专利名称：甘草快繁苗培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种甘草快繁苗组织培养方法。
背景技术：
甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhizauralens Fisch.)、胀果甘草(G. inflata Bat)、光果甘草(G.glabraL.)的干燥根及根茎。现代药理研究表明，甘草具有抗溃疡、抗炎、抗过敏、镇咳祛痰等药理作用，是最常用的中药之一，历来就有“十方九草”之说，除药用价值外，甘草在食品、饮料、卷烟、化妆品等方面广泛应用。近年来，由于人们破坏性地对野生甘草采挖，使我国甘草资源遭到了严重破坏，为此国家对野生群丛进行保护，大力提倡人工种植甘草。但是由于甘草种子质地坚硬。种皮厚实，具有硬实性，阻碍了水分的吸收，种子在自然状态下播种，要埋在土里3 5年才能出芽，因此在播种前需进行人工处理。但甘草种子的野性很强，成苗率很低，在栽培条件很好的情况下，100粒有发芽率的种籽只有 15 20粒能长成苗，有75 80粒要死掉，也就是说100吨种籽只有150 20吨能长成苗，这就导致数十年来家种甘草只涨不落的原因，也凸显甘草种子的珍贵性，提高甘草种子的成苗率是未来甘草大田大面积栽培的关键技术之一。本方法利用甘草无菌苗对其快繁， 来真正的解决这一难题。但目前对甘草的快繁苗的研究还较少，本方法也为甘草快繁苗培养及其工厂化育苗提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘草快繁苗培养的方法。经过甘草无菌种子发芽培养、甘草无菌苗培养、甘草快繁苗的诱导和未生根的快繁苗生根培养等步骤，在含有蔗糖的 MS固体培养基上无菌、25士 1°C培养，其中快繁苗诱导和快繁苗生根的培养基中加入植物生长调节剂，MS固体培养灭菌前PH调为5. 9 6. 0。该方法快速可行，可以提供长势良好的甘草苗。工艺简单，成本低廉，重复性好。本发明提供的一种甘草快繁苗组织培养的方法包括的步骤1)甘草无菌种子发芽培养将甘草种子用自来水冲洗干净，并浸泡3小时，于超净工作台中用75%乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3 4次；把消过毒的甘草种子接种于固体培养基上，25士 1°C及避光条件下 3 4天发芽培养。所述的固体培养基为含有0. 8%琼脂、20 30g/L蔗糖的MS固体培养基，灭菌前PH调为5. 9 6. 0。2)甘草无菌苗培养将带芽种子接种于固体培养基上，在无菌、25士 1°C及光照条件下培养4-5周，苗高7 9cm，即可作为外植体材料。光照条件光照16h · d—1，光照强度 2500 30001x。所述的固体培养基为含有20 30g/L蔗糖和0. 8%琼脂的MS固体培养基，灭菌前PH调为5. 9 6. 0。3)甘草快繁苗的诱导将外植体切段(无菌苗的胚轴、带芽茎段)接种于MS固体培养基上，在无菌、25士 1°C及光照条件(光照16h · cf1，光照强度2500 30001x)下培养4 6周，多数外植体即可形成完整的快繁苗；所述的MS固体培养基含有1. 0 2. Omg/ L6-BA (植物生长调节剂)、0. 1 0. 5mg/L NAA (植物生长调节剂)、20 30g/L蔗糖、0. 05 % 活性炭，灭菌前pH调为5. 9 6. 0。4)未生根的快繁苗生根培养将已形成的快繁苗接种到准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、25士 1°C及光照条件(光照16h · cf1，光照强度2500 30001x)下培养2周左右，即可获得完整的组培快繁苗。所述的固体培养基为含有0. 5 0. 75mg/L NAA(植物生长调节剂)、20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭的MS固体培养基，灭菌前pH调为5. 9 6. 0。本发明利用组织培养方法培养甘草快繁苗，比培养细胞、毛状根培养更具有实际意义，其生长速率快，繁殖倍数高达6倍。并且其苗木生长稳定，同时又不受天灾等自然环境的影响。本发明具有工艺过程简单，诱导率高，重复性好，快繁苗增值倍数高等特点。
