一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法

专利名称：一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法
技术领域：
本发明涉及食用菌降解利用秸杆资源和食用菌栽培技术领域，具体涉及高效降解秸杆木质素的食用菌菌株的筛选方法。
背景技术：
农作物秸杆含有大量的有机质，氮磷钾和微量元素，是一项重要的生物资源。我国年生产秸杆近6亿吨，但由于其难以被降解利用，1/3的秸杆被露天焚烧。这不仅是对资源的巨大浪费，也造成了严重的环境污染和一系列社会问题。秸杆难以降解的主要原因是细胞壁中木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，这形成了一道天然屏障，限制了消化酶对细胞壁及细胞内容物的分解功能。棉秸杆中的木质素的含量高达25%以上，极大地限制了棉秸杆的降解利用，也是棉秸杆同其他农作物秸杆相比更难以利用的主要原因。因此消除秸杆中的木质素天然屏障，可促进秸杆资源的有效利用。其中筛选 高效的白腐菌降解木质素是重要努力方向之一。筛选高效降解秸杆木质素的白腐菌菌株的方法有多种，但普遍存在操作复杂、准确性差、成本昂贵等缺点，不宜用作大范围菌株的筛选。因此以棉秸杆为培养料，建立一套操作简单、成本低、准确性好的筛选方法体系，筛选高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧耳菌株，对秸杆资源的开发利用具有重要意义。既可为秸杆生物降解提供一条有效途径，同时又可获得经济效益，减少环境污染。

发明内容
本发明的目的是提供一种筛选高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧耳菌株的方法，解决秸杆资源因木质素的存在而难以开发利用的问题。实现发明目的技术方案如下I、整个筛选体系分为初筛和复筛两步，包括以下具体步骤(I)将活化培养后的不同糙皮侧耳菌株接种到经过改良的PDA-Bavendamm平板培养基和经过改良的PDA-RB平板培养基上，在25 °C ± 1°C条件下培养7d进行初步筛选，每日观察变色圈的形成情况并记录显色时间及显色圈直径；(2)将步骤(I)中筛选出的在两种培养基上变色反应强且反应时间快的菌株接种到棉花秸杆固体培养基上，在25°C ±1°C条件下培养30d ；(3)将步骤(2)获得的培养后的基质，采用Van Soest法测定木质素降解率并计算选择性指数，以此为依据筛选出高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧耳菌株。所述的经过改良的PDA-Bavenda_平板培养基为在PDA培养基中加入单独灭菌的鞣酸至终浓度为O. 01g/100ml，再按W/V为O. 1%加入过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉。所述的经过改良的PDA-RB平板培养基为在PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝至终浓度为625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉，棉秸杆干粉的加入量为每IOOmlPDA培养基加入O. Ig ；
所述的棉花稻杆固体培养基为5g过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉稻杆干粉，20mL合成培养液，合成培养液改为低氮无糖高无机盐培养液，配方如下(数值为体积比)酒石酸铵液大量元素液微量元素液VBl液水=15:15:3:16。其中，酒石酸铵(22.0g/L)为氮源，大量元素液每升含 20gKH2P04、13.8gMgS04 · 7H20、1.0gCaCl2和 O. 6gNaCl,微量元素液每升含 O. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20UIOmgCoCl2 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK (SO4) 2 · 12H20、6mgH3B03 和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VB1的质量分数为100mg/L。马铃薯提取液按如下方法制备马铃薯刮去粗皮，去芽眼，准确称取200g，切成碎块放锅中，加水IOOOml加热煮沸，期间不断搅拌；待水沸后再煮20 25min，用双层纱布过滤，所得滤液即马铃薯提取液。
本发明与已有技术相比，其有益效果体现在(I)本发明建立了一整套筛选体系，分为初筛和复筛两个步骤。初步筛选操作简单，方便快速且成本低廉，在大规模筛选高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧耳菌株时，可以节省时间，节约成本并减少相当一部分工作量复筛定量精确，精确性好，本发明将两种筛选方法科学组合，既操作简单，节约成本，又准确可靠，建立了一套更为科学的筛选体系。(2)本发明初筛过程中，通过向普通变色培养基中添加适量的棉秸杆粉末，使筛选更具针对性，保证了筛选结果的准确性。(3)复筛过程中，棉秸杆固体培养基中需另加入低氮无糖高无机盐营养液，因而碳源只能是单一的来自棉秸杆中木质纤维素的降解，保证了复筛结果的精确性。


