专利名称：防治温室黄瓜白粉病木霉可湿性粉剂的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种农业病虫害防治技术领域药物的制备及其应用，具体是一种防治温室黄瓜白粉病木霉可湿性粉剂的制备方法及其用途。
背景技术：
据FAO统计，自1970年以来，我国黄瓜栽培面积逐年增加，而且一直居世界首位。 2000年，我国黄瓜的栽培面积从1970年的24. 3万hm2增加到100. 4万hm2，增加了 3. 1倍， 占世界总栽培面积的56. 50%。由于日光温室目前复种指数过高，土壤盐渍化严重，病原过度积累，湿度过高，给白粉病的发生创造了有利条件。白粉病属世界性病害，是由子囊亚门单丝壳属真菌/Wigiflea)引起的黄瓜Wucumis sativus L.)叶部病害， 在黄瓜整个生长期都能产生危害，以中、后期发病较重。黄瓜白粉病由于具有潜育期短，再侵染频繁、流行性强和周年发生等特点，常造成减产20% 40%。在我国，白粉病每年都给春季保护地和夏秋露地黄瓜带来严重的经济损失。我国南方和北方不论温室、大棚及露地栽培的瓜地均有发生，且多发生在结果期及成熟期，若不及时防治，会导致植株叶片枯焦， 致使果实早期生长缓慢，植株早衰，严重影响瓜的品质和产量，是黄瓜生产上的三大病害之一。在武威市，白粉病是日光温室蔬菜上的主要病害，常年发生面积在466. 7hm2左右，危害损失达50t，给武威市日光温室蔬菜生产造成较大威胁。上海地区2011年黄瓜病害发生趋势预报显示，黄瓜白粉病属中等偏重发生年概率60%，中等发生年概率40%。目前，国内对黄瓜白粉病的防治主要有以下四种措施
(一)选用抗病品种。在近年来国内推介的近50个黄瓜品种中，对白粉病表现抗耐病的有津研4号，津杂3号，津春4号，90-5、津春2号，津春1号、中农2号，中农8号，碧春、 春香，中农6号，中农1101，早抗(江苏)，山西农大1号，露地3号(辽宁)，鲁黄7号，华早1 号(湖北)，早春2号(广东)。抗霜霉的品种一般都抗白粉病，如津研2号、津研4号、津绿4 号、津旺67、汇赢65等黄瓜品种。(二)加强栽培管理。在培育壮苗的基础上，要施底肥，每667平方米施5000千克腐熟有机肥，50 80千克复合肥。定植后加强水肥管理，膜下暗灌，注意通风、透光，控制温度，降低湿度，防止徒长和早衰。发病初期，要及时打药防治，及时摘除病叶带出田外深埋。 瓜拉秧后，彻底清除病残体，深翻减少病害的侵染来源。(三)熏蒸防治及高温消毒。在定植前，在20°C温度上下的条件下用硫磺粉熏蒸， 或者用45%的百菌清烟剂闭棚熏蒸；
(四)药剂防治。赵毅(浙江海正化工有限公司)等人创制微生物源杀菌剂长川素，该成分配制的各种制剂对黄瓜灰霉病、白粉病等菌病害有较好的防治效果。毛竹等用6%嘧肽菌净水剂防治黄瓜白粉病，相对防效达83. 85%，显著优于对照药剂15%三唑酮粉剂300mg/L， 并且对黄瓜安全。浙江省亚热带作物研究所明确了洲的武夷菌素水剂在黄瓜白粉病上的防治效果，并指出防治成本较低。张少武等人发明了一种含嘧菌酯的农用杀菌剂，有效活性成分含量为1 60%，对黄瓜白粉病、葡萄霜霉病、苹果黑星病有特效。辛增英等人文选用了安徽华星化工股份有限公司生产的30%百美悬浮剂进行试验，结果表明该药剂防治黄瓜白粉病效果好、安全性高。王丽等通过室内盆栽和田间药效试验，研究了唑菌酯对黄瓜白粉病的防治效果并证明效果良好。陈定花等用苯醚菌酯.戊唑醇防治黄瓜白粉病，效果明显。杨桂秋等用具有杀菌活性的嘧啶取代丙烯酸酯类化合物，对黄瓜霜霉病具有很高的活性，同时对黄瓜白粉病也有一定的活性。杜学林等用植物乳油防治黄瓜白粉病，结果证明棉籽油、豆油、花生油、玉米油、芝麻油和葵花油6种植物油乳油稀释至10、5m 1/L对黄瓜白粉病具有较好的防治作用。罗彩虹通过2年两地的试验，明确了 5%己唑醇SC对黄瓜安全、 对白粉病防治效果较好、持效期较长，药后7天和14天校正防效均在80%以上，具有较好的推广应用前景。范咏梅等人对5种杀菌剂，即80%成标(硫磺水分散剂)、50%翠贝(醚菌酯)、25%阿米西达SC、50%多菌灵WP、75%百菌清(宁可霜)，进行温室黄瓜白粉病防效试验，结果表明80%成标和50%翠贝能有效防治黄瓜白粉病，并有较强的保护作用。雷琼实验证明，25%烯肟菌脂乳油对黄瓜白粉病具有一定防治效果。周俊等用25%乙嘧酚悬浮剂喷施黄瓜，通过叶片和根吸收，产生内吸保护作用，起到防治白粉病的作用。乔康等选用50% 硫磺悬浮剂防治黄瓜白粉病，结果证明，二次用药后白粉病防效均在70%以上。此外，由于保护地特殊的生态环境、蔬菜较高的经济价值以及病害发生的频率较高，研究者们正在试验多种方法用来控制白粉病，除了不断开发和寻求新型低毒低残留化学药剂外，人们还致力于天然植物和微生物源农药的开发和应用，如唐蕊等人的研究表明大黄提取液对黄瓜的白粉病有很好的防治效果，于淑玲也发现一些中草药的提取液对黄瓜白粉病有较好的防治效果。