专利名称：优质多花黄精试管苗快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是优质多花黄精试管苗快速繁殖方法。
背景技术：
多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)系百合科黄精属药用植物，其根茎作中药黄精用，含多糖、氨基酸、蒽醌类化合物等成分，具有抗菌、降压、抗衰老及治疗风湿痛等作用。在我国南方的一些地区有栽培，其主要靠根茎的无性生殖和种子进行繁殖，但由于繁殖系数低和种子繁殖周期长速度慢，无法提供大量种苗，因而大面积种植受到限制。此外， 长期无性生殖易造成种质性状退化，影响着品种的遗传稳定性。利用组织培养方法繁殖多花黄精，可有效地提高其品性，增加繁殖系数，缩短培育周期。目前，有关多花黄精的组织培养和快速繁殖的报道多是基于芽体进行的，且组培体系的方法步骤为外植体的选取、预处理和消毒一诱导培养基培养一增殖培养基培养一增殖壮苗培养基培养一生根培养基培养。对于外植体的选取、消毒，徐忠传等2006先将取回的野生黄精根茎在清水中洗掉泥土后，再用洗衣粉浸泡30min，自来水冲洗，再在无菌操作台上用0. 15%升汞消毒lOmin， 灭菌去离子水洗涤4次，切去切口后接到诱导培养基上。刘红梅等2010是将黄精根茎从土中挖出后，洗去泥土，用刀切取带芽根茎于洗洁精水溶液中浸泡30min，之后洗净，用75 % 乙醇擦洗，再用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗；再在无菌操作台上采用重复2. 5%次氯酸钠 5min，灭菌去离子水刷洗2次过程三次进行，最后用无菌滤纸吸干水分，用刀切去伤口坏死部分接种诱导培养基。对于之后的诱导培养基培养，前人研究主要集中在培养基成分的不同上，徐忠传等2006采用的诱导培养基为MS+6-BA4. 0mg/L+NAA0. ang/L，刘红梅等2010认为2，4-D比NAA更有利于多花黄精的不定芽诱导，杨玉红2011认为6-BA对诱导黄精愈伤组织生长效果显著，2，4-D、NAA和KT效果不显著。在无菌操作台上用0. 15%升汞消毒lOmin，灭菌去离子水洗涤4次或在无菌操作台上采用重复2. 5%次氯酸钠5min，灭菌去离子水刷洗2次过程三次进行目前皆作为常规的消毒技术。对于增殖培养基培养，徐忠传等2006是将诱导所得丛芽切成2-3株一丛(即2_3 个芽体)后，接种于系列增殖培养基进行增殖的，培养基成分上，徐红梅等2003认为激素组合TDZ 1. 5mg/L+2，4-D1. 0mg/L对黄精根茎芽增殖最有利，徐忠传等2006认为激素组合 6-BA4. 0mg/L+NAA0. 2mg/L不仅能使芽快速增殖，且不定芽增殖的综合质量好，无畸形叶片产生。对于壮苗生根培养阶段，徐忠传等2006是将分化丛芽接种培养基MS+6-BA1. Omg/ L+NAA0. 2mg/L, 30d后将丛芽分开，取健壮单个根茎芽，再接种于MS+NAA0. 5mg/L生根培养基上。总之，现有研究只局限于利用芽体培养，对于后期种苗的生长速度较慢，无法满足优质黄精种苗的规模化生产。
发明内容
本发明的目的基于上述技术背景，采用了消毒前的预处理，结合研究了培养基中糖分浓度和生长调节剂多效唑浓度对多花黄精块根部分和芽体部分增殖的影响，以提供多花黄精块根增殖的培养基组合物配方及其应用，进一步提供优质多花黄精试管苗快速繁殖方法。满足优质黄精种苗的规模化生产。本发明解决其技术问题采取的技术方案包括培养基的配制；繁殖方法的步骤为外植体的选取、预处理和消毒一诱导培养基培养一增殖培养基培养一增殖壮苗培养基培养一生根培养基培养；各组培阶段的培养条件是温度25士2°C、光照时间12h/d，诱导阶段采用散射光，增殖、壮苗和生根阶段光照强度2000IX ；其特征在于(一 )培养基的配制各种培养基配方为(I)诱导培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；(II)带芽块根的增殖培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 糖 60g/L ；(III)芽体部分增殖培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4_D+ 糖 60g/L ；(IV) ±夬根部分增殖壮苗培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/ L+ 糖 60g/L ；(V)块根部分生根培养基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上 I-V 号培养基PH均介于5. 6-5. 