图I是实施例复筛实验中各菌株木质素降解率比较。图2是复筛实验中各菌株选择性指数比较。以下通过具体实施方式
对本发明技术方案做进一步说明。
具体实施例方式实施例I. I实验材料I. I. I实验菌种实验采用的平菇菌株共12株，其中皖平I号、P928、P3为安徽省农业科学院园艺所提供；农平I号、P17、天达300为安徽农业大学林学与园林学院提供；苏平I号、苏平3号、新平400是江苏省农科院蔬菜研究所提供；北-I、早、黑平A由华中农业大学应用真菌研究所提供。1.1.2 培养基PDA 综合培养基马铃薯提取液 1000ml、葡萄糖 20g、KH2P043. 0g、MgSO4 · H2Ol. 5g、
维生素BI微量、琼脂15. OgoPDA-Bavendamm培养基在PDA培养基中加入单独灭菌的鞣酸至终浓度为
O.01g/100ml，再加入过60目分样筛、粒径小于0. 25mm的棉秸杆干粉，棉秸杆干粉的加入量为每IOOmlPDA培养基加入O. lg。PDA-RB亮蓝培养基在PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝(即雷玛唑亮蓝，英文名为Remazol Brilliant Blue R，化学式为 C22H16N2O11S3)至终浓度为 625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉，棉秸杆干粉的加入量为每IOOmlPDA培养基加入O. Ig0稻杆固体培养基称取5g过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉稻杆干粉于250mL锥形瓶中，加入22mL合成培养液，塞好8层纱布，另用二层报纸覆盖并用细线捆扎好。121-125 高温蒸汽灭菌30min。合成培养液改为低氮无糖高无机盐培养液，配方如下(数值为体积比)合成培养液酒石酸铵液大量元素液微量元素液VB1液水=1 15 15 3 16。其中，酒石酸铵(22. Og/L)为氮源，大量元素液每升含20gKH2P04、13. 8gMgS04 · 7H20、
I.0gCaC12 和 O. 6gNaCl,微量元素液每升含 O. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20、 110mgCoC12 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK(S04)2 · 12H20、6mgH3B03和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VBl 的质量分数为 100mg/L。马铃薯提取液按如下方法制备马铃薯刮去粗皮，去芽眼，准确称取200g，切成碎块放锅中，加水IOOOml加热煮沸，期间不断搅拌；待水沸后再煮20 25min，用双层纱布过滤，所得滤液即马铃薯提取液。栽培培养基实验组采用棉秸杆70%，麦麸26%，石灰3%，蔗糖I % ;对照组为棉籽壳70%，麦麸26%，石灰3%，蔗糖1%。I. 2实验方法I. 2. I菌种的活化培养将待试菌株母种从保藏状态下取出，分别斜面接种于PDA培养基上活化培养。然后将活化了的菌种接种于PDA培养基平板上，250C ±0. 5°C下培养7d后备用。I. 2. 2高效降解木素菌株的初步筛选将普通PDA培养七日龄的菌株平板用打孔器打取经直径为3. 5mmX3. 5mm的菌块分别接种于PDA-Bavendamm培养基平板和PDA-RB培养基平板上，25 °C ±0. 5 °C条件下培养7d，每个菌株做3个重复。每日观察变色圈的形成情况并记录变色时间，以菌落为中心画出两条相互垂直的线，变色圈直径的测量取沿两条线的菌落直径增加的平均值，菌丝密度采用直观比较判断并记录。选择变色快、变色圈大的菌种待下步实验。I. 2. 3木质素降解实验(复筛)将初步筛选出的平菇菌株七日龄PDA平板培养基用打孔器取5. OmmX 5. Omm菌块接种到秸杆附体培养基上，25°C ±0.5°C条件下培养30d。每个菌种设三个重复。I. 2. 4降解率的测定及选择性指数(SF)的计算(采用意大利VELP公司的FIWE6型纤维分析仪)采用Van Soest法测木质素、纤维素和半纤维素含量。降解率=木质素(或纤维素、半纤维素)降解总量/原样品中木质素(或纤维素、半纤维素)总量X 100%选择性指数(SF)=木质素降解率/综纤维素(纤维素+半纤维素)降解率X 100%。I. 2. 5栽培试验
