专利名称：菌群及瓶插法在白木香树上生产沉香的制作方法
技术领域：
本发明技术领域是在人工种植的白木香树中，涉及ー种在白木香树Aquilariasinensis (Lour. )Gilg上人工生产沉香的结香菌群制剂，以及与之配套使用的瓶插法。
背景技术：
国产沉香为瑞香科沉香属植物白木香上含有黑色树脂的病变木材，可通过自然结香或人工结香等方式产生。在我国，白木香是我国生产沉香的唯一植物资源，为我国特有的珍贵药用植物。国产沉香自古以来不仅是一种名贵的香料，亦是ー种名贵的药材。作为ー种传统中药，沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘之功效，主治气逆喘息、呕吐、呃逆、心腹疼痛、大肠虚闭、腰膝虚冷等症。随着沉香药用及保健品用量大幅増加，近几年来市场对沉香产品的需求呈供不应求的趋势。目前国内市场上好的沉香价格已超过5000元/公斤，天然的沉香产品在国内外市场已十分紧缺。 在自然界的白木香树中，只有极少数的个体会自然产生沉香树脂，通常的观点是受到外伤(例如鼠虫咬伤、真菌侵蚀、台风击断、人工砍伐等)之后，白木香树出于自身的愈伤保护机制，会分泌出特殊的树脂来保护自己。通过外伤和侵蚀等偶然因素导致ー些外部物质介入白木香树的新陈代谢过程，致使白木香树芯或木质部发生了非正常的酶转化，从而产生了沉香树脂。目前的人工诱导结香技术，基本上都是基于上述机制或理论。因此为了充分利用和提高现有沉香种植、生产及加工的经济效益，促进沉香的产业化发展，保护沉香野生资源和缓解市场的供需矛盾，本发明在现有人エ结香技术的基础上，根据种植户及产业化发展的需求，遵循白木香树自然产香的自然规律和形成机理，总结前人各种的技术方法及存在的不足，在实践中逐渐摸索并试验出独创的结香生物菌群制剂以及瓶插法，从而形成在白木香树上生产沉香新的技术和方法。
发明内容
针对人们对采用化学或激素类结香剂引起的药用安全性质疑，或仅利用単一诱导菌株结香的局限性，致使在结香中不稳定或白木比例浪费太大，加之许多科研单位在沉香结香的研究中，又往往忽视了重要的产香率及应用生产的量化指标，这些问题一直制约了我国人工沉香技术开发的规模化及产业化发展，为此木发明对现有结香菌的使用方法进行了充实和创新，做了更科学和更实用的创新改迸，这种改进其实是遵循天然沉香的形成机理，采自天然沉香中多祥性的内生真菌，经提取、筛选、纯化、组合培养成结香诱导菌群制齐U，筛选那些具有结香能力的优势菌株，经优化组合为生产沉香的生物菌群，激活菌群之间的良性共生关系和优势互补，通过独特的瓶插法自动渗液于白木香木质部，充分促进白木香的自我愈伤保护机制在非正常的新陈代谢中泌脂结香。对现有配套的输液方法也作了更实用的改进，形成在白木香树上输送菌剂的“瓶插法”。本发明所述采用以下几种技术方案；
①ー种采用沉香内生菌群的方法；用于沉香结香的诱导菌群，均来源于白木香树中多种沉香内生真菌，国内外研究表明这些沉香内生真菌具有天然促进白木香树结香的特殊功能，利用这种特性，从正在生长中的野生沉香组织内提取和分离出优势沉香内生菌，经分子生物学种属鉴定，沉香内生真菌中目前发现有70多种，所述的保护范围不限于以下8种沉香优势结香真菌；有色ニ抱菌(Diplodia sp·),可球ニ抱菌(Botryodiplodiatheobromae),木霉(Trichoderma sp),黄绿墨耳(Melanotus fIavolivens)，蒂腐色ニ抱(Botryosphaeria rhodina),红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)，祿ノ^Γ_ノ禹(fusarium)杖丁贝抱ノ禹、acreonium)。