专利名称：在后代中固定农作物杂交种的杂种优势的方法
在后代中固定农作物杂交种的杂种优势的方法
技术领域：
本发明涉及农业领域，特别涉及选择方法。
依靠无性繁殖的方式固定宿根稻杂种优势的方法是已知的(例如，参见F.Hu， P. Xu, J.Li, J. Zhou, E.Sacks, Z.Li, D. Tao, “Rice heterosis fixing by means of vegetative propagation from Oryza longistaminata”//摘要，第四届国际杂交水稻研讨会，2002年，第95页)，该方法包括转移稻的野生亲缘物种中与根形成相关的基因(例如,来自长雄蕊野生稻(orisa Iongistominata),其中这些基因位于第三和第四染色体,分别与基因座CSR16和RMl 19相关联)。
一种固定杂种优势效果的方法是已知的(例如，参见Bennett J. , Xuezhi Bi， Kathiresan, Chaudhury A., Ivahova A. , Payne T., Dennis L.和 Khush G, “Molecular tools for achieving synthetic apomixes for hybrid rice，，//摘要，第四届国际杂交水稻研讨会，2002年，第12页)，其中该方法包括通过转移来自其他物种，包括玉米、高粱和小麦等稻的亲缘物种的单性生殖相关基因使杂交种转变为单性生殖。
已知另一种固定杂种优势效果的方法(例如,参见V. Krishnasamy, 2002),其中该方法包括产生杂交种的人工种子。此处人工种子是指体细胞胚的使用，其中生长调节剂、营养物质和抗生素的混合物作为该胚的胚乳。
上述方法的不足之处在于，为了固定杂种优势效果，它们提倡完整保留初代杂交种的基因复合体，包括在后代有性生殖的情况下导致生殖隔离(segregation)的致死和半致死基因。这些方法的主要目的均在于将杂交种转变为无性繁殖或者单性生殖；此外，上述方法均未被实施。
已知一种在后代中固定杂交种的杂种优势的方法，该方法可被考虑为本发明的原型，其详述于专利2453253，A01K67/00, A01K67/04, 2000年7月27日公开，公告第21期 (第2部分)，该方法包括产生纯合的样本，用完全纯合的样本进行回交(于植物而言，即用花药培养获得的双单倍体进行回交)以除去杂种优势的杂交种基因型中的致死或半致死基因。
该方法的缺点是，归因于双单倍体样本与初代样本(即，其花粉被用于繁育双单倍体植物种群的杂种优势的杂交种植株)之间5-6代回交的复杂性。为了回交，必须要在多个正常生命周期内保持杂交种的生存能力；例如，水稻的生长期是3到5个月，然后植株死亡。为了消除致死和半致死基因并保留带来杂种优势的补偿性基因复合体(CGC)，必须产生双单倍体样本与其花粉被用于繁育双单倍体的杂种优势的杂交种初代植株之间的杂交种。 产生双单倍体的过程需要许多时间，约7个月；初代植株的生长周期已经完成，且植株非常衰弱。双单倍体在衰弱的亲本植株上进行的杂交导致非常低的结种率(seed set)和杂交种子的生存能力，并且这一流程还将重复5-6次。
本发明的目的在于提高保留杂交种中的补偿性基因复合体(CGC)并且从杂种基因型中消除在后代中导致减产的半致死、致死基因以及无效基因这一过程的效率。
技术效果在于，以杂种优势的杂交种为基础，产生具有类似产率的高生产力品种。
当使用该方法时，上述技术效果通过在后代中固定杂交种的杂种优势的方法来实现，该方法包括通过花药培养产生纯合的植株以消除杂种优势的杂交种基因型中的致死和半致死基因，根据本发明，在不同基因型的双单倍体品系之间进行杂交以恢复杂交种的 CGC，其中杂交过程仅涉及最具生产力的双单倍体品系，且双单倍体品系之间的差异根据一系列的形态学、生理学、和生化性质、分子标记物(SSR，SNP等)、遗传体系对样本生产力的贡献等方式，以及所有提到的方式的细合来进行评估。