代光辉教授等用刺槐茎叶中提取物制得控制黄瓜白粉病发生的水剂，无公害、无污染、无残留。石延霞等发现嗜线虫致病杆菌代谢产生的抗菌素一帕克素对黄瓜白粉病也有很好的防治效果，此外刘彦良等研究了宁南霉素和多抗霉素对黄瓜白粉病的控制作用。然而，无论是农业防治、化学防治还是生物防治均存在一些难题急需解决。 据文献报道，黄瓜高抗白粉病品种较少，保护地黄瓜抗病能力普遍较差。过度使用化学农药易引起抗药性和药害。白粉病黄瓜栽培环境较难控制，在管理粗放，施肥、灌水不当，枝叶过密，通风不良，光照不足等情况下极易迅速发病、传播。。目前生产上主要靠化学药剂来控制白粉病，但黄瓜白粉病病原菌对化学药剂的抗性速度上升较快，且短时间多次用药残毒较大。由于在白粉病防治中，长期、单一、大量采用三唑酮，致使病菌已对其产生抗药性。曾有实验表明，粉锈宁在黄瓜、豇豆发病中、盛期(发病率均95%以上)进行叶面喷雾，各种浓度对白粉病均有显著的防治效果。但是目前已证明粉锈宁会严重抑制黄瓜生长，使用后30 天内生长特别缓慢，直接影响其经济效益。常选用的甲基托布津、腈菌唑等防治黄瓜白粉病，但其效果均不够理想，急需筛选更有效的药剂。尽管化学农药用量在逐年增大，但防效却不断下降。因此，构建对环境友好的生物防治技术不仅可以有可持续防治该病害，同时减少化学农药的使用和对环境的污染，对农产品安全和绿色农业的发展具有重要意义。目前国内利用生防菌防治白粉病已有一些报道，杨文香等用三株链霉菌进行对黄瓜白粉病的防效及植株促生试验，菌株M63防效明显，具有应用前景。曹峰等用1000亿个/ g枯草芽孢杆菌防治黄瓜白粉病，效果较好。马华升等人用高产胞壁降解酶和抗菌肽的绿色木霉菌株发明了一种生防制剂，对黄瓜白粉病等蔬菜病害有较好的田间防效，显著提高了蔬菜、瓜果的产品质量，减少了化学农药的施用量，改善生态环境，提高食品安全性，显示出广阔的发展前景。目前除了杨春林、刘和现、马华升等人报道过木霉菌防治黄瓜白粉病的实例及申请相关专利外，木霉菌对黄瓜白粉病防治的应用还不是很多。但是杨春林等的报道还处于学术理论研究，尚未有成品，应用推广还尚需时日；刘和现等人的专利发明为木霉菌和毛壳菌的混合培养物，是在实验室室内条件下的茄瓶中制成，大规模的生产还存在一定的局限，并且部分抗病效果的验证是从室内平板对峙而来，大田效果未曾验证；马华升等人所申专利中，发酵培养基成份复杂，步骤繁琐，不易规模生产。木霉菌作为国际公认的生防真菌，不仅能对至少四个属18种的病原菌产生拮抗作用，并且已证明还能促进作物生长、 改良土壤环境、提高农产品品质。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足，提供一种防治温室黄瓜白粉病木霉可湿性粉剂的制备方法及其用途。本发明的可湿性粉剂是以哈茨木霉SH2303 {Trichoderma harzianum、为极心；该木霉菌株为华东地区分离的野生菌株，对蔬菜田微生物菌群无生态威胁；产孢量大，发酵培养基成分简单，工艺容易优化，菌剂制备成本低；成分为厚垣孢子，耐储藏，活性含量高。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤 步骤一，种子液的制备，哈茨木霉菌株rricAoifeiTsa harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963 在PDA培养基上培养2 3d，用打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5 7d ；
步骤二，厚垣孢子液的发酵，将步骤一所得木霉菌株SH2303种子菌接入产孢培养基中，在发酵罐中优化培养条件下发酵5 7d，厚壁孢子达6 7X IO8个/mL ；
步骤三，制备厚垣孢子粉，将步骤二所得发酵液经真空泵抽滤，得含厚垣孢子湿菌块， 将其置于低温、干燥、通风厨里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；
步骤四，将步骤三得到的木霉厚垣孢子粉与载体、分散剂、稳定剂和保护剂混合，制得防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂。优选的，步骤一中所述的PDA培养基成份为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g， 7jC 1 OOOmL。优选的，步骤一中所述的种子培养基成份为玉米粉4g，水IOOmL;所述种子培养基PH值为4。优选的，步骤二中所述的产孢培养基成份为玉米粉40g/L、NH4H2P04 140g/L、牛肉膏 540g/L、Na3P04 340g/L、CuS04. 5H20 0. 0640g/L、ZnS04. 7H20 0. 0640g/L、MnS04. H20 0.0240g/Lo优选的，步骤二中所述的优化培养条件为转速M0r/m，温度^°C，pH 4，溶氧量 80mg/Lo优选的，步骤四中所述的载体为高岭土或硅藻土 ；所述的分散剂为聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或亚甲基双荼磺酸钠；所述的保护剂为卵磷脂、甲基纤维素、脱脂奶粉或腐植酸；所述稳定剂为硝酸钾。优选的，所述的载体为高岭土 ；所述的分散剂为亚甲基双荼磺酸钠；所述的保护剂为卵磷脂；所述稳定剂为硝酸钾。
