专利名称：具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法
技术领域：
本发明涉及玉米的选育方法，尤其涉及一种具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法。
背景技术：
随着社会老年化和人们用眼过度情况的不断加剧，视力下降、视网膜黄斑病变、白内障、糖尿病视网膜病变、飞蚊症、青光眼等中老年人常见的眼疾将逐步普遍化和低龄化，而其物质基础的根源在于长期缺乏人体自身不能合成、必须来源于膳食中的“眼黄金”——玉米黄质。玉米黄质(Zeaxanthin, 3, 3' _ 二轻基_ P _胡萝卜素)是异戍二烯类不饱和化合物，属于类胡萝卜素的一种，分子式为C40H5602，自然界中常与￠-胡萝卜素、叶黄素等共存，且广泛存在于人体各个组织中，但其在眼睛中的分布最为突出和最具特征性，视网膜中央负责精细视力、视觉最为敏锐的黄斑区即是玉米黄质浓度最高的部位。近30年来，大量病理学研究表明，玉米黄质对视网膜的发育和成熟具有重要意义，对视觉有很好的保护作用，特别是在预防白内障、老年性黄斑变性(AMD)、增强免疫功能、减少心血管疾病发病率和减少癌症的发生等方面具有独特的生理功能。同时，膳食玉米黄质的摄入量和黄斑色素密度之间存在着显著的正相关关系。目前，人们已经意识到同样存在于视网膜中的另外一种黄斑色素一叶黄素的重要性，但对玉米黄质的重视还远远不够。研究分析表明，成人视网膜黄斑中玉米黄质与叶黄素的比例为214 1，而新生儿的黄斑尚未形成，因此其中叶黄素含量高于玉米黄质，两者的比例为1149 1，与周边视网膜类似。婴儿视网膜的发育和成熟与这一时期叶黄素和玉米黄质的比例变化保持密切同步，说明玉米黄质对视网膜的发育和成熟具有重要意义。 近年来，欧美许多国家已批准将玉米黄质作为食用色素，且瑞士罗氏制药、荷兰帝斯曼等公司已有相关保健和治疗产品推出。但在食品工业日新月异的今天，人们的健康意识不断提高，对食品安全也提出了新的标准。合成色素虽然色泽鲜艳、稳定件好、价格低廉，但因合成毒性等问题，使人们担忧和恐惧；与此同时，天然绿色植物色素安全无毒，且其特有的营养价值和生理活性，深受人们喜爱。富含功能性成分的食品，不仅具有营养和美味功能，还有良好的人体健康调节功能。但是，相对于叶黄素，玉米黄质的来源比较有限。许多水果、叶类蔬菜中都富含叶黄素，而玉米黄质则主要在玉米、枸杞、柿子等少数蔬菜水果中富集，而如果能够提高其含量，不但可通过日常膳食源头补充体内所需玉米黄质，延缓、预防和辅助治疗疾病，改善学龄儿童、老年人、视疲劳人群及受光污染的人群的眼睛健康水平，而且可显著增加农产品的附加值，促进农民增收和农业转型升级。迄今为止，尚未见有关通过育种手段提高其在粮食和蔬菜作物中含量的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前大多数鲜食型玉米中的玉米黄质少，玉米的选育方法并无侧重于选育玉米黄质，导致目前大多数玉米的玉米黄质含量成下降趋势等缺陷，提供一种有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法。本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的一种具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法。该方法包括以鲜食玉米自交系为起始材料，筛选一类可稳定表达的玉米黄质含量8mg/kg以上的玉米品种，或以带有富含玉米黄质基因的玉米材料为供体，经杂交、回交或体细胞无性系变异，最终得富含玉米黄质的玉米自交系或杂交种。利用该方法选育的富含玉米黄质的鲜食玉米，玉米黄质含量比普通鲜食玉米品种高一倍以上，经食用后可有效补充体内特别是眼睛所需的玉米黄质，延缓和预防眼睛疾病，缓解视疲劳，维护人体健康。其中鲜食玉米主要包括甜玉米和糯玉米。一种具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，包括以下步骤 1)收集并种植籽粒外观为黄色或浅黄色的玉米，在适宜鲜食时期剥下完整籽粒并用小刀沿籽粒中缝纵切，选取胚乳全部为黄色或浅黄色的胚乳；然后提取皂化物备用；