赋予初代杂交种高生产力的最佳基因和因此不同样本之间双单倍体的交换和产生过程中分布的CGC的恢复，被作为不同双单倍体品系之间(而非与初代杂交株之间)的杂交结果而联合起来。这就使得育种过程避开了(在其多个正常生命周期中)维持初代杂交种的植物生存能力这一长期、非常艰难的过程，并避免了涉及其后代繁殖的问题。
杂交过程中仅使用具有最高生产力的双单倍体品系，这允许了在培养基的培养阶段能淘汰保有或获得致死、半致死和亚致死基因的样本，并因此提供了对初代杂交种基因型更为有效的清理。
不同双单倍体品系的选择能够使携带不同杂种优势基因(CGC)的样本得以展现， 并因此加速了在所产生的基因型中的所述基因的聚集过程。
不同双单倍体品系杂交所获得的不同的高生产力样本之间的杂交，进一步减少了 CGC聚集过程的时间。不同双单倍体品系的两次杂交几乎节省了初代杂种优势杂交种的 CGC聚集所需时间的一半，这使得在育种过程的最初就能生成高生产力的品种。
涉及对专利、科技信息来源的检索，以及包括与本发明近似技术方案相关的数据在内的资源的新发现的现有技术分析可以得出结论未发现具有与本发明技术方案所有必要技术特征相同的技术特征的近似技术方案。在所检索到的近似技术方案中，根据必要技术特征组合，将所述原型鉴定为最近似技术方案允许确定在所要求的方法中的区别技术特征的组合，其是本发明技术方案能产生其所述技术效果的本质所在。
因此，本发明请求保护的技术方案符合“新颖性”的条件。
为了评估请求保护的本发明是否符合“创造性”条件，针对其不同于最接近的现有技术的特征，进一步检索了披露类似特征的已知方法和技术方案。评估结果显示，本领域提术人员按照现有科技和工程水平无法显而易见地获得要求的发明，特别的，更求的发明不提供已知的转换。
因此，依据法律规定，本发明技术方案符合“创造性”的条件。
本发明技术方案的实质如下所示。
根据所要求的方法，从杂种优势的杂交种的花粉获得多个双单倍体品系的种群 (图I)以固定杂种优势。评估这些双单倍体品系的生产能力和生存能力，选择具有最高生产能力的双单倍体品系用于进一步工作。所选的高生产能力双单倍体品系之间的基因型差异根据一系列形态学、生理学、生化性质、分子标记物、遗传体系对样本生产能力的贡献等不同方法，以及所有这些方法之间的组合来进行评估，以展现携带初代CGC的不同基因的品系。不同的双单倍体品系被用于杂交以恢复CGC，因为当繁育双单倍体时，决定杂种优势杂交种高产能力的基因分散于不同的样本中。双单倍体由所获杂交种的花粉通过花药培养产生。双单倍体的生产能力和生存能力均进行评估，最具生产能力的双单倍体品系被选出用于进一步工作，对它们的生产能力也进行评估。这些步骤使得育种最初即能获得高生产力品种。如果最初没能在单一基因型中联合足够数量的CGC基因而使获得的品系未4显示出初代杂交株的产量，即进行下一步通过各种不同双单倍体样品杂交后的品系的杂交。再次由作为结果的杂交种的花粉衍生双单倍体品系。最具生产能力的品系被从中选出和繁殖，对获得的品种的生产能力进行。最好的品种送入新品种国家评测中心(the State Testing of New Varieties)。
图I :在后代中固定杂交种的杂种优势的方法
在花药培养中选择性基因清除的可能性被示范于生物和分子水平。使用第一代和第二代杂交种、13个杂交组合的亲本形式、和通过衍生自第一代杂交种的花粉的花药培养产生的双单倍体品系作为此类研究的材料。用初代杂交种与由其花粉产生的双单倍体回交以在后代中固定杂交优势。繁育双单倍体以消除半致死等位基因，其中任何会降低样本生存能力的无效基因座都在此视为此类等位基因。致死基因向单倍体植株原核的渗透会导致胚胎在发育的某一阶段中死亡，只有基因型中含有最少致死基因和最多有利基因的个体才能存活。当使用花药培养获得植株时，样本的存活率不超过O. 5 %，所以，大部分基因型得以排除。含有最少数目致死基因的基因型具有更高的生存概率，这就能使初代杂交种基因型中的致死和半致死基因得以清除，就此留下一组有利基因。