优选的，所述各组分的重量百分比含量为木霉厚垣孢子粉1 10%、高岭土 80 90%、卵磷脂0. 5 1%、硝酸钾0. 1 1%、亚甲基双荼磺酸钠8 10%。优选的，所述各组分的重量百分比含量为木霉厚垣孢子粉1%、高岭土 89%、卵磷脂0.65%、硝酸钾0.25%、亚甲基双荼磺酸钠9. 1%。本发明还涉及一种上述制备方法制得的可湿性粉剂在制备防治温室黄瓜白粉病药剂中的用途。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明制得的可湿性粉剂防治黄瓜白粉病效果良好，且易于商业化大规模推广，尤其适用于初生盐渍化或连作障碍而真菌病害严重的设施菜田，具有很高的田间普遍使用价值。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中涉及的木霉菌具体为哈茨木霉菌harzianum菌株 SH2303，是从华东地区农田土壤分离、纯化、筛选而来的，其保藏信息为该菌株已于2011 年6月17日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为NO. 4963 ；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所 100101。实施例1、木霉厚垣孢子粉的制备木霉厚垣孢子粉的制备包括以下步骤
步骤一，种子液的制备，哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963在PDA培养基上培养2 3d，用直径为5mm的打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量， 将菌饼接入种子培养基5 7d ；
步骤二，厚垣孢子液的发酵，将步骤一所得木霉菌株SH2303种子菌接入产孢培养基中，在300L发酵罐中优化培养条件下发酵5 7d，厚壁孢子达6 7 X IO8个/mL ；
步骤三，制备厚垣孢子粉，将步骤二所得发酵液经真空泵抽滤，得含厚垣孢子湿菌块， 将其置于低温、干燥、通风厨里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉。其中，步骤一中所述的PDA培养基成份为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水 IOOOmL ；所述的种子培养基成份为玉米粉4g，水IOOmL ；所述种子培养基pH值为4。步骤二中所述的产孢培养基成份为玉米粉40g/L、NH4H2PO4 140g/L、牛肉膏 540g/L、Na3PO4 340g/L、CuSO4. 5H20 0. 0640g/L、ZnSO4. 7H20 0. 0640g/L、MnSO4. H2O 0. 0240g/L ；所述的优化培养条件为转速M0r/m，温度^°C，pH 4，溶氧量80mg/L。实施例2、载体对菌落生长及孢子萌发的影响
步骤一菌丝生长速率测定。将载体以5mg/mL的浓度与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。用直径为5mm的打孔器取生长旺盛、菌龄相同的木霉菌丝块，接种在混合培养基平板中心，对照为普通的PDA平板，每个处理重复3次，48h后测菌落直径。处理半径记作 Rt，对照半径记作Re，半径比(％)=Rt / Rc *100。步骤二 孢子萌发率。将载体以5mg/mL的浓度与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0. ImL浓度为1000个孢子/mL的孢子悬浮液均勻涂布在混合培养基平板上， 以普通PDA平板作为对照，每个处理重复3次，放置于人工气候箱内1 黑暗12 h光照培养，24 h后计算菌落数。处理孢子数记作Ct，对照半径记作Ce，萌发率(％) =Ct / Cc *100 ；结果如表1所示。 表1载体对菌落生长及孢子萌发的影响
权利要求