2)采用紫外可见分光光度法，检测步骤I)所筛选的新鲜籽粒中的总类胡萝卜素含量；该方法采用检测波长为454nm ;保留总类胡萝卜素含量10mg/kg以上的籽粒；
3)种植步骤2)筛选的籽粒，采用高效液相色谱法(HPLC法)对其新鲜玉米籽粒中玉米黄质含量进行定量分析；保留玉米黄质含量8mg/kg以上的材料；
步骤4)，继续种植扩繁步骤3)所选籽粒，筛选农艺性状好、配合力强的玉米品系，或以带有富含玉米黄质基因的玉米籽粒为供体，经杂交、回交或体细胞无性系变异获得的品系进行配组，筛选综合表现良好的品系，最终获得遗传稳定的富含玉米黄质的玉米自交系或杂交种。所述步骤I)中的玉米籽粒是玉米常规品种或杂交种亲本或种植资源或诱变产生的品系或自交系。所述步骤I)中的皂化物制取步骤如下
a、取20g玉米籽粒磨碎，加丙酮提取液，抽滤，反复几次，直到提取液无色；
b、合并提取液，减压浓缩至干；浓缩时温度低于40度；
C、用少量甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30% (体积比)甲醇-KOH皂化4小时以上，得到皂化液；
d、减压浓缩皂化液到最小体积，加少量乙酸乙酯和正己烷等体积比配置的混合液(I1=V/V)萃取,重复萃取多次,直到萃取液无色；
e、合并萃取液，在分液漏斗中用蒸馏水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积，得到类胡萝卜素提取物；
f、将浓缩好的类胡萝卜素提取物转移到1.5ml的离心管中，用N2气吹干剩余的溶齐U，_20°C保存备用；
g、每样重复三次。紫外可见分光光度法具体为所述称取0. 1-0. 2g皂化物，磨碎，加入5ml正已烷丙酮=3:2 (体积比)，，暗条件下浸提16小时，中间摇动几次；然后加入Iml 20% (体积比)KOH-甲醇，暗条件下反应一个小时；再加入3ml正已烷和Iml 10wt%硫酸钠溶液，混匀后让其静止分层，上层黄色液体即为粗提的总类胡萝卜素溶液；以空白为对照，在紫外-可见分光光度计454nm处测定。由于紫外-可见分光光度计波长为整数，根据图I和图2，叶黄素靠近460nm时测定值降低，而玉米黄质在454nm附近基本差不多，因此取454nm为测定波长。所述高效液相检测法具体为检测采用Waters的高效液相检测系统，其中检测器为2998型二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb 0DS2(5 u m, 250X4. 6mm)，流动相为乙腈甲醇二氯甲烧正己烧=85 5 5 5 (体积比),流速lml/min ;样品用Iml流动相溶解，过0. 45 iim的滤膜后进样，进样量IOii I。标准样品玉米黄质和叶黄素分别稀释五个浓度梯度，制作标准曲线。综上所述，本发明与现有技术相比具有如下优点
以本发明培育出的富含玉米黄质的鲜食玉米，可以
I、准确测定玉米黄质需利用HPLC法，本发明由于采用分光光度法进行大量前期筛选，减低了测定成本，并可在水稻等其他作物富含玉米黄质材料的选育中延伸应用。2、一般测定总类胡萝卜素的波长为446nm，本发明采用的分光光度法检测是以453 455nm的玉米黄质特征吸收峰进行检测，可有效选择富含玉米黄质的品种，加大前期检测效率。3、本发明以近年来越来越受到人们喜爱的鲜食玉米为有效载体，在国际上首次开展富含玉米黄质益眼功能玉米的研发，紧密符合全球市场需求，可有效补充人体玉米黄质，从膳食源头预防老花眼、白内障和老年性黄斑变性的发生，有利于眼睛保健和人体健康。4、通过该功能型玉米的推广种植，可大大提高经济效益，促进农民增收和农业转型升级。
图I是叶黄素光谱图。图2是玉米黄质光谱图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明。实施例I :
玉米黄质含量高达9. 3mg/kg的功能型鲜食玉米选育方法