图1是本发明培养的甘草快繁苗图。
具体实施例方式实例1 一、用lmol/L的HCl和NaOH溶液，将IOOmL MS附加20g/L蔗糖的固体培养基调至pH 5.9，在1211、0.110^的压力下灭菌15分钟备用；将甘草种子(由北京时珍中药研究所提供)用自来水冲洗干净浸泡3小时，于超净工作台中用75%乙醇浸泡IOs后，用无菌水冲洗2 3遍，再用4% NaClO溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3 4次，备用。之后用灭过菌的镊子将种子接到事先准备好的培养基中，在无菌、25 士 1°C及避光条件下培养以诱导发芽，培养2天后肉眼可见芽的形成，3、4天后芽长0. 5cm左右。用lmol/L的HCl和 NaOH溶液，将装在250mL三角瓶中的70mL MS附加20g/L蔗糖的固体培养基调至pH 5. 9， 在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用。二、将发芽较好的种子，用事先灭菌的镊子接种于准备好的培养基(见步骤一) 中，在无菌、25 士 1°C，光照16h · cf1，光照强度2500 30001x，培养4周得到甘草无菌苗。 用lmol/L的HCl和NaOH溶液，将装在IOOmL三角瓶中的50mL MS附加20g/L蔗糖、2. Omg/ L6-BA、0. 5mg/L ΝΑΑ、0· 05%活性炭的固体培养基调至pH 5. 9，在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用。三、取生长良好的无菌苗，用事先灭菌的解剖刀和镊子在无菌的平皿中切无菌苗， 取其胚轴和带芽茎段，长度为Icm左右，接种于准备好的培养基(见步骤二)上，在无菌、 25士 1°C，光照16h · cT1，光照强度2500 30001x，培养40天得到甘草快繁苗，由胚轴生成的苗95%左右可以直接生根，带芽茎段可达70%左右。用lmol/L的HCl和NaOH溶液，将装在250mL三角瓶中的IOOmL MS附加20g/L蔗糖、0. 75mg/L NAA的固体培养基调至pH 5. 9， 在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用；四、对于未生根的快繁苗，用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出，接种于事先准备好的培养基(见步骤三)中，无菌、25 士 1°C，光照leh.cT1，光照强度2500 30001X条件下培养，一般IOd后肉眼可以看到有根从茎基部生出，两周后根系长到Icm左右，30d后，根系可以长到2 3cm，根粗壮，侧根发达(如图1)。生根率可达90%以上。直接生根的快繁苗及诱导生根的快繁苗均可驯化移栽。实例2:一、用lmol/L的HCl和NaOH溶液，将IOOmL MS附加30g/L蔗糖的固体培养基调至pH 6.0，在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用；将甘草种子(购自北京时珍中药研究所)用自来水冲洗干净浸泡3小时，于超净工作台中将浸泡后的种子用75%的乙醇浸泡10s，用无菌水冲洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3 4 次，备用。用灭过菌的镊子将种子接到MS固体培养基中，在无菌、25士 1°C及避光条件下培养，诱导发芽，培养2后肉眼可见芽的形成，3、4天后芽长0. 5cm左右。用lmol/L的HCl和 NaOH溶液，将装在250mL三角瓶中的70mL MS附加30g/L蔗糖的固体培养基调至pH 6. 0， 在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用。二、将发芽较好的种子，用灭菌的镊子接种于准备好的培养基(见步骤一)中，在无菌、25士 TC，光照16h · cf1，光照强度2500 30001x，培养4周即得到甘草无菌苗。