7之间；(二)繁殖方法的步骤为①外植体的选取、预处理和消毒材料选取当年的9、10月份，于晴天选取多花黄精带芽的块根，将其清洗干净后，置于1/700浓度的甲基托布津中浸泡30min取出，置于常温条件晾干，之后用常规的消毒技术对带芽的块根进行消毒，最后用无菌滤纸将无菌水吸干备用；②诱导培养基培养将已消毒处理过的带芽的块根用解剖刀剖去块根部分表层， 只留主芽加0. 8-1. 2cm3的块根，接入(I)号诱导培养基上进行诱导培养，40-50天后，诱导出新的幼芽，块根部分膨大；③增殖培养基培养(a)、将已诱导出新芽的块根转接(II)号带芽块根的增殖培养基进行增殖培养， 30-40天后，块根部分膨大，新的芽体冒出；(b)、将已增殖的带芽的块根切成块根部分和芽体部分，块根部分转接(II)号带芽块根的增殖培养基上，30-40天后，再次膨大，新的芽体再次冒出；生长出的新的增殖带芽的块根，新的增殖带芽的块根重复循环本(b)分步骤上述过程增殖培养3-6代产生末代终产物带芽体的块根及中间产物分切下来的芽体，末代终产物带芽体的块根即可进入已增殖块根部分后续的增殖壮苗培养基培养步骤；(c)、将(b)分步骤中循环步骤切分下来的中间产物芽体部分转接(III)号芽体部分增殖培养基上，30-40天后，芽体部分基部块根膨大，而后再返回(b)分步骤与(c)分步骤上述过程进行3-6代复合循环增殖，最后产生末代终产物带芽体的块根；④增殖壮苗培养基培养将经过(b)分步骤循环及经过(b) (C)分步骤复合循环增殖培养产生的末代终产物带芽体块根的块根部分转接(IV)号块根部分增殖壮苗培养基进行壮苗培养，30-40天后，块根再次膨大，新的芽体冒出；
⑤生根培养基培养将经步骤④壮苗的块根部分接种到(V)号块根部分生根培养基上，20-30天后，块根部分基部长出根系即可进行组培苗的驯化和移栽。本发明的优点在于1、提出的多花黄精试管苗培养为新的芽与块根分切循环培养过程；最后得到的多花黄精块根肥大质量俱佳，生根率达到100%，利于后续的大田栽培，有效缩短生长周期。2、方法由于带芽的块根进行了 1/700浓度的甲基托布津的预处理，在诱导培养阶段采用散光培养，有效地降低诱导的消毒污染率，促进组培苗的分化和生长。3、提出的多花黄精试管苗MS培养基添加60g/L浓度的糖分和MS培养基添加一定浓度的多效唑能够有效促进多花黄精的块根增殖生长，解决了多花黄精增殖培养过程中营养分配的问题，此外，一定浓度的多效唑还能够促进芽的形成。
附图为本发明培养流程示意图。
具体实施例方式在步骤③增殖培养基培养的(C)分步骤的复合循环增殖中，由(III)号芽体部分增殖培养基培养出的各代带芽体的块根，除末代带芽体块根直接作为末代终产品外，其余上几代皆进入(b) (C)分步骤循环。实施例1 本实施例1中的这种多花黄精组培快速繁殖方法，按如下步骤进行(1)培养基的配制培养基配方(1)诱导培养基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA;(II)带芽块根的增殖培养基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖60g/L ； (III)芽体部分增殖培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4-D+糖 60g/L ； (IV)块根部分增殖壮苗培养基 MS+1. Omg/ L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/L+ 糖 60g/L ； (V) ±夬根部分生根培养基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L ΝΑΑ+0. 5%活性炭；以上I-V号培养基pH均介于5. 6-5. 7之间。(3)多花黄精带芽的块根诱导培养将以消毒处理过的带芽的块根用解剖刀剖去块根部分表层，只留主芽加0.8-1. 2cm3的块根，接入(I)号诱导培养基上进行诱导培养， 40-50天后，诱导出新的幼芽，块根部分膨大；(4)多花黄精已诱导出新芽的块根的增殖培养(a)将已诱导出新芽的块根转接 (II)号增殖培养基进行增殖培养，30-40天，块根部分膨大，新的芽体冒出。(b)将已增殖的带芽的块根切成块根部分和带芽的芽体部分，块根部分转接(II)号增殖培养基，30-40天， 块根部分块块根再次膨大，新的芽体再次冒出。新的增殖带芽的块根部分循环(b)过程增殖培养3-6代即可进行已增殖块根部分的壮苗培养。(5)多花黄精已增殖分离的块根部分的壮苗培养将已循环增殖3-6代的新膨大带芽的块根部分转接(IV)号培养基进行壮苗培养，30-40天后，块根再次膨大，新的芽体冒