1.一种防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，种子液的制备，哈茨木霉菌株rricAoifeiTffia harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963在PDA培养基上培养2 3d，用打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5 7d ；步骤二，厚垣孢子液的发酵，将步骤一所得木霉菌株SH2303种子菌接入产孢培养基中，在发酵罐中优化培养条件下发酵5 7d，厚壁孢子达6 7X IO8个/mL ；步骤三，制备厚垣孢子粉，将步骤二所得发酵液经真空泵抽滤，得含厚垣孢子湿菌块， 将其置于低温、干燥、通风厨里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；步骤四，将步骤三得到的木霉厚垣孢子粉与载体、分散剂、稳定剂和保护剂混合，制得防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂。
2.根据权利要求1所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 步骤一中所述的PDA培养基成份为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。
3.根据权利要求1所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 步骤一中所述的种子培养基成份为玉米粉4g，水IOOmL ；所述种子培养基pH值为4。
4.根据权利要求1所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的产孢培养基成份为玉米粉40g/L、NH4H2P04 140g/L、牛肉膏540g/L、 Na3P04 340g/L、CuS04. 5H20 0. 0640g/L、ZnS04. 7H20 0. 0640g/L、MnS04. H20 0. 0240g/L。
5.根据权利要求1所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 步骤二中所述的优化培养条件为转速M0r/m，温度^°C，pH 4，溶氧量80mg/L。
6.根据权利要求1所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 步骤四中所述的载体为高岭土或硅藻土 ；所述的分散剂为聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或亚甲基双荼磺酸钠；所述的保护剂为卵磷脂、甲基纤维素、脱脂奶粉或腐植酸；所述的稳定剂为硝酸钾。
7.根据权利要求6所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 所述的载体为高岭土 ；所述的分散剂为亚甲基双荼磺酸钠；所述的保护剂为卵磷脂；所述的稳定剂为硝酸钾。
8.根据权利要求7所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 所述各组分的重量百分比含量为木霉厚垣孢子粉1 10%、高岭土80 90%、卵磷脂0. 5 1%、硝酸钾0. 1 1%、亚甲基双荼磺酸钠8 10%。
9.根据权利要求8所述的防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂的制备方法，其特征在于， 所述各组分的重量百分比含量为木霉厚垣孢子粉1%、高岭土 89%、卵磷脂0. 65%、硝酸钾 0. 25%、亚甲基双荼磺酸钠9. 1%。
10.根据权利要求1所述的制备方法制得的可湿性粉剂在制备防治温室黄瓜白粉病药剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种防治温室黄瓜白粉病可湿性粉剂及其制备方法和用途。制备方法为哈茨木霉菌株TrichodermaharzianumSH2303CGMCCNO.4963在PDA培养基上培养2～3d，用打孔器打菌饼，以3片/瓶的接菌量，将菌饼接入种子培养基5～7d；再接入产孢培养基中，在300L发酵罐中优化培养条件下发酵5～7d，厚壁孢子达6～7×108个/mL；将所得发酵液经真空泵抽滤，得含厚垣孢子湿菌块，将其置于低温、干燥、通风厨里，干燥约24～36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；将其与载体、分散剂、稳定剂和保护剂混合，制得可湿性粉剂。本发明的可湿性粉剂采用的木霉菌株对蔬菜田微生物菌群无生态威胁；产孢量大，发酵培养基成分简单，工艺容易优化，菌剂制备成本低；成分为厚垣孢子，耐储藏，活性含量高。
文档编号A01N63/04GK102388922SQ20111032295
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者孙兴全, 李雅乾, 王秉丽, 陈捷 申请人:上海交通大学