采用瓶栽法，每个菌株按配方，对照组和实验组各装10瓶，封口后，于121°C高压湿热灭菌120min，冷却后以5%的接种量(以湿重计)接入各菌株栽培种，置于25°C恒温培养箱中培养至菌丝满袋后，移入燕房中按常规方法进行培养，米摘2潮子实体后培养结束。I. 2. 5. I子实体产量测定子实体产量采用单瓶产量计算，即依次称量10个重复的单瓶子实体鲜重，记录并计算平均值；I. 2. 5. 2栽培基质中木质纤维素降解率测定测定方法同I. 2. 4降解率的测定2结果与分析 2. I高效降解木素菌株的初步筛选表I各菌株PDA-Bavendamm平板显色结果
权利要求
1.一种筛选高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧菌株的方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)将待筛选菌株母种分别斜面接种于PDA培养基上活化培养，然后将活化了的菌种接种于PDA培养基平板上，25°C ±0. 5°C下培养7d后备用；所述PDA培养基按如下组分配比马铃薯提取液1000ml、葡萄糖20g、ΚΗ2Ρ043· 0g、MgSO4 · H2Ol. 5g、维生素B1O. lg、琼脂15. Og ；(2)将步骤I)培养的七日龄的菌株平板用打孔器打取经直径为3.5mmX3. 5mm的菌块分别接种于PDA-Bavendamm培养基平板和PDA-RB培养基平板上，25 °C ±0. 5 °C条件下培养7d，每日观察变色圈的形成情况并记录变色时间及变色圈直径；所述PDA-Bavenda_培养基是向步骤I)的PDA培养基中加入单独灭菌的鞋酸至终浓度为O. 01g/100ml，再加入过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉，所述棉秸杆干粉的加入量为每IOOmlPDA培养基加入O. Ig ；所述PDA-RB培养基是向步骤I)的PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝至终浓度为625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉，所述棉秸杆干粉的加入量为每IOOmlPDA培养基加入O. Ig ；(3)将步骤(2)中筛选出的在两种培养基上变色反应强且反应时间快的菌株接种到棉秸杆固体培养基上，在25 °C ±1°C条件下培养30d ；所述棉稻杆固体培养基按如下组分配比5g过60目分样筛、粒径小于O. 25mm的棉秸杆干粉，20mL合成培养液，所述合成培养液的按体积比其配方为酒石酸铵液大量元素液微量元素液VB1液水=15:15:3:16 ;其中，酒石酸铵溶液浓度为22. Og/L，大量元素液每升含20gKH2P04、13. 8gMgS04 · 7Η20、1· OgCaCl2和O. 6gNaCl,微量元素液每升含0. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20U IOmgCoCl2 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK (SO4)2 · 12H20、6mgH3B03 和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VB1 的质量分数为 lOOmg/L ；(4)将步骤(3)获得的培养后的基质，采用VanSoest法测定木质素降解率并计算选择性指数，以此为依据筛选出高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧耳菌株。
2.根据权利要求I所述的一种筛选高效降解棉秸杆木质素的糙皮侧菌株的方法，其特征在于，所述马铃薯提取液按如下方法制备马铃薯刮去粗皮，去芽眼，准确称取200g，切成碎块放锅中，加水1000ml加热煮沸，期间不断搅拌；待水沸后再煮20 25min，用双层纱布过滤，所得滤液即马铃薯提取液。
全文摘要
本发明公开了一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法。不同的糙皮侧耳菌株从保藏状态下取出，经活化培养后接种到经过改良的PDA-Bavendamm平板培养基和经过改良的PDA-RB平板培养基上进行初步筛选出变色反应强且反应时间快的菌株，然后其接种到棉花秸秆固体培养基上再进行筛选。依据木质素降解率和选择性指数的大小，复筛出高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株。本发明建立了一套科学的筛选方法体系，初筛操作简便，通过向普通变色培养基中添加适量的棉秸秆粉末，使筛选更具针对性，保证了筛选结果的准确性；棉秸秆固体培养基碳源单一，使得降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株对碳源的选择具有唯一性，保证复筛结果的精确性。
文档编号A01G1/04GK102870598SQ20121037113
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者蔡永萍, 王金宁, 李国庆, 聂凡, 陈静娴 申请人:安徽农业大学