出ο(6)多花黄精块根部分的生根培养将经步骤( 壮苗的块根部分部分接种到(V) 号生根培养基上，20-30天后，块根部分基部长出根系即可进行组培苗的驯化和移栽。各组培阶段的培养条件是温度25士2°C、光照时间12h/d，诱导阶段采用散射光，增殖、壮苗和生根阶段光照强度2000Ix。实施例2 本实施例2中的这种多花黄精组培快速繁殖方法，按如下步骤进行(1)培养基的配制培养基配方⑴诱导培养基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA;(II)带芽块根的增殖培养基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖60g/L ； (III)芽体部分增殖培养基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4-D+糖 60g/L ； (IV)块根部分增殖壮苗培养基 MS+1. Omg/ L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/L+ 糖 60g/L ； (V) ±夬根部分生根培养基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上I-V号培养基pH均介于5. 6-5. 7之间。(2)外植体的选取、预处理和消毒材料选取来年的9、10月份，于晴天选取多花黄精带芽的块根，将其清洗干净后，置于1/700浓度的甲基托布津中浸泡30min，取出，置于常温条件，晾干，之后用常规的技术对带芽的块根进行消毒，最后用无菌滤纸将无菌水吸干备用。(3)多花黄精带芽的块根诱导培养将以消毒处理过的带芽的块根用解剖刀剖去块根部分表层，只留主芽加0.8-1. 2cm3的块根，接入(I)号诱导培养基上进行诱导培养， 40-50天后，诱导出新的幼芽，块根部分膨大；(4)多花黄精已诱导出新芽的块根的增殖培养(a)将已诱导出新芽的块根转接 (II)号增殖培养基进行增殖培养，30-40天后，块根部分膨大，新的芽体冒出。(b)将已增殖的带芽的块根切成块根部分和芽体部分，块根部分转接(II)号增殖培养基上，30-40天后， 再次膨大，新的芽体再次冒出。新的增殖带芽的块根部分循环(b)过程增殖培养3-6代即可进行已增殖块根部分的壮苗培养；(c)芽体部分转接(III)号芽体增殖培养基上，30-40 天后，芽体部分基部块根膨大，将膨大带芽的块根再次转接(II)号增殖培养基进行增殖培养，30-40天后，块根部分膨大，新的芽体冒出。(d)将已增殖的带芽的块根切成块根部分和带芽的芽体部分，块根部分转接(II)号增殖培养基上，30-40天后，再次膨大，新的芽体再次冒出。(e)新的增殖带芽的块根部分循环(d)过程增殖培养3-6代即可进行已增殖块根部分的壮苗培养。而新分离的芽体部分循环(c) (d) (e)过程培养3-6代，新的已增殖块根部分进行后续壮苗培养，新的芽体部分采用常规方法进行壮苗生根。(5)多花黄精已增殖分离的块根部分和芽体部分的壮苗培养将已循环增殖3-6 代的新膨大带芽的块根部分转接(IV)号培养基进行壮苗培养，30-40天后，块根再次膨大， 新的芽体冒出。(6)多花黄精块根部分的生根培养将经步骤( 壮苗的块根部分部分接种到(V) 号生根培养基上，20-30天后，块根部分基部长出根系即可进行组培苗的驯化和移栽。各组培阶段的培养条件是温度25士2C、光照时间12h/d，诱导阶段采用散射光， 增殖、壮苗和生根阶段光照强度2000Ix。本申请人研究发现用于诱导的多花黄精外植体由于长期处于地表下，其根茎外覆盖泥土，菌类滋生，若直接进行消毒诱导，可致组培过程中污染严重，因此外植体消毒前处理至关重要。同时，研究还发现多花黄精增殖试管苗的块根大小和质量是后期大田栽培的关键影响因子，因此在前人研究基础上，实验对多花黄精的增殖加以探讨，主要研究了培养基中多糖浓度和生长调节剂多效唑对多花黄精增殖的影响。多糖作为组织培养中碳源的重要供应物，在组织培养中充当着提供能源和稳定渗透压的作用，其在培养基中的添加浓度尤为重要。生长调节剂多效唑是80年代研制成功的三唑类植物生长调节剂，能够抑制内源赤霉素合成，具有延缓植物生长，抑制茎杆伸长，缩短节间、促进植物分蘖、促进花芽分化， 增加植物抗逆性能，提高产量等效果。其近几年在多种植物组织培养上有系列报道应用，席梦利等2000认为在非洲菊增殖培养基交替添加多效唑0和0. ang/L，可使芽体增殖系数高且增殖芽健壮。陈传红等2006认为在生姜试管苗扩繁培养基中，附加1. 5mg/L多效唑可使试管苗增殖与壮苗同步进行，大大提高移栽成活率，且在MS+8. 0-10. Omg/L多效唑的培养基中，生姜试管苗的种质保存期可延长至4-5个月。薛寒青2007，刘华夏2009报道在切花百合组培培养基中添加多效唑，可以促进切花百合组培的生殖生长，促进芽增殖、不定胚发生、花芽形成和球茎形成，增强百合抗逆性、提高原生质体耐冷性等。
