专利名称：一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法。
背景技术：
就目前的各种研究结果而言，对鱼类洄游路线的研究较常用的方法主要有是标志放流法。一般是利用特制的标牌或标签结附在人工培育的幼鱼或捕获的鱼体上，放流到自然水域中。当标志鱼重捕时，将放流和重捕时的各项资料加以对比，以分析鱼类洄游的变动规律。其方法主要有以下几种1.切断标志法切断部分鳍条；2.外部标志法将标牌或标签挂夹在尾柄、背鳍或鳃盖上；3.内部标志法将可探测芯片植入鱼体内部，用电磁设备进行检验；4.同位素标志法用同位素进行标志，重捕时用示踪原子探测器检出标志鱼；5.药品浸泡法用一定有效比例的四环素或者茜素络合物对标志鱼进行一定时间的浸泡或食物喂养，待重捕后挑出其耳石在荧光显微镜下观察有无荧光环。虽然这些方法均可以检测出鱼类的洄游路线，但是必须实现捕到标本，标志后放流才能得以实现，并且放流后的标本的成活率不能保证，实验时间长，回捕率较低，这些均对研究鱼类洄游路线造成不便，更不能对不同种群类型的鱼类的洄游路线进行区分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法， 该方法操作简单，快速，而且准确率较高。本发明所采用的技术方案是
一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法，包括如下步骤
1)在某一洄游鱼类各生境设采样点，采集样本；
2)提取样本基因组DNA，利用COI基因通用引物进行PCR扩增，对目的片段进行测序， 将测得的正反向序列进行比对后，通过软件进行聚类和单倍型分析，确定每个样本的单倍型类型；
3)把每个样本的单倍体型标示在采样点上，根据不同采样点所含有的种群类型，确定该洄游鱼类的种群分布和洄游路线。优选的，步骤2)所述CO I基因通用引物序列如下
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。优选的，步骤2)的具体操作为
(1)采用酚-氯仿法提取样本基因组DNA；
(2)利用COI基因通用引物进行PCR扩增，其反应体系为50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用无菌水补足；PCR反应的条件94°C预变性:3min，40个循环(94°C变性30s，51.4°C退火45s，72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；
(3)将PCR产物进行测序；
(4)将测得的正反向序列进行比对后，通过软件进行聚类和单倍型分析，确定每个样本的单倍型类型。优选的，所述洄游鱼类为广东鲂。本发明的有益效果在于
与标志放流法的几种方法相比，本方法不仅能够准确快速的监测鱼类的洄游路线，并且能够区分同种鱼类的不同种群类型的洄游路线，其实验方法简单快速，具有准确性。根据不同采样点的单倍型种类和同种单倍型在不同采样点的分布，可以寻找出不同单倍型种群类型的分布范围，和根据水域的范围及流向确定不同单倍型种群类型的洄游路线，对研究河网中同种鱼类不同种群类型的活动范围及走向具有重要意义。
图1 每个采样点特有的广东鲂单倍型类型；
图2 每个采样点共有的单倍型类型的活动范围或洄游路线图； 图3 广东鲂H10、H11、H19、H20单倍型类型的活动范围或洄游路线图； 图4 :「*·Η3、Η5、Η8、Η14、Η17、Η21单倍型类型的活动范围或洄游路线图。
具体实施例方式下面以广东鲂为例，对本发明作进一步的说明，但并不局限于此，在本领域技术人员的理解范围内，该方法还可用于快速确定其他洄游鱼类的种群分布和洄游路线。广Mm (Megalobrania terffli/K^is)属于鲤科，舶亚科，鲂属。广东鲂属于江河距离洄游、有固定产卵场、聚群产卵的鱼类，仅分布于广东、广西和海南省。珠江历史调查，广东鲂产卵场分布于西江广东段青皮塘和罗旁，以及珠江一级支流北江和贺江。西江广东鲂的生活范围从钱江沿珠江至珠江口均有分布，广东鲂体型中等，是珠江水系重要的经济鱼类。至上世纪八十年代，由于梯级开发，北江和贺江的产卵场功能逐渐消失，广东鲂的生存面临威胁。目前广东鲂产卵场保存广东段青皮塘和罗旁二地，相距约30公里。近年监测表明，广东鲂在二个产卵场的产卵期不一致，产卵亲鱼个体也存在差异，早期补充资源在不断下降。因此，了解野生广东鲂种群的遗传多样性，了解广东鲂不同群体在水域中的分布及洄游路线，对广东鲂的资源管理和保护具有重要意义。1、样本采集
在西江(梧州、青皮塘、罗旁、肇庆)、东江、北江、东四口门(洪奇浙门、横门)、西四口门 (磨刀门、崖门)等各个广东鲂分布水域采集样本，每个采集点采集样本分别为104 (14、33、 40、17)、68、24、55、27尾，共278尾样本，分别做标记。2、样本单倍型类型分析
(1)样品DNA的提取与分离基因组DNA提取采用传统的酚-氯仿法提取。将鳍条组织晾干，剪碎后加入460μ1 ΞΤΕ,δΟμΙ的10% SDS和10μ1 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻； 550C水浴消化2-3小时；加入水饱和酚600μ1，轻轻摇动混勻lOmin，12000rmp离心IOmin ； 取上清液置于新的离心管中，加入酚氯仿异戊醇25:24:1 600μ1，抽提lOmin，12000rmp离心IOmin ；取上清液置于新的离心管中，加入氯仿异戊醇500μ1，轻轻摇晃混勻 5min, 12000rmp离心IOmin ；取上清液置于新的离心管中，加入冰无水乙醇，一 20°C保存 IOmin, 12000rmp离心lOmin，倒出无水乙醇；然后用70%的乙醇漂洗1次，倒出乙醇，室温晾干，加入ΙΟΟμΙ的ddH20，通过琼脂糖凝胶(含0. 5ug/mL的溴化乙锭)电泳来鉴定，一
