专利名称：一种增强基因表达的ubi1内含子序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种增强基因表达的ubil内含子序列。本发明还涉及该ubil 内含子的应用。
背景技术：
大多数真核基因都被一个或多个内含子所间隔，这些间隔序列可以转录成pre-mRNA，这些转录本只有在细胞核中经剪接复合体的作用去除内含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿过核孔转移到细胞质中进行翻译。真核pre-mRNA的剪接是一个在细胞核中完成的、严格保守的化学反应，该过程包括剪接体识别外显子-内含子连接区段，通过两步转酯反应切除内含子并使相邻的外显子连接。内含子虽然是基因中只被转录而不被翻译的序列，但越来越多的研究发现，内含子并不是基因上的一段冗余序列，相反，内含子在基因表达方面起着重要的调控作用。这种由内含子介导的使基因表达活性增强的效应叫做内含子增强效应(intron-mediatedenhancement, IME) (Callis et al. ,Genes Development, 1987,1:1183-1200)。真核 mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。单子叶植物的内含子增强效应高于双子叶植物，双子叶植物内含子增强效应一般在 2-5 倍，而单子叶植物可达 10-100 倍(Simpson 和 Filipowicz, Plant Mol. Biol.，1996，32 :1-41)。双子叶植物内含子可以提高单子叶植物基因的表达，而由于单子叶植物内含子与外显子AU的平均含量为59%和44%，双子叶植物的分别为74%和55%，高AU含量可以使内含子更易形成茎环结构从而有利于剪接，因此，单子叶植物内含子通常不会提高双子叶植物基因的表达(Vain et al.，Plant cell R印，1996，15:489-494)。Ueki 等将 PLD、Cat 和Ubi (玉米ubiquitin第一个内含子)内含子与不同启动子连接,分别转化玉米和烟草的原生质体，验证各个载体表达特点，结果发现，含有内含子载体的报告基因表达水平在玉米原生质体中普遍高于同样载体的烟草原生质体的表达水平，内含子载体增强效应与启动子、内含子和报告基因等紧密相关(Ueki et al.，Plant Biotech, 2004, 21 (I) :15_24)。泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的由76个氨基酸残基组成的高度保守的蛋白质。1992年，Christensen等从玉米中克隆出了编码泛素蛋白的Ubi-I和Ubi-2基因，并准确定位了 Ubi-I的启动子、转录起始位点、5’侧翼序列处的0. 9kb转录调控区和完整的5’非编码区，并构建pUBI-CAT载体，在玉米和其它单子叶植物的原生质体中进行验证，发现Ubi-I启动子比CaMV35S具有更高的增强基因表达的效应(Christensen etal.,Plant Mol Biol，1992，18 :675-689)。Vain等通过比较发现，ubil内含子与侧翼外显子的41nt所构建的载体(p35Subi⑶S)在玉米悬浮细胞中的增强效应高于其它载体，增强效应可提高71倍(Vainet al. ,Plant cell R印，1996，15 :489_494)。王悦冰比较了玉米泛素蛋白基因的第一内含子(ubil)、水稻肌动蛋白基因的第一内含子(actl)、玉米乙醇脱氢酶基因的第一内含子(adhl)和马铃薯高赖氨酸基因SBgLR基因的第二内含子(SBgLR2)对基因表达的增强作用，结果发现Ubil增强报告基因的表达能力最强；尽管已知并不是内含子中所有序列为提高基因表达所必需，但尚未见到有关通过缺失分析对Ubil内含子改造研究的报道。
发明内容
本发明的目的是对来源于玉米 泛素蛋白基因ubil内含子进行缺失分析，提供一种可以增强基因表达的内含子，通过构建该改造的泛素蛋白内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。本发明通过如下工作达到了上述发明目的I、内含子缺失载体的构建策略本发明以ubiquitin基因第一内含子序列(SEQ ID N0:1)为目标序列。在此序列中，有下划线部分表示缺失备选位点。