权利要求
1.优质多花黄精试管苗快速繁殖方法，包括培养基的配制；繁殖方法的步骤为外植体的选取、预处理和消毒一诱导培养基培养一增殖培养基培养一增殖壮苗培养基培养一生根培养基培养；各组培阶段的培养条件是温度25士2°C、光照时间12h/d，诱导阶段采用散射光，增殖、壮苗和生根阶段光照强度2000IX ；其特征在于(一)培养基的配制各种培养基配方为(I)诱导培养基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；(II)带芽块根的增殖培养基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖 60g/L ；(III)芽体部分增殖培养基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4_D+糖 60g/L ;(IV)块根部分增殖壮苗培养基MS+1.Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+多效唑0_50mg/L+糖 60g/L ；(V)块根部分生根培养基MS+0.5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上I_V号培养基pH均介于5. 6-5. 7之间；(二)繁殖方法的步骤为①外植体的选取、预处理和消毒材料选取当年的9、10月份，于晴天选取多花黄精带芽的块根，将其清洗干净后，置于1/700浓度的甲基托布津中浸泡30min取出，置于常温条件晾干，之后用常规的消毒技术对带芽的块根进行消毒，最后用无菌滤纸将无菌水吸干备用；②诱导培养基培养将已消毒处理过的带芽的块根用解剖刀剖去块根部分表层，只留主芽加0.8-1. 2cm3的块根，接入(I)号诱导培养基上进行诱导培养，40-50天后，诱导出新的幼芽，块根部分膨大；③增殖培养基培养(a)、将已诱导出新芽的块根转接(II)号带芽块根的增殖培养基进行增殖培养，30-40 天后，块根部分膨大，新的芽体冒出；(b)、将已增殖的带芽的块根切成块根部分和芽体部分，块根部分转接(II)号带芽块根的增殖培养基上，30-40天后，再次膨大，新的芽体再次冒出；生长出的新的增殖带芽的块根，新的增殖带芽的块根重复循环本(b)分步骤上述过程增殖培养3-6代产生末代终产物带芽体的块根及中间产物分切下来的芽体，末代终产物带芽体的块根即可进入已增殖块根部分后续的增殖壮苗培养基培养步骤；(c)、将(b)分步骤中循环步骤切分下来的中间产物芽体部分转接(III)号芽体部分增殖培养基上，30-40天后，芽体部分基部块根膨大，而后再返回(b)分步骤与(c)分步骤上述过程进行3-6代复合循环增殖，最后产生末代终产物带芽体的块根；④增殖壮苗培养基培养将经过(b)分步骤循环及经过(b)(c)分步骤复合循环增殖培养产生的末代终产物带芽体块根的块根部分转接(IV)号块根部分增殖壮苗培养基进行壮苗培养，30-40天后，块根再次膨大，新的芽体冒出；⑤生根培养基培养将经步骤④壮苗的块根部分接种到(V)号块根部分生根培养基上，20-30天后，块根部分基部长出根系即可进行组培苗的驯化和移栽。
全文摘要
优质多花黄精试管苗快速繁殖方法，涉及植物组培技术，培养基配方为诱导培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；带芽块根的增殖培养基MS+10mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+糖60g/L；芽体部分增殖培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L 2，4-D+糖60g/L；块根部分增殖壮苗培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+多效唑0-50mg/L+糖60g/L；块根部分生根培养基MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5％活性炭；步骤为将已消毒处理过的带芽的块根剖去块根部分表层，诱导培养、增殖培养基培养后切成块根和芽体，块根转接增殖培养、循环增殖培养3-6代，芽体转接芽体部分增殖培养、进行3-6代复合循环增殖、末代终产物带芽的块根增殖壮苗培养、生根培养。快速繁殖规模化生产。
文档编号A01H4/00GK102550413SQ20111046108
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者叶榕妹, 周辉明, 尚伟, 林辉锋, 王雪凤, 贺佩珍 申请人:福建省三明市农业科学研究所