2 y 1，IOyM 的引物 MMIII 和 MMIV 各 2 y I,ExTaq 0. 5 U I,补灭菌双蒸水至50 ii I ; 反应条件为94°C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin 重复循环 35 次；72°C 5min ；最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有MMa的T体释放出MMa基因，并将MMa克隆于中间载体pC1300-Ubi_Nos上获得最终表达载体PC1300-M頂a。
全文摘要
本发明“一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用”属于植物基因工程技术领域。与植物转基因技术和水稻分子育种技术领域相关。本发明通过植物基因克隆技术得到一种减弱人工microRNA干涉eui-1基因功能的target mimic基因MIMa，其核苷酸序列如序列表SEQ NO3所示。用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63-MIMa进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料。本发明还公开了其制备方法与应用。
文档编号A01H1/02GK103013995SQ201110290509
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者陈浩, 江山, 林拥军 申请人:华中农业大学