SEQ ID NO: II GTACGCCGCT CGTCCTCCCC CCCCCCCCCT CTCTACCTTC TCTAGATCGG CGTTCCGGTC61 CATGGTTAGG GCCCGGTAGT TCTACTTCTG TTCATGTTTG TGTTAGATCC GTGTTTGTGT121TAGATCCGTG CTGCTAGCGT TCGTACACGG ATGCGACCTG TACGTCAGAC ACGTTCTGAT181TGCTAACTTG CCAGTGTTTC TCTTTGGGGA ATCCTGGGAT GGCTCTAGCC GTTCCGCAGA241CGGGATCGAT TTCATGATTT TTTTTGTTTC GTTGCATAGG GTTTGGTTTG CCCTTTTCCT301TTATTTCAAT ATATGCCGTG CACTTGTTTG TCGGGTCATC TTTTCATGCT TTTTTTTGTC361TTGGTTGTGA TGATGTGGTC TGGTTGGGCG GTCGTTCTAG ATCGGAGTAG AATTAATTCT421GTTTCAAACT ACCTGGTGGA TTTATTAATT TTGGATCTGT ATGTGTGTGC CATACATATT481CATAGTTACG AATTGAAGAT GATGGATGGA AATATCGATC TAGGATAGGT ATACATGTTG541ATGCGGGTTT TACTGATGCA TATACAGAGA TGCTTTTTGT TCGCTTGGTT GTGATGATGT601 GGTGTGGTTG GGCGGTCGTT CATTCGTTCT AGATCGGAGT AGAATACTGT TTCAAACTAC661 CTGGTGTATT TATTAATTTT GGAACTGTAT GTGTGTGTCA TACATCTTCA TAGTTACGAG721 TTTAAGATGG ATGGAAATAT CGATCTAGGA TAGGTATACA TGTTGATGTG GGTTTTACTG781 ATGCATATAC ATGATGGCAT ATGCAGCATC TATTCATATG CTCTAACCTT GAGTACCTAT841 CTATTATAAT AAACAAGTAT GTTTTATAAT TATTTTGATC TTGATATACT TGGATGATGG901 CATATGCAGC AGCTATATGT GGATTTTTTT AGCCCTGCCT TCATACGCTA TTTATTTGCT961 TGGTACTGTT TCTTTTGTCG ATGCTCACCC TGTTGTTTGG TGTTACTTCT GCAG采用以下方法对上述序列进行改造首先，米用来自 “http: //korf lab, ucdavis. edu/CRi-bin/web-imeter. pi，，的应用检索软件对玉米ubil序列(1014bp)进行IME (intron-mediated enhancement)基序检索，并得到内含子的得分值。由于该软件所得的内含子分析数据来源于拟南芥和水稻基因组的序列信息，只针对拟南芥和水稻。考虑到玉米和水稻同属于单子叶植物，所以本发明选用水稻物种的信息，通过生物信息学分析获得内含子增强基因表达的初级信息。其次，根据内含子左右边界序列特点(5’迎……M3’)，保证边界序列不被破坏从而可以正确剪接，依据GT、AG位置筛选缺失序列。在选择位置时，固定一端位置不变，从另一端选择待缺失位点，以此获得单一末端缺失序列。5’端GT序列待选位置52，96，110，143,231,281 (SEQ ID NO: I 划线处)，3’ 端 AG 序列备选位置639，713，748，806，857 (SEQID NO: I划线处)，同时分析缺失片段的AT含量及获得的内含子序列分值。结果如表I和表2。表中“得分”为所得的内含子分值，分值越高，意味着增强基因表达的能力越强；“AT含量”表示在SEQ ID NOl中A碱基和T碱基的个数占总碱基个数的百分比。表Iubil内含子3’末端缺失序列分析
权利要求
1.一种可以提闻基因表达的内含子序列，其特征是具有SEQ ID NO :2所不的核昔酸序列。
2.权利要求I所述的内含子序列在培育转基因植物中的应用。
3.一种提高ubil内含子增强基因表达水平的方法，其特征是对ubil内含子进行特定位置的缺失。
4.权利要求3所述的方法，所述内含子是泛素蛋白内含子，所述缺失是将SEQID NOI中l_142bp进行缺失。
5.一种植物表达载体，其特征是含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
6.权利要求5所述的载体在培育转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明对来源于玉米ubiquitin第一内含子进行缺失分析，获得了可以增强外源基因表达的新型内含子序列，该内含子序列长为872bp，AT含量为61.0%，可以提高基因表达13倍，与全长的ubiquitin第一内含子相比，提高外源基因表达能力增加30%。本发明获得的内含子可以用于高效植物表达载体的构建，提高转基因植物外源基因表达水平。本发明通过构建含该改造的内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。
文档编号A01H5/00GK102747081SQ20121026298
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者朱莉, 潘阳阳, 郎志宏, 黄大昉 申请人:中国农业科学院生物技术研究所