20 0C保存备用。(2) PCR扩增引物为CO I通用引物，引物序列为，
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。(3) PCR扩增对反应体系优化后进行PCR反应。其反应体系为50μ1 有5μ1 buffer (200mM Tris-HCl, pH8. 4 ；200mM KCl ； IOOmM (NH4) 2S04 ； 15mM MgCl2), 4ul dNTP Mixture (2. 5mM)，0. 6μ1 引物(上游引物 0. 3 μ ，下游引物 0.3 μ )，4μ1 模板 DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用无菌水补足。PCR反应的条件94°C预变性!Min，40个循环(94°C变性30s， 51.4°C退火45s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min。扩增产物4°C保存，以待电泳。(4) PCR产物的检测扩增产物取4μ1在1. 0%的琼脂糖凝胶电泳(含0. 5g/mL溴化乙锭)上进行电泳，以220V稳定电压电泳25min左右。电泳结果用凝胶成像系统进行拍照并保存。(5)将剩余的扩增产物送至测序公司测序。(6)将测得的正反向序列进行比对后，用软件MEGE4. 0和DNAsp进行聚类和单倍型类型分析，确定每个样本的单倍型数量和类型。具体步骤为MEGE4. 0中的cluster W比对后，存为*. meg文件，根据多重比对的结果，利NJ法进行系统进化树的构建，节点的数值是Bootstrap 1000次抽样检验的结果。DNAsp软件打开meg文件，进行单倍型分析。综合聚类分析结果和单倍型分析结果，确定所有广东鲂的样本中，共有M种单倍型，如表1所
7J\ ο3、广东鲂种群分布和洄游路线的确定
将2分析得到的各个样本的单倍型标示在各个采样点上，根据不同采样点所含有的种群类型确定广东鲂不同种群的分别位点和洄游路线。4、实验结果
实验结果表明，珠江水系中下游的各个江段所采集广东鲂的样本278尾，共有M个单倍型(ΗΓΗΜ)，每种单倍型的分布位点见表1。每个采集点所分布的单倍型数目见表2、图 2。由表1、表2可见，所有的M种单倍型中，Η4、Η24是在研究水域所有地点均能采集到， Η19是除了东江外其他采样点也均能采集到，而HI、Η22、Η23为东四口门特有，H2、H12、H15 为罗旁特有，H6、H18为青皮塘所特有，H7为东江所特有，H13为梧州所特有，H16为北江所特有。
权利要求
1.一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法，包括如下步骤1)在某一洄游鱼类各生境设采样点，采集样本；2)提取样本基因组DNA，利用COI基因通用引物进行PCR扩增，对目的片段进行测序， 将测得的正反向序列进行比对后，通过软件进行聚类和单倍型分析，确定每个样本的单倍型类型；3)把每个样本的单倍体型标示在采样点上，根据不同采样点所含有的种群类型，确定该洄游鱼类的种群分布和洄游路线。
2.根据权利要求1所述一种快速确定鱼类种群分布和洄游路线的方法，其特征在于， 步骤2)所述CO I基因通用引物序列如下CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)；CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。
3.根据权利要求1所述一种快速确定洄游鱼类种群分布和洄游路线的方法，其特征在于，步骤2)的具体操作为(1)采用酚-氯仿法提取样本基因组DNA；(2)利用COI基因通用引物进行PCR扩增，其反应体系为50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用无菌水补足；PCR反应的条件94°C预变性:3min，40个循环(94°C变性30s，51.4°C退火45s， 72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；(3)将PCR产物进行测序；(4)将测得的正反向序列进行比对后，通过软件进行聚类和单倍型分析，确定每个样本的单倍型类型。
4.根据权利要求1所述一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法，其特征在于，所述洄游鱼类为广东鲂。
全文摘要
本发明公开了一种快速确定洄游鱼类种群分布及洄游路线的方法，该方法基于COⅠ基因的聚类分析技术，具有操作简单、快速、准确的特点，适于推广应用。
文档编号A01K61/00GK102499157SQ20111035010
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者吴茜, 李捷, 李新辉, 李跃飞, 杨计平, 王超, 谭细畅, 赖子尼 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所