上述沉香内生真菌的筛选实验中，先后通过苄基丙酮耐受性筛选、人工结香样品变色部分的宽度和燃烧香味筛选，最后筛选出具有能够促进白木香树结香的8株优势沉香内生真菌，这些菌株经分别消毒、提纯、培养出原种，再继代培养和优化组合，最后通过集中深层发酵液体菌群制剂；在广东信宜市镇隆沉香种植基地和广西北流市清湾镇龙南种植园 等地结香实验表明；采用这些沉香诱导菌群制剂，并经独创的瓶插法作用于白木香树木质部内，使具有高活性的液体菌群制剂大面积浸入、染色并促进白木香木质部的感染和结香。②结香菌群培养基的制备所述菌群的培养基特征是；将白木香锯末200克，去皮马铃薯200克，切成小块，カロ水1000ml,煮沸30min,滤去白木香锯末和马铃薯块,将滤液补足至1000ml,加鹿糖20g,、琼脂15g、葡萄糖10g、硫酸镁I. Og、磷酸ニ氢钾2，Og、磷酸氢ニ钾2，Og,融化后分装，调pH至5. 5，高温高压灭菌I. 5小时，冷却至常温备用。③瓶插法利用废弃的饮料瓶，在瓶的盖边钻ー个直径O. 2厘米的小孔，与孔相通连接上一个锥形塑料插管，设计长10厘米，直径O. 5至O. 8厘米的锥形插头，与瓶盖连接的锥形插管可直接插入白木香树钻孔内自动渗液，或按此创新方法设计并委托批量制作这种锥形瓶盖，可大量应用于结香的规模化生产(详见说明书附图)。本发明的生物菌群制剂和瓶插法，通过人工批量感染健康白木香树的愈伤组织，诱导原生木质组织的微循环系统在非正常的新陈代谢中泌脂结香。经过6- 12个月的积累可逐渐形成综褐色油状物和黄综色的沉香木，此时割取钻孔以上形成的综褐色油状物或黄综色沉香木，用刀除去不含树脂的木质部经晒干后即为沉香。用传统的沉香鉴定法；直接用火烧即可闻到浓烈的沉香香味。
；瓶插法装置的结构示意图；其中I、瓶盖式锥形插管；2、饮料瓶；3、瓶插钻孔；4、白木香树。
具体实施例方式①以下所述是提取筛选的9种沉香内生菌株；通过苄基丙酮耐受性、人工结香材料分析等方法筛选出以下8株内生真菌具有促进和诱导白木香产香的作用；有色ニ孢菌(Diplodia sp.),可球ニ孢菌(Botryodiplodiatheobromae),木霉(Trichoderma sp),黄绿墨耳(MelanotusfIavolivens),蒂腐色 ニ 抱(Botryosphaeria rhodina),红褐肉座菌(Hypocreajecorina)，祿ノ]— 困(fusarium)杖丁贝抱ノ禹、acreonium)。
②液体菌群培养基配方及制作；上述8种菌株分别经提取、筛选、消毒、提纯、培养出原种，再优化组合继代培养；其菌群制剂的培养基的配方组成；将白木香锯末200克，去皮马铃薯切成小块200克，加水1000ml,煮沸30min,滤去白木香锯末和马铃薯块,将滤液补足至1000ml,加鹿糖20g,、琼脂15g、葡萄糖10g、硫酸镁I. Og、磷酸ニ氢钾2，Og、磷酸氢ニ钾2，Og,融化后分装，调pH至4. 5，高温高压灭菌I. 5小时，冷却至常温，将22种沉香内生菌群的菌丝体分别接种于该液体培养基中，置往复式摇床上振荡培养，摇床室温控制在28°C 30°C，液体菌群培养时间5天。成为液体菌种原液，扩大的液体菌种的培养仍用上述液体培养基，需将上述液体培养基各成分相应扩大十倍，加入液体菌种原液500ml，经发酵罐深层发酵5天后，即可作为生物菌群制剂与瓶插法的配套生产使用。③瓶插法
ー种利用瓶插的渗液法；其特征需先对白木香树进行钻孔，钻孔直径O. 6至O. 9厘米，钻头上下呈45度角，深度至树内木质部1/2处，以备瓶插法插入使用。瓶插法的组成是；可利用有利环保的各种废弃饮料瓶，在瓶盖中央钻ー个直径O. 5厘米的小孔，与孔相通焊接上一个锥形塑料插管，头尖后粗，长8-10厘米，直径O. 5至
