专利名称：一种五爪龙的快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，涉及植物组织培养技术，具体地说是一种五爪龙的组织培养方法。
背景技术：
植物是药物的天然宝库，人们利用药用植物的历史源远流长，全世界约有75%的人口以植物作为治疗预防疾病的药物来源(邢建民，2001)。人类已经从植物中发现了许多具有高度生理活性的药物，目前从植物来源的药物占药物总量的25%以上(郑光植， 1987)。我国的传统中草药已有数千年的历史，至今仍在我国和许多国家和地区广为使用。 但由于传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝。同时随着自然生态环境的日益破坏，也进一步导致药用植物资源的匮乏。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法，植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。我国自1964年罗士韦教授首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果以来，许多科学家先后从事了多种药用植物的组织培养研究。至今，我国药用植物的组织培养研究迅速发展。目前，世界各国对植物的药用开发和研究都十分重视，就以美国来说，其成药中有 47%是以植物为原料制成的(谢启昆，1986)。为了解决药用植物的供需矛盾，人们采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有不少名贵药材等生产周期较长，如人参、黄连，如果以常规方法育种或育苗，需要花费很长的时间；另有一些药用植物如贝母、 番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致育种速度很慢，生产成本增加。利用植物的有性繁殖方式对其有效成分含量波动比较大，所以利用植物组织培养技术解决药用植物的植株再生与繁殖问题迫在眉睫。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物至少有200种，如云南黑节草、延龄草、高山红景天、莪术、水母雪莲、星花绣线菊、溪黄草、玉叶金花、辽东榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如红豆杉、艾、黄杨、大戟属植物、长春花、米仔兰、狗牙花和香榧等。五爪龙,又名土五加皮、土黄苗,属于桑科。灌木或小乔木,高2-8m.全株有乳汁； 嫩技中空，枝、叶、叶柄和花序托(榕果)均被金黄色广展的长硬毛。单叶互生；叶柄粗壮，长 2-7cm;托叶卵状被针形，长l-3cm，膜质，红色，被柔毛；叶片多型，卵状椭圆形、长圆状被针形或倒卵状被针形，长8-25cm，宽4-18cm，先端渐尖或短尖，基部狭，浑圆形或心形，边缘有锯齿，全线或3-5深裂，叶表面粗糙，疏生短硬毛，下面除金黄色长硬毛外，有时密生柔毛， 基生脉3-7条，侧脉5-7对。隐头花序成对腋生或生于已落叶枝的叶腋，呈球形或椭圆球形， 无柄或近无柄，直径8-20_，幼时顶部苞片形成脐状突起，基生苞片卵状披外形，长l-3cm， 红色，被长硬毛；雄花、瘿花生于同一花序托中，雄花着生近口部，有梗，花被片4，雄蕊2-3 ； 瘿花花被片与雄花同数，子房球形，花柱短，侧生；雌花生于另一植株花序托中，球形，花被片4，有梗或无梗。瘦果，表面有小瘤体，花柱侧生，柱头棒状。花、果期3-11月。主要是其根入药，根中含有机酸、氨基酸、三萜、香豆精、生物碱等，主要用于祛风除湿；祛瘀消肿。主风湿痿痹；腰腿痛；痢疾；水肿；带下；瘰疬；跌打损伤；经闭；乳少。因此，为了满足日益增大的药用需求，种子收获量小，种子繁殖出苗率极低，种子培育过程烦琐，生长速度慢，入药部分主要是根茎，对野生五爪龙破坏严重，同时也为了保护五爪龙的野生资源，利用组培快繁技术，实现人工栽培是最好的解决方法。迄今为止，在国内外尚未见关于五爪龙组织培养快繁成功的报道。我们通过大量试验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了五爪龙的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为实现工业化人工栽培五爪龙提供可能。五爪龙的组培快繁技术方法的成功建立，可以为大规模人工栽培药用植物五爪龙提供种苗，为现代科技农业提供了一种切实可行的开发项目。
发明内容
本发明的目的是提供五爪龙的快速繁殖方法，该方法非常适合工业化生产，配方效果佳，出芽率高，培养时间短，植株生长旺盛，可操作性强，应用价值高等优点。具有投入少，产出高的特点。本发明所述五爪龙的快速繁殖方法，其具体操作步骤如下I)外植体的选取与灭菌选用五爪龙的茎段作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用；2)芽体的萌发将灭菌处理后的茎段接种在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照12小时，光照强度1000LX，接种后6_8天茎段腋芽的萌发，10天左右形成带叶的小苗；3)丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27 °C，每天光照16小时，光照强度 1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上；4)生根培养选择 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作为生根培养基， pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株；5)试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土或富养土中，注意保水保温保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上；在一个具体实施方案中，步骤I中采用O. I %升汞进行消毒，消毒时间控制优选在 7-15分钟。技术效果(I)利用五爪龙带芽根茎段为外植体，使得外植体取材较容易，一年四季均可取材，而且数量多，采用茎段做外植体，保证了遗传稳定性，同时克服了组织培养中，愈伤组织在分化培养基上随着芽的分化而逐渐停止生长，失去增殖能力的弱点，可防止伤组织继代培养过程中，随着培养代数的增加，分化出来的苗出现变异的现象。(2)本发明方法利用外植体建立，增殖生根同步化这一技术路线，仅需30天左右形成完整植株，4-6个月内事获得大量完整植株，实现五爪龙的大规模工厂化育苗。(3)本发明方法获得的试管苗在移载时所采用的基质利用沙土，方法简单，而且大大降低了移载成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，生产成本低，可批量生产，应用价值高。(4)五爪龙的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制五爪龙的质量。增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂
化生产。(5)使用本发明提供的组培快繁技术得到的五爪龙幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的五爪龙成品。(6)可以保存五爪龙的种质资源，同时有利于保护五爪龙野生资源，减少对自然资源的破坏。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例I :取材五爪龙带腋芽茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南张家界的五爪龙鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理 10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照12小时，光照强度1000LX ;接种后6_8天芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度 1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作为生根培养基， pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土中，注意保水保温保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用两层遮阳网进行覆盖，并采用滴管方式进行补水，进入11月份后用地膜进行保温保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式进行五爪龙栽培管理。若发生黑斑病，用70%甲基托布津湿性粉剂1000倍液喷洒。有时有根结线虫病危害，用3%呋喃丹颗粒剂灌施盆土。若缺肥时在花后至8月中旬施 I次磷肥。实施例2:取材五爪龙带芽根茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南张家界的五爪龙鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理 10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 3mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX ;接种后7_8天芽体的萌发，12天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度 1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作为生根培养基， pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到富养土中，注意保水保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用两层遮阳网进行覆盖，并采用滴管方式进行补水，进入11月份后用地膜进行保温保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式进行五爪龙栽培管理。若发生黑斑病，用70%甲基托布津湿性粉剂1000倍液喷洒。有时有根结线虫病危害，用3%呋喃丹颗粒剂灌施盆土。若缺肥时在花后至8月中旬施 I次磷肥。实施例3 取材五爪龙带芽根茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南张家界的五爪龙鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理 10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX ;接种后6_8天左右芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度 1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择LS+6-BA0. 5mg/L+NAA O. 5mg/L作为生根培养基，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到95%以上，只需要20天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土中，注意保水保湿，移载I个月后，移载成活率达到85%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用两层遮阳网进行覆盖，并采用滴管方式进行补水，进入11月份后用地膜进行保温保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式进行五爪龙栽培管理。若发生黑斑病，用70%甲基托布津湿性粉剂1000倍液喷洒。有时有根结线虫病危害，用3%呋喃丹颗粒剂灌施盆土。若缺肥时在花后至8月中旬施 I次磷肥。
权利要求
1.一种五爪龙的快速繁殖方法，其具体步骤如下1)外植体的选取与灭菌选用五爪龙的假鳞茎上芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. 1%的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用；2)芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在LS+6-BA1.2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上， pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照12小时，光照强度1000LX，接种后6_8天芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗；3)丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于LS+6-BA0.5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX， 30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上；4)生根培养选择LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L 作为生根培养基，pH 值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上，只需要25天左右形成完整植株；5)试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净， 移载到沙土或富养土中，注意保水保温保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上；6)后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用两层遮阳网进行覆盖，并采用滴管方式进行补水，进入11月份后用地膜进行保温保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式进行五爪龙栽培管理；若发生黑斑病，用70%甲基托布津湿性粉剂1000倍液喷洒；若发生根结线虫病危害，用3%呋喃丹颗粒剂灌施盆土 ；若缺肥时在花后至8月中旬施I次磷肥。
2.权利要求I的方法，其中步骤I中采用O.I %升汞进行消毒，消毒时间控制优选在 7-15分钟。
3.权利要求2的方法，其中步骤6中大田湿度控制在40-70%;温度控制在10-30°C。
全文摘要
本发明公开了一种五爪龙的快速繁殖方法。该方法是在LS培养基上培养五爪龙的茎段等组织，确切取带1-2个腋芽的茎段为外植体，消毒后，接种在LS+6-BA1.2mg/L+NAA0.2mg/L培养基中培养，接种后6-8天左右芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗，将小苗切下转接于LS+6-BA0.5mg/L+IAA0.4mg/L培养基上，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。选择LS+6-BA0.5mg/L+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg／L作为生根培养基，生根率达到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。试管苗移载到沙土中，注意保水保湿，移载1个月后，移载成活率达到90%以上，建立了一套高频稳定再生体系。本发明方法具有稳定好，操作简便，繁殖速度快，生产成本低，达到产业化水平等优点。
文档编号A01H4/00GK102599065SQ20121010664
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者覃静萍 申请人:董爱文