以甜玉米品种“华珍”为起始材料，经3代自交选育，取含水量13. 5%的优良自交系“华36-9”干种子，用钴-60的Y射线辐照处理，照射剂量为常规剂量200Gy。直播诱变当代种子，混收诱变一代植株的种子。混合种植诱变二代群体材料。在授粉21天左右剥下完整籽粒并用小刀沿籽粒中缝纵切，选取胚乳全部为黄色或浅黄色的材料。提取皂化物，采用紫外可见分光光度法分别检测所有材料的新鲜玉米籽粒中总类胡萝卜素含量。保留总类胡萝卜素含量10mg/kg以上的材料并按株系分别种植，采用HPLC法分别对其新鲜玉米籽粒中玉米黄质含量进行定量分析。检测采用Waters的高效液相检测系统，其中检测器为2998型二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb 0DS2 (5 u m, 250X4. 6mm),流动相为乙腈甲醇二氯甲烷正己烷=85 :5 :5 :5，流速lml/min。样品用Iml流动相溶解，过0. 45 y m的滤膜后进样，进样量10 ill。保留玉米黄质含量8mg/kg以上的材料。同时观察该突变性状的表达稳定性与遗传控制、农艺性状、品质特性、抗病性和杂种优势，经过反复筛选、淘汰，最终得一个玉米黄质含量比对照增加120%以上，具有优良农艺性状、抗病和杂种优势强的鲜食玉米品系。皂化物制取步骤如下
a、取20g玉米籽粒磨碎，加丙酮提取液，抽滤，反复几次，直到提取液无色；
b、合并提取液，减压浓缩至干；浓缩时温度低于40度；
C、用少量甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30% (体积比)甲醇-KOH皂化4小时以上，得到皂化液；
d、减压浓缩皂化液到最小体积，加少量乙酸乙酯和正己烷等体积比配置的混合液(I1=V/V)萃取,重复萃取多次,直到萃取液无色；
e、合并萃取液，在分液漏斗中用蒸馏水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积，得到类胡萝卜素提取物；
f、将浓缩好的类胡萝卜素提取物转移到1.5ml的离心管中，用N2气吹干剩余的溶齐U，_20°C保存备用；
g、每样重复三次。紫外可见分光光度法具体为称取0. 1-0. 2g皂化物，磨碎，加入5ml正已烷丙酮=3:2 (体积比)，，暗条件下浸提16小时，中间摇动几次；然后加入Iml 20% (体积比)KOH-甲醇，暗条件下反应一个小时；再加入3ml正已烷和Iml 10wt%硫酸钠溶液，混匀后让其静止分层，上层黄色液体即为粗提的总类胡萝卜素溶液；以空白为对照，在紫外-可见分光光度计454nm处测定。由于紫外-可见分光光度计波长为整数，根据图I和图2，叶黄素靠近460nm时测定值降低，而玉米黄质在454nm附近基本差不多，因此取454nm为测定波长。高效液相检测法具体为检测采用Waters的高效液相检测系统，其中检测器为2998型二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb 0DS2 (5 y m，250 X 4. 6mm)，流动相为乙腈甲醇二氯甲烧正己烧=85 5 5 5 (体积比),流速lml/min ;样品用Iml流动相溶解，过0. 45 y m的滤膜后进样，进样量10 yl。标准样品玉米黄质和叶黄素分别稀释五个浓度梯度，制作标准曲线。紫外可见分光光度法为初步测定，此方式实验成本低，然后用高效液相检测法进行精细的测定。高效液相检测法使用成本较高，在紫外可见分光光度法初步排除不适合籽粒后，再用高效液相检测法进行测定既节省了费用，又提高了效率，便于推广使用。
权利要求
1.一种具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，包括以下步骤 1)收集并种植籽粒外观为黄色或浅黄色的玉米，在适宜鲜食时期剥下完整籽粒并用小刀沿籽粒中缝纵切，选取胚乳全部为黄色或浅黄色的胚乳；然后提取皂化物备用； 2)采用紫外可见分光光度法，检测步骤I)所筛选的新鲜籽粒中的总类胡萝卜素含量；该方法采用检测波长为454nm ;保留总类胡萝卜素含量10mg/kg以上的籽粒； 3)种植步骤2)筛选的籽粒，采用高效液相色谱法(HPLC法)对其新鲜玉米籽粒中玉米黄质含量进行定量分析；保留玉米黄质含量8mg/kg以上的材料。