回交在纯合和杂合杂件中不含有害基因的样本产生其基因型在纯合条件中同样不包含半致死基因的后代。该事实加上大量的基因修饰，不但使杂种优势得以维持，而且在所有回交后代中得以增强。
因此，固定杂种优势的问题可通过获得不含致死和半致死基因的杂交种而得以解决。同时，初代杂交种的主要基因型不仅应当维持，而且要进行提升。从第一代开始，回交后代的高生存能力即是最大的关注点，因为这些后代实质上都是自我繁殖的结果，而通常自我繁殖会严重降低生存力。高生存力可通过以下事实解释，即作为简单的两性繁殖，回交不会导致纯合条件下后代基因型中出现有害基因。同时回交将初代复合体中增强生存能力的部分基因回复到基因型中。获得了水稻13个杂交组合的回交后代。通过将回交植株与初代杂交种、由该初代杂交种花粉培育获得的双单倍体、二代杂交种以及亲本形式进行比较来评估回交植株的生产能力。由于这些品种是多系品种(育种者控制形态型决定基因， 然而，品种维持稳定性的多态性和生理过程的高效性)，相同组合、但获自相同品种不同遗传品系的杂交的第一代杂交种，其在遗传上也是不相同的。实施了两个变化实验。第一个变化实验旨在通过用相同杂交组合的植株杂交产生回交后代，其在获得双单倍体品系之后进行播种。第二个变化实验中，用杂交组合的最佳初代植株杂交获得回交后代，其被选择用于培育双单倍体(在双单倍体培育期间维持其生存能力并生长至开花)。
第一个变化实验表现出生殖隔离，其符合初代品种是多系品种、且回交后代应当仅通过使用作为花粉供体的植物来产生这一事实。第二个变化实验未在回交后代中表现出生殖隔离，因此，在花药培养中清除杂种优势的杂交种基因型中的无效基因是可行的(表 1_2)。
表IFl和F2种群以及初代杂交种花粉培育出的双单倍体与初代杂交种回交产生
权利要求
1.一种在后代中固定农作物杂交种的杂种优势的方法，包括通过使用花药培养产生纯合的样本，继而恢复决定初代杂交种杂种优势的基因复合体，其特征在于，所述基因复合体通过基因型不同的双单倍体品系之间的杂交来恢复，双单倍体品系之间的差异根据一系列的形态学、生理学、生化性质、分子标记物(SSR，SNP等)、遗传体系对样本生产能力的贡献、以及所有提到的这些方法的组合来进行评估。
全文摘要
本发明涉及农业领域，特别涉及选择方法。请求保护的方法能够以杂种优势的杂交种为基础、通过固定杂种优势产生具有相似产量的高生产力品种，例如水稻品种。用于在后代中固定农作物杂交种的杂种优势的方法，其中包括通过使用花药培养产生纯合的样本、继而恢复决定初代杂交种杂种优势的基因复合体，该方法是通过基因型不同的双单倍体品系之间的杂交来实现的，且双单倍体品系之间的差异是根据一系列的形态学、生理学和生化性质、分子标记物(SSR，SNP等)、遗传体系对样本生产能力的贡献、以及所有提到的这些方法的组合来进行评估的。所公开的方法能更有效地清理初代杂交种的基因型，加速杂种优势决定基因(CGC)的聚集，避开(在其多个正常生命周期中)维持初代杂交种的植物生存能力这一长期、非常艰难的过程，并避免了与其后代繁殖相关的问题。该方法减少基本一半的初始杂种优势决定基因复合体聚集所需的时间，并清除降低杂交种生产能力和生存能力的基因。
文档编号A01H1/02GK102972281SQ201210347650
公开日2013年3月20日 申请日期2012年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者Y·K·贡恰罗娃, E·M·哈里托诺夫 申请人:俄罗斯农业科学院全俄水稻研究所国家科学研究院