用 lmol/L的HCl和NaOH溶液，将装在IOOmL三角瓶中的50mL MS附加30g/L蔗糖、1. Omg/ L6-BA、0. lmg/L ΝΑΑ、0· 05%的活性炭的固体培养基调至pH 6. 0。在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用。三、选择生长良好的无菌苗，用事先灭菌的解剖刀和镊子在无菌的平皿中切无菌苗，取其胚轴和带芽茎段，长度为Icm左右，接种于准备好的培养基(见步骤二)上，在无菌、25士 1°C，光照IMi .(Γ1，光照强度2500 30001χ，培养40天得到甘草快繁苗，由胚轴生成的苗95%左右可以直接生根，带芽茎段可达70%左右。用lmol/L的HCl和NaOH溶液，将装在250mL三角瓶中的IOOmL MS附加0. 5mg/L NAA、30g/L蔗糖的固体培养基调至pH6. 0， 在121°C、0. IMPa的压力下灭菌15分钟备用。四、选取未生根的快繁苗，用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出，接种于事先准备好的培养基(见步骤三)中，无菌25 士 TC，光照leh.cT1，光照强度2500 30001X条件下培养，一般IOd后肉眼可以看到有根从茎基部生出，两周后根系长到Icm左右，30d后，根系可以长到2 3cm，根粗壮，侧根发达。生根率可达90%以上。直接生根的快繁苗及诱导生根的快繁苗均可驯化移栽。
权利要求
1.一种甘草快繁苗的组织培养方法，其特征在于包括的步骤1)甘草无菌种子发芽培养将甘草种子用自来水冲洗干净，并浸泡3小时，于超净工作台中用75%乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3 4次；把消过毒的甘草种子接种于固体培养基上，25士 1°C及避光条件下3 4天发芽培养；本步骤中所述的固体培养基为含有0. 8%琼脂、20 30g/L蔗糖的MS固体培养基，灭菌前PH调为5. 9 6. 0 ；2)甘草无菌苗培养将带芽种子接种于MS固体培养基上，在无菌、25士1°C及光照条件下培养4-5周；本步骤中所述的MS固体培养基为含有20 30g/L蔗糖和0. 8%琼脂的MS 固体培养基，灭菌前pH调为5. 9 6. 0 ；3)甘草快繁苗的诱导将外植体切段接种于MS固体培养基上，在无菌、25士1°C及光照条件下培养4 6周；本步骤中所述的MS固体培养基含有1. 0 2. 0mg/L6-BA、0. 1 0. 5mg/LNAA、20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭，灭菌前pH调为5. 9 6. 0 ；4)未生根的快繁苗生根培养将已形成的快繁苗接种到固体培养基上，在无菌、 25士 1°C及光照条件下培养2周左右，即可获得完整的组培快繁苗；本步骤中所述的固体培养基为含有0. 5 0. 75mg/L NAA,20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭的MS固体培养基，灭菌前pH调为5. 9 6. 0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的光照条件为光照1 · cf1，光照强度 2500 30001x。
全文摘要
本发明涉及一种甘草快繁苗组织培养方法。它经过甘草无菌种子发芽培养、甘草无菌苗培养、甘草快繁苗的诱导和未生根的快繁苗生根培养步骤，在含有20～30g/L蔗糖的MS固体培养基上无菌、25±1℃培养，其中快繁苗诱导和快繁苗生根的培养基中加入植物生长调节剂，所述的MS固体培养灭菌前pH调为5.9～6.0；本发明利用组织培养方法培养甘草快繁苗，比培养细胞、毛状根培养更具有实际意义，其生长速率快，繁殖倍数高达6倍。并且其苗木生长稳定，同时又不受天灾等自然环境的影响，并具有工艺过程简单，诱导率高，重复性好，快繁苗增值倍数高等特点。
文档编号A01H4/00GK102499072SQ20111012894
公开日2012年6月20日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者吕连媛, 左北梅, 张黎明, 王娟, 高文远 申请人:天津大学