2.根据权利要求I所述的具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，其特征在于，还包括了步骤4)，继续种植扩繁步骤3)所选籽粒，筛选农艺性状好、配合力强的玉米品系，或以带有富含玉米黄质基因的玉米籽粒为供体，经杂交、回交或体细胞无性系变异获得的品系进行配组，筛选综合表现良好的品系，最终获得遗传稳定的富含玉米黄质的玉米自交系或杂交种。
3.根据权利要求I所述的具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，其特征在于，所述步骤I)中的玉米籽粒是玉米常规品种或杂交种亲本或种植资源或诱变产生的品系或自交系。
4.根据权利要求I所述的具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，其特征在于，所述步骤I)中的皂化物制取步骤如下 a、取20g玉米籽粒磨碎，加丙酮提取液，抽滤，反复几次，直到提取液无色； b、合并提取液，减压浓缩至干；浓缩时温度低于40度； C、用少量甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30% (体积比)甲醇-KOH皂化4小时以上，得到皂化液； d、减压浓缩皂化液到最小体积，加少量乙酸乙酯和正己烷等体积比配置的混合液(Il=v/v)萃取,重复萃取多次,直到萃取液无色； e、合并萃取液，在分液漏斗中用蒸馏水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积，得到类胡萝卜素提取物； f、将浓缩好的类胡萝卜素提取物转移到1.5ml的离心管中，用N2气吹干剩余的溶齐U，_20°C保存备用； g、每样重复三次。
5.根据权利要求I所述的具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，其特征在于，所述紫外可见分光光度法具体为称取O. 1-0. 2g皂化物，磨碎，加入5ml正已烷丙酮=3:2 (体积比)，暗条件下浸提16小时，中间摇动几次；然后加入Iml 20%(体积比)KOH-甲醇，暗条件下反应一个小时；再加入3ml正已烷和Iml 10wt%硫酸钠溶液，混匀后让其静止分层，上层黄色液体即为粗提的总类胡萝卜素溶液；以空白为对照，在紫外-可见分光光度计454nm处测定。
6.根据权利要求I所述的具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法，其特征在于，所述高效液相检测法具体为检测采用Waters的高效液相检测系统，其中检测器为2998型二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb 0DS2 (5 μ m, 250X4. 6mm),流动相为乙腈甲醇二氯甲烧正己烧=85 5 5 :5(体积比),流速lml/min ;样品用Iml流动相溶解,过O. 45 μ m的滤膜后进样，进样量10 μ I。
全文摘要
本发明涉及一种具有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法。本发明的目的在于针对目前大多数鲜食型玉米中的玉米黄质少，玉米的选育方法并无侧重于选育玉米黄质，导致目前大多数玉米的玉米黄质含量成下降趋势等缺陷，提供一种有眼睛保健效果的鲜食型玉米的选育方法。该方法包括以鲜食玉米自交系为起始材料，采用紫外可见分光光度法和高效液相色谱法筛选一类可稳定表达的玉米黄质含量8mg/kg以上的玉米品种，或以带有富含玉米黄质基因的玉米材料为供体，经杂交、回交或体细胞无性系变异，最终得富含玉米黄质的玉米自交系或杂交种。
文档编号A01H1/02GK102778436SQ20111042752
公开日2012年11月14日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者刘新华, 刘莉, 吴殿星, 徐秀红, 曹春信, 舒小丽, 袁名安 申请人:金华市农业科学研究院