O.8厘米的锥形插头，可将菌剂注入饮料瓶后加盖这种锥形管盖，与瓶盖一体连接的锥形插头可直接插入白木香树预置的钻孔内能自动渗液。或按此方法专业优化设计不同的规格，并委托厂家批量制作这种塑料的锥形插管瓶盖，配套利用大量的废弃饮料瓶，应用于各地沉香种植园规模化及产业化的人工结香工具(基本构造详见说明书附图)。沉香的采收与鉴别菌群制剂通过“瓶插法”作用白木香树并感染后，经过6-12个月的积累可逐渐形成黄综色或深褐色油状物的木质部，割取创孔以上形成的黄综色或深褐色油状物沉香木，用刀除去不含树脂的白木经晒干后即得沉香。经传统的沉香鉴定；直接用火烧即可闻到浓烈的沉香香味。用こ醚提取菌群瓶插法半年及一年结香的沉香挥发油组分，通过气相色谱、质谱联用(GC-MS)技术对其进行分析和鉴定。结果两批沉香样品均主要由倍半萜、芳香族化合物和脂肪酸等组成，而未经处理的健康白木香则以脂肪酸和烷烃类成分为主，瓶插法处理仅半年得到的沉香在挥发油成分上与野生沉香基本一致，含有天然沉香特征性成分白木香醛及马兜铃烯、α -绿叶烯、缬草醛、绒白乳菇醛等倍半萜类化合物，充分表明本发明所述的结香菌群制剂和瓶插法，在目前白木香树人工促进结香的技术领域，具有明显的优势和创新点。
权利要求
1.一种利用生物菌群在白木香树上生产沉香的方法，其方法特征是在白木香树上，利用真菌在一种以上至几十种以上经组合培养的菌群制剂以用于人工生产沉香，以及在沉香诱导、结香、生产及宣传等方面被称为结(产)香菌群或产品名称的均在此保护范围内。
2.筛选优势结香菌群；经优化组合的真菌有；有色二孢菌(Diplodiasp.)，可球二抱菌(Botryodiplodiatheobromae),木霉(Trichoderma sp),黄绿墨耳(Melanotusflavolivens),蒂腐色二抱(Botryosphaeria rhodina),红褐肉座菌(Hypocreajecorina),镰刀菌属(fusarium)枝顶孢霉属(acreonium)。权利特征不限于上述8株真菌，包括其它的沉香结香菌株组成的沉香生产菌群。
3.结香菌群液体培养基配方；其特征是将白木香锯末200克，去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000ml,煮沸30min,滤去白木香锯末和马铃薯块,将滤液补足至1000ml,加鹿糖.20g,、琼脂15g、葡萄糖10g、硫酸镁I. Og、磷酸二氢钾2，Og、磷酸氢二钾2，Og。
4.一种利用瓶插法；其特征需先对白木香树进行钻孔，钻孔直径0.6至0.9厘米，钻头上下呈45度角，深度至树内木质部1/2处，以备瓶插法插入使用。
瓶插法的组成是；可利用废弃有利环保的各种饮料瓶，在瓶盖中央钻一个直径0. 5厘米的小孔，与孔相通焊接上一个锥形塑料插管，头尖后粗，长8-10厘米，直径0. 5至0. 8厘米的锥形插头，可将菌剂注入饮料瓶后加盖这种锥形管盖，与瓶盖一体连接的锥形插头可直接插入白木香树预置的钻孔内能自动渗液。或按此方法专业优化设计不同的规格，并委托厂家批量制作这种塑料的锥形插管瓶盖，以大量应用于沉香种植园规模化和产业化的人工结香(详见说明书附图)。
全文摘要
本发明领域是在人工种植的白木香树中，涉及一种生产沉香的微生物菌群制剂和配套使用的瓶插法。从天然沉香组织内提取和分离出；有色二孢菌等8株沉香内生菌株，经分别消毒、提纯、培养出具有结香能力的液体菌群制剂联合作用于自木香树。同时对现有配套的输液方法改进为瓶插法，本发明的独创的瓶插法改革了现有方法对成套输液器械的依赖以及对滴液快慢需不断观察调整的弊端。所述方法可人工批量将菌剂浸入健康白木香树的愈伤组织并渗透感染原生木质，促进木质内微循环系统在非正常的新陈代谢机制中泌脂结香。
文档编号A01N63/04GK102696690SQ20121019758
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者唐显 申请人:唐显